土壤酶活性测定方法.doc

1、土壤酶活性测定方法土壤脲酶的测定方法（苯酚钠次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取 10g 尿素，用水溶至

2、100ml。3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g 柠檬酸和 147.5g 氢氧化钾（KOH ）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用 1mol/LNaOH 将 PH 调至 6.7，用水稀释定容至 1000ml。4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g 苯酚溶于少量乙醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙醇稀释至 100ml（A 液） ，存于冰箱中； 27gNaOH 溶于 100ml 水（B 液） 。将 A、B 溶液保存在冰箱中。使用前将 A 液、B 液各 20ml 混合，用蒸馏水稀释至 100ml。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为 0.9%，溶液稳定。6）氮的标准

3、溶液： 精确称取 0.4717g 硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml，得到 1ml 含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释 10 倍（吸取 10ml 标准液定容至 100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml） 。三、操作步骤称取 5g 土样于 50ml 三角瓶中，加 1ml 甲苯，振荡均匀，15min 后加 10ml10%尿素溶液和 20ml PH 6.7 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在 37恒温箱培养 24 小时。培养结束后过滤，过滤后取 1ml 滤液加入 50ml 容量瓶中，再加 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min 后显色，定容。1h 内在分光光度计与 5

4、78nm 波长处比色。 （靛酚的蓝色在1h 内保持稳定） 。标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取 0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于 50ml 容量瓶中，然后补加蒸馏水至 20ml。再加入 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min 后显色，定容。1h 内在分光光度计上于 578nm 波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项:1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相

5、同，以检验试剂纯度和基质自身分解。3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样四、结果计算： 以 24 小时后 1g 土壤中 NH3N 的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure ） 。Ure=（a 样品a 无土a 无基质） Vnm式中：a 样品为样品吸光值由标准曲线求得的 NH3N 毫克数；a 无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的 NH3N 毫克数；a 无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的 NH3N 毫克数；V 为显色液体积；n 为分取倍数，浸出液体积吸取滤液体积；m 表示烘干土重土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）一、原理测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷

6、量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适 PH 值：45、67、810。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的 PH 缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的 PH 缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.05.4） 、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0） 、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.08.5） 、和硼酸缓冲液（PH910） 。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、-或者 -萘酚磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。二、试剂1）缓冲液：（1）醋酸盐缓冲液（PH 5.0

7、）0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na 或 27g C2H3O2Na.3H2O 溶至 1L.取 14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至 1L.（2）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.0）0.1mol/L 柠檬酸溶液 19.2g C6H7O8 溶至 1L.0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 53.63g Na2HPO4.7H2O 或 者 71.7g Na2HPO4.12H2O 溶 至1L.取 6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加 43.6ml 0.2mol

8、/L 磷酸氢二钠溶液稀释至 100ml.（3）硼酸盐缓冲液（PH 9.6）0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至 1L.0.2mol/L NaOH 溶液 8g NaOH 溶至 1L.取 50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加 23ml 0.2mol/L NaOH 溶液稀释至 200ml.2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制）3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取 0.125g 氯代二溴对苯醌亚胺，用 10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。4）甲苯5）0.3%硫酸铝溶液6）酚标准溶液酚原液：取 1g 重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至 1L

9、，存于棕色瓶中。酚工作液（0.01mg/ml）：取 10ml 酚原液稀释至 1L。三、操作步骤称 5g 土样置于 200ml 三角瓶中，加 2.5ml 甲苯，轻摇 15min 后，加入 20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液） ，仔细摇匀后放入恒温箱，37下培养 24h。然后在培养液加入 100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取 3ml 滤液于 50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上 660nm 处比色。标准曲线绘制：取 0、1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置

10、于 50ml 容量瓶中，每瓶加入 5ml 硼酸缓冲液和 4 滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度， 30min 后，在分光光度计上 660nm 处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项:1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样四、结果计算 以 24h 后 1g 土壤中释放出的酚的质量（mg ）表示磷酸酶活性。磷酸

11、酶活性=（a 样品a 无土a 无基质）V nm式中：a 样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；a 无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；a 无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；V 为显色液体积；n 为分取倍数，浸出液体积吸取滤液体积；m 表示烘干土重土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖

12、量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）酶促反应试剂：基质 8%蔗糖， pH5.5 磷酸缓冲液：1/15M 磷酸氢二钠（11.876g Na2HPO42H2O 溶于 1L 蒸馏水中）0.5ml 加 1/15M 磷酸二氢钾（ 9.078g KH2PO4 溶于 1L蒸馏水中）9.5ml 即成，甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置 80烘箱内约 12 小时。准确称取 50mg 葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至 50mL 容量瓶 中，定容，摇匀（冰箱中 4保存期约一星期） 。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（ DNS 试剂）

13、称 0.5g 二硝基水杨酸，溶于 20ml 2mol/LNaOH 和 50ml 水中，再加 30g 酒石酸钾钠，用水稀释定容至 100ml（保存期不过 7 天） 。三、操作步骤（ 1） 标 准 曲 线 绘 制分 别 吸 1 mg/mL 的 标 准 葡 糖 糖 溶 液 0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5mL 于 试 管 中 ， 再 补 加 蒸 馏 水至 1mL， 加 DNS 试 剂 3mL 混 匀 ， 于 沸 水 浴 中 准 确 反 应 5min（ 从 试 管 放 入 重 新 沸 腾 时 算 起 ） ，取 出 立 即 泠 水 浴 中 冷 却 至 室 温 ， 以 空 白 管 调

