1、ICS 67.200.10X 04. LS中 华 人 民 共 和 国 粮 食 行 业 标 准LS/T XXXXXXXXX粮油检验 苦杏仁苷含量的测定 高效液相色谱法Inspection of grain and oilsDetermination of amygdalin content by high-performance liquid chromatography.（征求意见稿）（本稿完成日期：2018 年 4月）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施国 家 粮 食 和 物 资 储 备 局 发 布LS/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.
2、1-2009 给出的规则起草。本标准由国家粮食和物资储备局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAC/TC 270）归口。本标准起草单位：国家粮食和物资储备局科学研究院等。本标准起草人：朱琳、郭咪咪、薛雅琳等。LS/T XXXXXXXXX1粮油检验 苦杏仁苷含量的测定 高效液相色谱法1 范围本标准规定了苦杏仁苷含量测定的原理、试剂、仪器和设备、试样制备、操作步骤、结果表示及精密度等。本标准适用于植物油料、饼粕及植物油中苦杏仁苷的测定。本标准方法在油料、饼粕和植物油中的检出限分别为40mg/kg、80mg/kg和2mg/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期
3、的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5491 粮食、油料检验 扦样、分样法GB/T 5524 动植物油脂 扦样GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法GB/T 15687 动植物油脂 试样的制备3 原理样品经甲醇提取后，采用高效液相色谱分离，在波长210nm条件下测定苦杏仁苷含量，外标法定量。4 试剂除另有说明外，所用试剂均
4、为分析纯，水应符合GB/T 6682中一级水的规定。4.1 甲醇：色谱纯；4.2 20%甲醇：用量筒量取 20mL甲醇加入 80mL水，混匀；4.3 石油醚：沸程 3060；4.4 苦杏仁苷标准品：纯度98%；4.5 苦杏仁苷储备溶液（500g/mL）：称取 25.0mg（精确至 0.0001g）苦杏仁苷标准品（4.4）置于50mL容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并定容，摇匀，保存于 4，根据每次用量分装备用，有效期 1个月；LS/T XXXXXXXXX24.6 苦杏仁苷标准工作溶液：分别移取 0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL 苦杏仁苷标准储备溶液（4.5）于 10mL
5、容量瓶中，用 20%甲醇（4.2）定容，制备成25g/mL、50g/mL、100g/mL、200g/mL 和 300g/mL 标准工作液；再从 50g/mL 标准工作液中移取 1.0mL于 10mL容量瓶中，用 20%甲醇（4.2）定容，制备成 5g/mL 标准工作液；再从 5g/mL标准工作液移取 2.0mL 于 10mL容量瓶中，用 20%甲醇（4.2）定容，制备成 1g/mL 标准工作液，摇匀，建议现配现用。5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器；5.2 色谱柱：C18 柱（250mm4.6mm，5m）或性能相当者；5.3 粉碎机；5.4 样品筛：20 目
6、筛网，孔径约为 0.9mm。5.5 圆底离心管：带螺盖，50mL；5.6 超声波发生器；5.7 涡旋振荡器；5.8 分析天平：精度 0.0001g；5.9 离心机：转速可达 4000rpm；5.10 离心管：5mL，10mL，15mL；5.11 微孔滤头：孔径 0.22m，附带有机相滤膜；5.12 定性滤纸：直径 12.5cm，中速。6 扦样6.1 油料、饼粕样品扦样、分样按 GB/T 5491执行；6.2 植物油样品扦样按 GB/T 5524执行。7 试样制备7.1 油料及饼粕样品：用粉碎机（5.3）将样品粉碎，使其全部通过 20目样品筛（5.4），混匀，装入洁净容器内作为试样，密封备用；注
7、：为便于粉碎含油量高的样品，在粉碎前可将其先放到-20-10条件下进行冷冻。冷冻后的试样在粉碎过程中及粉碎后应避免吸收水分。7.2 植物油样品：按 GB/T 15687执行。8 操作步骤LS/T XXXXXXXXX38.1 油料样品：准确称取 0.2g0.4g（精确至 0.0001g）粉碎的样品于 50mL离心管（5.5）中，用量筒加入 30mL石油醚(4.3)，盖塞，于超声波发生器（5.6）中超声 10min后，4000rpm 离心 10min，弃去上层石油醚液，将离心管开盖置于通风厨中过夜挥干溶剂后，用移液管准确加入 20mL甲醇（4.1），将离心管置于超声波发生器（5.6）中将底部的样品
8、重悬后，开始计时 30min（期间每隔 10min水平振荡一次）后，取出离心管，上下混匀，静止冷却至室温后，用定性滤纸(5.12)将甲醇提取液滤于另一支离心管（5.5）中，将过滤液混匀，准确吸取 1.0mL滤液于离心管（5.10）中，再准确加入至少1.0mL 20%甲醇（4.2）稀释混匀（如出现乳浊，属正常现象），用微孔滤头（5.11）过滤至澄清后，转移至进样瓶中，待上机分析。注：每次超声时，超声波发生器（5.6）中的液位要高于离心管内液位的高度。8.2 饼粕样品：准确称取 0.1g0.4g（精确至 0.0001g）粉碎的样品于 50mL离心管（5.5）中，用移液管准确加入 20mL甲醇（4.
