1、目 录1 筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株及苦参碱的初步干预作用11.1 中文摘要11.2 英文摘要31.3 前言61.41.51.6材料与方法8结果22讨论341.7 结论391.8 参考文献401.9 英汉缩略词对照表432 致谢443 诱导肿瘤细胞凋亡的天然药物研究进展(综述)451筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株及苦参碱的初步干预作用摘 要目的：原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是血管富集性的肿瘤，其生长及转移和血管生成密切相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor
2、，VEGF)是体内一种强有力的促血管生成因子，通过与 VEGF 受体（VEGFR）结合，引起一系列信号传导，释放各种生长因子和细胞因子，促进内皮细胞的增殖与迁移，直接或间接参与血管生成，在肝癌的发生、发展及愈后中具有极其重要的地位。本研究通过筛选VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株，观察苦参碱等中药有效成分的初步干预作用，旨在构建靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的细胞筛选体系，筛选靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的药物，为中药现代化及肝癌的药物治疗提供一个新的思路。方法：（1）筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株：体外培养人肝癌细胞
3、株 Bel-7402、HepG2 和 SMMC-7721，然后采用免疫细胞化学法检测该三种细胞的 VEGF 及其受体 Flt-1、KDR 的表达情况，酶联免疫吸附试验法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测细胞培养上清液中VEGF 的浓度，逆转录聚合酶链式反应（ RT-PCR：Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）技术检测细胞中 VEGF mRNA 的表达；（2）苦参碱等中药有效成分的初步干预作用：用小檗碱、槲皮素和苦参碱分别干预经过上述实验筛选出 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细
4、胞株 Bel-7402 48h，采用 CCK-8 试剂盒 (cell counting kit-8)方法检测细胞的增殖，计算半抑制浓度（IC 50） 。苦参碱干预 48h 后，采用 RT-PCR 方法检测 Bel-7402 VEGF mRNA 的表达。 结果：（1）筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株：免疫组化可检测 HepG2 和 Bel-7402 细胞均具有 VEGF、Flt-21 和 KDR 的表达，而 SMMC-7721 细胞则只具有 VEGF 和 Flt-1 受体的表达，而无 KDR 受体的表达。 ELISA 检测 Bel-7402、HepG2 及 SMMC-7721
5、细胞 VEGF 的表达量分别为 811.4780.97、744.9056.36 和484.5470.69 ng/3105 个细胞，VEGF 表达 Bel-7402 强于 HepG2 和SMMC-7721 细胞(F=24.317 ，P=0.000)。RT-PCR 检测 Bel-7402、HepG2及 SMMC-7721 细胞均有 VEGF mRNA 表达，相对表达量分别为0.9700.006、0.9150.010、0.7630.006，Bel-7402 的 VEGF mRNA 表达高于 HepG2 和 SMMC-7721 (F=636.167， P=0.000)。据此，本研究选定VEGF 和 V
6、EGFR 均高表达的肝癌细胞株 Bel-7402 作为实验用细胞。 （2）苦参碱等中药有效成分的初步干预作用：槲皮素、苦参碱和小檗碱对 Bel-7402 细胞均能起到抑制作用，且有随着药物浓度的增高抑制作用增强，通过 CurveExpert 1.3 软件计算，小檗碱、苦参碱和槲皮素的 IC50 分别为：221.12 g/mL、1186.58 g/mL 和 78.38 g/mL。RT-PCR 方法检测结果表明，苦参碱作用于 Bel-7402 细胞 48h 后，VEGF mRNA 的表达量明显减少，且呈现较好的浓度依赖关系，与阴性对照比较，F=1229.64，P=0.000。结论：通过免疫组化、E
7、LISA 及 RT-PCR 对人肝癌细胞株 HepG2、SMMC-7721 和 Bel-7402 的筛选，Bel-7402 中 VEGF 和VEGFR 均高度表达，可作为靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的细胞筛选体系。苦参碱可明显抑制 Bel-7402 细胞的增殖，减少VEGF mRNA 的表达，初步提示苦参碱可能具有靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌细胞增殖和血管生成的作用，但苦参碱是否还作用于 VEGF的受体 Flt-1 和 KDR，尚需进一步研究证实。关键词：VEGF；VEGFR；肝癌；RT-PCR；苦参碱3Screening Hepatocarcinoma
8、 Cell Line with High Expression of VEGF and VEGFR and the Preliminary Intervention of MatrineAbstract Objective: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the enrichment of blood vessels of cancer, its growth and transfer are closely related with angiogenesis. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a
9、powerful factor to promote angiogenic, through combination with VEGF receptor (VEGFR), cause a series of signal transmission, release growth factors and cytokines, and promote endothelial cell proliferation and migration, directly or indirectly effect on angiogenesis, it plays an important role on o
10、ccurrence and development of hepatocarcinoma. This study through screening hepatocarcinoma cell line with high expression of VEGF and VEGFR, and observing preliminary intervention effect of matrine and some other effective ingredients of traditional Chinese medicine on the cell line, which is aimed