14、零 在 波 长 540nm 处 比 色 ， 以 OD 值 为 纵 坐 标 ， 以葡 萄 糖 浓 度 为 横 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 。（2）土壤蔗糖酶测定称取 5 g 土壤，置于 50mL 三角瓶中，注入 15ml 8%蔗糖溶液， 5ml pH 5.5 磷酸缓冲液和 5 滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在 37下培养 24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液 1ml，注入 50ml 容量瓶中，加 3ml DNS 试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却 3min。溶液因生成 3-氨基-5- 硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至 50ml，并在分光光度计

15、上于 508nm 处进行比色。 （为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。 ）四、结果计算：蔗糖酶活性以 24h，1g 干土生成葡萄糖毫克数表示。蔗糖酶活性=（a 样品a 无土a 无基质）nma 样品、a 无土、a 无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n 为分取倍数；m 表示烘干土重土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分

16、解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的 3-氨基-5- 硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用 50%的乙醇溶至 100ml。3）pH5.5 醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na 或 27.22g C2H3O2Na.3H2O 溶至 1L.取 11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 88ml 0.2mol/L

17、 醋酸钠溶液混匀即成 PH 5.5 醋酸盐缓冲液.4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称 1.25g 二硝基水杨酸，溶于 50ml 2mol/LNaOH 和 125ml 水中，再加 75g 酒石酸钾钠，用水稀释至 250ml（保存期不过 7 天） ，5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置 80烘箱内约 12 小时。准确称取 50mg 葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至 50mL 容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中 4保存期约一星期） 。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸 1mg/mL 的标准葡糖糖溶液 0、 0.1、0.2、0.4、0

18、.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至 1mL，加 DNS 溶液 3ml 混匀，于沸腾水浴中加热 5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长 540nm 处比色，以 OD 值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。称 10g 土壤置于 50ml 三角瓶中，加入 1.5ml 甲苯，摇匀后放置 15min，再加 5ml 1%羧甲基纤维素溶液和 5ml pH5.5 醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在 37恒温箱中培养 72h。培养结束后，过滤并取 1ml 滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。 （为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对

19、照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。 ） 四、结果计算纤维素酶活性以 72h，1g 干土生成葡萄糖毫克数表示。纤维素酶活性=（a 样品a 无土a 无基质）nma 样品、a 无土、a 无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n 为分取倍数；m 表示烘干土重过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）一、原理过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H 2O2 H2O+O2） ，从而降低了过氧化氢的毒害作用

20、。土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法：根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性；滴定法：用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。本实验重点采用高锰酸钾滴定法。二、试剂2mol/L H2SO4 溶液 :量取 5.43ml 的浓硫酸稀释至 500ml，置于冰箱贮存 ;0.02mol/L 高锰酸钾溶液：称取 1.7g 高锰酸钾，加入

21、400mL 水中，缓缓煮沸 15min，冷却后定容至 500mL，避光保存，用时用 0.1mol/L 草酸溶液标定；0.1mol/L 草酸溶液：称取优级纯 H2C2O42H2O 3.334g,用蒸馏水溶解后，定容至250ml；3%的 H2O2 水溶液 ：取 30% H2O2 溶液 25ml,定容至 250ml，置于冰箱贮存，用时用0.1mol/L KmnO4 溶液标定。三、操作步骤分别取 5g 土壤样品于具塞三角瓶中（用不加土样的作空白对照） ，加入 0.5mL 甲苯，摇匀，于 4冰箱中放置 30min。取出，立刻加入 25mL 冰箱贮存的 3% H2O2 水溶液，充分混匀后，再置于冰箱中放置

22、 1h。取出，迅速加入冰箱贮存的 2mol/L H2SO4 溶液 25mL，摇匀，过滤。取 1mL 滤液于三角瓶，加入 5mL 蒸馏水和 5mL 2mol/L H2SO4 溶液，用 0.02mol/L 高锰酸钾溶液滴定。根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的 H2O2 的量所消耗的 KmnO4。过氧化氢酶活性以每 g 干土 1h 内消耗的 0.1mol/L KmnO4 体积数表示（以mL 计）表示。四、结果计算（如下面处理）：KMnO4 标定：10mL 0.1mol/L H2C2O4 用 KMnO4 滴定，所消耗 KMnO4 体积数为19.49mL，由此计算出 KMnO4 标准溶液浓度为 0

23、.0205mol/L。H2O2 标定： 1ml 3% H2O2 用 KMnO4 滴定，所消耗 KMnO4 体积数为 16.51ml,由此计算出 H2O2 浓度为 0.8461mol/L。酶活性=（空白样剩余过氧化氢滴定体积- 土样剩余过氧化氢滴定体积）*T/土样质量其中：酶活性单位- ml(0.1mol/L KMnO4)/(hg)；T-高锰酸钾滴定度的矫正值 T=0.0205/0.02=1.026。五、注意事项1、用 0.1mol/L 草酸溶液标定高锰酸钾溶液时，要先取一定量的草酸溶液加入一定量硫酸中并于 70水浴加热，开始滴定时快滴，快到终点时再进行水浴加热，后慢滴，待溶液呈微红色且半分钟内不退色即为终点。2、高猛酸钾滴定过程对酸性环境的要求很严格。经探究后发现直接取 1mL 滤液滴定不仅液体量太少，终点不好把握，硫酸的量也不足，因此我组对实验方法进行了改进，即取1mL 滤液于三角瓶，加入 5mL 蒸馏水和 5mL 2mol/L H2SO4 溶液，再用高锰酸钾溶液滴定，这样滴定过程极为方便。