9、1），盖塞，按 8.1“将离心管置于超声波发生器（5.6）中将底部的样品重悬后，待上机分析” 操作。8.3 植物油样品：准确称取植物油样品 1.0g（精确至 0.0001g）于 10mL离心管中，加入 3mL甲醇（4.1），涡旋 1min后，放入超声波发生器（5.6）中超声 20min（隔 10min上下振荡一次），4000rpm离心 10min后，将上清提取液转移至 5mL容量瓶中，再在样品中加入 1mL甲醇（4.1），猛烈振摇 30s后，放入超声波发生器（5.6）中超声 10min，4000rpm 离心 10min，将上清并入之前的提取液中，再加入 1mL甲醇（4.1），猛烈振摇 30s后
10、，再重复提取一次。将三次甲醇提取液合并于 5mL容量瓶中，并定容至刻线后，混匀，准确吸取提取液 1.0mL于离心管（5.10）中，再准确加入 1.0mL 20%甲醇（4.2）稀释混匀（如出现乳浊，属正常现象），用微孔滤头（5.11）过滤至澄清后，转移至进样瓶中，待上机分析。8.4 色谱参考条件流动相：甲醇+水=20+80；流速：1.0mL/min；柱温：30；检测器：检测波长210nm；进样量：10L。8.5 测定8.5.1 标准曲线将不同浓度的苦杏仁苷标准工作溶液（4.5）注入高效液相色谱仪中进行分析，记录峰面积，以苦杏仁苷峰面积为纵坐标，以苦杏仁苷浓度为横坐标，绘制标准曲线。8.5.2 样
11、品测定将样品待测溶液注入高效液相色谱仪中进行分析，记录峰面积，根据样品测试溶液的峰面积与标准曲线比较，计算出样品测试溶液中苦杏仁苷的浓度。如果样品测试溶液的峰面积超出标准曲线范围，应适当稀释待测溶液，再重新进行测定。8.5.3 空白试验除不加试样外，根据样品类型按8.1、8.2或8.3步骤做空白试验。LS/T XXXXXXXXX49 结果表示对于含量0.1%试样中苦杏仁苷含量（X）以质量分数表示，按式（1）计算:（1）10)-(0mNVC式中：X样品中苦杏仁苷含量，%；C从标准工作曲线得到的待测液中苦杏仁苷的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；C0从标准工作曲线得到的空白液中苦杏仁苷的浓度，单
12、位为微克每毫升（g/mL）；V试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；N滤液（提取液）的稀释倍数；m试样质量，单位为克（g）；计算结果保留小数点后两位。对于含量0.1%试样中苦杏仁苷含量（X）以mg/kg表示，按式（2）计算:（2）10)(NVC式中：X样品中苦杏仁苷含量，mg/kg；C从标准工作曲线得到的待测液中苦杏仁苷的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；C0从标准工作曲线得到的空白液中苦杏仁苷的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；N滤液（提取液）的稀释倍数；m试样质量，单位为克（g）；计算结果保留小数点后一位。10 精密度10.1 重复性在重复条件下
13、获得的两个独立测试结果的绝对差大于重复性限（ r）的情况不超过5%。苦杏仁苷含量的重复性限（ r）参见附录A.1。10.2 再现性在再现性条件下获得的两个独立测试结果的绝对差大于再现性限（ R）的情况不超过5%。苦杏仁苷含量的再现性限（ R）参见附录A.1。LS/T XXXXXXXXX5附 录 A（资料性附录）实验室间测试结果表 A.1给出了多家实验室采用液相色谱法测定苦杏仁苷含量的结果，测试实验由国家粮食局科学研究院组织，测试结果按 GB/T6379.1(ISO5725-1:1994,IDT)和 GB/T6379.2 (ISO5725-2:1994,IDT)进行统计分析，其数据见表 A.1。
14、表 A.1 测试结果统计分析样品 1 2 3 4 5 6 7 8实验室数目 7 7 7 7 7 7 7 7参加统计实验室数目 7 7 7 7 7 7 7 7离群实验室数目 0 0 0 0 0 0 0 0平均值 4.65% 2.76% 0.13% 6.28% 3.38% 检出限 74.8mg/kg 145.4mg/kg重复性标准偏差， Sr 0.12 0.07 0.01 0.10 0.11 / 2.1 5.6 重复性限， r 0.33 0.20 0.02 0.27 0.30 / 5.9 15.6 重复性变异系数/% 2.52 2.61 4.67 1.52 3.17 / 2.8 3.8 再现性标准偏差， SR 0.18 0.09 0.02 0.12 0.33 / 6.0 11.1 再现性限， R 0.49 0.25 0.06 0.32 0.93 / 16.9 31.0 再现性变异系数/% 3.78 3.27 17.21 1.84 9.77 / 8.1 7.6 _