11、at establishing the screening system targeted VEGF/VEGFR signaling pathways to inhibit angiogenesis of hepatocarcinoma, which is used to screen the drugs targeted VEGF /VEGFR signaling pathways to inhibit angiogenesis of hepatocarcinoma, and providing a new train of thought for the modernization of
12、traditional Chinese medicine and drug treatments for hepatocarcinoma. Methods: (1) Screening hepatocarcinoma cell line with high expression of VEGF and VEGFR: Culture human hepatocarcinoma cell lines Bel-7402, HepG2 and SMMC-7721 in vitro, then the expression of VEGF and its receptor Flt-1, KDR were
13、 detected by Immunohistochemistry detection. Using the ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) method to detect the expression of VEGF in the cell supernatant, and taking the method of Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) technology to detect the expression of VEGF mRNA; (
14、2) The preliminary intervention effect of matrine and other traditional Chinese medicine: Berberine, quercetin and matrine, the traditional Chinese medicine, intervened Bel-7402 cell line 48 hours, which existed high expression of VEGF 4and VEGFR screened form above experiment. The proliferation of
15、Bel-7402 cell was detected by CCK-8 kit (cell counting kit-8) method, then calculating the half inhibition concentration (IC50). After 48 hours intervened with matrine, the expression of Bel-7402 VEGF mRNA was tested by RT-PCR. Results:(1) Screening hepatocarcinoma cell line with high expression of
16、VEGF and VEGFR: Immunohistochemical detection showed that the HepG2 and Bel-7402 cells had VEGF, Flt-1 and KDR expression, but SMMC-7721 cells only had VEGF and Flt-1 expression, with no KDR expression. ELISA test suggested that the expression of VEGF in the cell supernatant from Bel-7402, HepG2 and
17、 SMMC-7721 were 811.4780.97, 744.9056.36 and 484.5470.69 ng/3105cells, respectively. Expression of VEGF in Bel-7402 cell exceeded HepG2 and SMMC-7721 cell(F=24.317, P=0.000). RT-PCR detection showed that Bel-7402、HepG2 and SMMC-7721 cell existed expression of VEGF mRNA, relative expression volume we
18、re 0.9700.006, 0.9150.010 and 0.7630.006，respectively. Expression of VEGF mRNA in Bel-7402 cell was beyond HepG2 and SMMC-7721 cell (F=636.167, P=0.000).Therefore, this study selected Bel-7402 with high expression of VEGF and VEGFR as experimental use cells. (2) The preliminary intervention effect o
19、f matrine and other traditional Chinese medicine: Quercetin, matrine and berberine could significantly inhibit proliferation of Bel-7402 cells, It showed a favorable dose-effect relationship because Inhibitory activity strengthened with the increase of concentration. Calculating by the CurveExpert 1
20、.3 software, IC50 of berberine, matrine and quercetin were 221.12 g/mL, 1186.58 g/mL and 78.38 g/mL,respectively. RT-PCR testing results showed that 48 hours after Bel-7402 intervened by matrine, the expression of VEGF mRNA significantly decreased in a good concentration dependence relationship. Com
21、pared with control, F=1229.64, P=0.000. Conclusion: screening from human hepatocarcinoma cell line Bel-7402, HepG2 and SMMC-7721 cell by immunohistochemical, ELISA and RT-PCR, Bel-7402 cell existed highly 5expression of VEGF and VEGFR, which can be used to cells screening system targeted VEGF/VEGFR
22、signaling pathways to inhibit angiogenesis of hepatocarcinoma. Matrine can inhibited Bel-7402 cell proliferation, significantly decreased VEGF mRNA expressions, it was suggested that matrine may have targeted VEGF/VEGFR signaling pathways to inhibit proliferation and angiogenesis of hepatocarcinoma.
23、 However, Matrine wether or not has effect on Flt-1 and KDR, the receptor of VEGF, which needs to be further research.Key Words: VEGF；VEGFR；Hepatocarcinoma；RT-PCR；Matrine6前 言自 1971 年 Folkman 首次建立了血管生成与肿瘤生长之间的联系以来，人们认识到恶性肿瘤的增殖、浸润和转移与肿瘤诱导的血管生成(angiogenesis)密切相关 1。新生血管为肿瘤细胞提供充分的氧气和营养，原发瘤和转移瘤生长到 0.20.3
24、cm 时，如果没有新生血管供应营养，肿瘤将停止生长并死亡。因此，以肿瘤血管内皮细胞为靶点抑制肿瘤血管生成阻断肿瘤血液供应已成为当前抗肿瘤生长和转移的研究热点之一。原发性肝癌是我国和一些亚非地区常见癌症，是我国最常见的恶性肿瘤之一。原发性肝癌 90%以上为肝细胞肝癌 (hepatocellular carcinoma， HCC)，它是血管富集性的肿瘤，其生长及转移和血管生成密切相关。HCC 合并失代偿性肝硬化、易发生肝内血管侵犯导致肝内播散和切除后复发或再发率高是影响现有各种治疗手段对肝癌疗效的主要因素。现有的各种临床治疗手段都不足以从根本上解决上述三个问题，肝癌治疗方面的突破有赖于对肝癌生物学
25、特性的进一步研究。肝癌具有多血管、恶性程度高、生长速度快、转移范围广和复发率高等特点 2。建立在对肝癌细胞生物学特性不断阐明基础之上的抗血管生成治疗有可能在肝癌的治疗上取得突破进展。血管生成是肿瘤得以继续生长的基础，它是一个多步骤的复杂过程，需要大量促进血管生成因子和抑制血管生成因子参与调控，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)是起核心作用的血管形成正调节因子。VEGF 是一种高度糖基化的碱性蛋白，具有促进内皮细胞增殖，增加微血管通透性、诱导血管生成等功能的生物学效应,由VEGFR-1(Flt-1)及 VEGFR-2(KDR)
26、介导，其大部分表达于血管内皮 3。肿瘤组织中的 VEGF 通常在缺氧、致癌基因、和其他细胞因子的刺激下过度表达，而且在多种肿瘤中与愈后不良密切相关。许多研究表明 VEGF7在许多肿瘤组织中均有较高水平的表达，它不但促进肿瘤的血管生成，也促进了肿瘤的侵袭和转移，与多种肿瘤的发生发展、转移和愈后密切相关。研究发现，VEGF 可维持肿瘤过度生长的血供需求，可通过上调血管内皮VEGFR 水平使血管生成正反馈加强；许多肿瘤可同时表达 VEGFR 使VEGF 作为旁分泌因子促进自身恶性增殖；VEGF 介导的树突细胞分化抑制还可减少其免疫监视性滤过作用。此外，VEGF 使血管通透性增高，致肿瘤区组织间压升高
27、，以及血管异常增生迂曲形成盲端，均使化疗药物不易送达肿瘤内部发挥效应，肿瘤细胞却易于进入血循环向远处转移播散。因此 VEGF 在肝癌发生、发展过程中占有十分重要的地位 4,5。VEGF/VEGFR 信号转导通路在肿瘤周围血管生成起主要作用，目前上市的抗血管生成药物大多数都是以 VEGF/VEGFR 信号转导通路中的关键分子作为药靶而设计的，例如贝伐单抗 6、兰尼单抗、索拉非尼和舒尼替尼等。近年来，随着对肿瘤血管生成机制研究的不断深入，抗血管生成药物也得以快速研发，其中对天然药物及其组分的研究占有相当大的比例，中药由此成为研究的重点和热点。研究发现小檗碱 7可抑制 HUVEC 的增殖，诱导其凋亡
28、，阻止新生血管形成。槲皮素(Ouercetin) 8能够显著地抑制肿瘤生长，并且可呈剂量依赖性地抑制 VEGF 和 bFGF 诱导的鸡胚尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM ）血管增生。苦参碱可不同程度地抑制肿瘤血管生成，降低肿瘤组织微血管密度(microvessel density, MVD)，其作用机制在于抑制瘤体内 VEGF 和 bFGF 的表达。本研究通过筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株，观察苦参碱等中药有效成分的初步干预作用，旨在构建靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的细胞筛选体系，为中药现代化及肝癌的药物治
29、疗提供一个新的思路。8材料与方法1 实验材料与仪器1.1 主要实验材料：1.1.1 细胞株：人肝癌细胞株 HepG2、SMMC-7721 和 Bel-7402 及人脐静脉细胞 ECV304，购自中科院上海药物研究所，用含 10%胎牛血清的RPMI1640 培养液于 5%CO2、37的培养箱内培养，每 23 天更换培养液，待细胞单层生长铺满瓶底约 80%时，用 0.25%的胰酶消化传代。1.1.2 实验药品：（1）98%槲皮素：陕西浩洋公司，生产批号：20100102（2）98%苦参碱：陕西浩洋公司，生产批号：20100201（3）97%小檗碱：陕西浩洋公司，生产批号：20100214（4）顺铂
30、注射液：10 mg/mL, 盏花药业有限公司，生产批号：200906051.2 主要实验试剂1.2.1 细胞培养主要试剂（1）RPMI1640 培养基： GIBCO 公司（2）胰蛋白酶：美国 Sigma 公司（3）胎牛血清：天津灏洋生物制品科技有限公司（4）酒精：重庆北碚化学试剂厂（6）二甲基亚砜：Sigma 公司1.2.2 免疫组织化学染色与 ELISA 试剂（1）Human VEGF ELISA 试剂盒：武汉华美生物工程有限公司 （2）PV 法兔二抗试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司（3）兔抗人 VEGF 多克隆抗体：武汉博士德生物工程公司（4）KDR 一抗：武汉博士德生物工程公司（5）
31、Flt-1 一抗：武汉博士德生物工程公司9（6）Triton X-100：罗氏试剂 （7）中性树胶：金华惠友仪器设备有限公司 （8）丙酮、苏木精染液和二甲苯由泸州医学院附属医院病理科实验室提供。1.2.3 RT-PCR 主要试剂（1）总 RNA 提取试剂盒： TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.（2）Proteinase K：碧云天生物技术研究所（3）6X 上样缓冲液：碧云天生物技术研究所（4）TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0：宝生物工程（大连）有限公司（5）RIPA 裂解液（强）：碧云天生物技术研究所（6）琼脂糖：西班牙 （7）DNA Ma
32、rker ：TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.（8）EB 染液：上海博蕴生物科技有限公司 （9）DEPC 水：美国 Sigma （10）盐酸：成都金山化学试剂有限公司 1.3 主要实验仪器（1）LDZX-50KB 立式电热压力蒸汽消毒器，上海申安医疗器械厂（2）SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司（3）CKX41-OLYMPUS 倒置显微镜，SANYO.Electric.Co.,Ltd（4）MOC-15AC CO2 INCUBATOP ，SANYO.Electric.Co.,Ltd（5）10L、20L、100L、1000L 移液器，德国
33、 Eppendorf （6）GZX-GF-MBS-1 电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂（7）Sigma3K18 台式高速低温冷冻离心机，Thermoblock TM 公司（8）ChampChemi 系列化学发光、荧光凝胶成像系统，北京赛智（9）优普超纯水制造系统，成都优普水处理工程有限公司（10）BCD-261 BOSCH 冰箱，德国博世10（11）MDF-192 超低温冰箱，日本 Sanyo 公司 （12）电泳仪、电泳槽，美国 Bio-Rad （13）微孔板检测系统 Sepctra Max M3，美国 Molecular Devices（14）ECHNE TC-412PCR 仪，英国
34、TECHNE （15）ND-1000 微量紫外可见分光光度计美国，Nanodrop 公司 2 实验方法2.1 细胞培养、传代、冻存及复苏2.1.1 细胞复苏常规消毒超净台，紫外线照射超净台 20 min。取出装有细胞的冻存管，迅速放入 37水浴，轻轻摇动冻存管使细胞悬液融化，于超净台内将细胞悬液移至 10 mL 的离心管内，用完全培养液稀释至原体积的 4 倍，1000 rpm 离心 5 min，弃上清，加新鲜培养液，轻轻吹打使沉于离心管底部的细胞变为混悬状态，后将细胞悬液转移至培养瓶内，保持较高的细胞密度，于 5% CO2、37的培养箱内培养。2.1.2 细胞培养人肝癌细胞株 HepG2、SM
35、MC-7721 和 Bel-7402 细胞 ECV304，购自中科院上海细胞所，用含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液于 5% CO2、 37的培养箱内培养，每天观察细胞生长情况，当细胞铺满瓶底或液体变黄，则传代、更换培养液。2.1.3 细胞传代待细胞单层生长铺满瓶底约 80%时，倒出原培养基，添加约 2.0 mL的 0.25%胰蛋白酶铺满培养瓶底部，并轻微摇晃培养瓶使消化液和细胞充分接触，在倒置显微镜下观察细胞回缩变圆，接近游离状态但未脱离瓶壁时，将培养瓶内的消化液轻轻倒入废液缸，再往培养瓶内添加约 2mL 左右的含血清的 RPMI1640 培养基以终止胰蛋白酶的消化作用，然后用吸
36、管轻轻吹洗细胞生长面，镜下观察细胞完全脱离瓶底壁，将培养瓶内的细胞11悬液吸入 10 mL 的离心管内，于 1000 rpm 离心 5 min，弃上清后加入完全培养液调整细胞密度，分装到 23 个新的培养瓶内于 5% CO2、37的培养箱内培养。2.1.4 细胞冻存冻存液配置：完全培养液 : 胎牛血清 : DMSO = 7 : 2 : 1。选择对数生长期的细胞，消化离心后将细胞密度调至约 1106 /mL 左右，按 1 mL/管分装到 1.5 mL 的冻存管内，用脱脂棉包裹后放入 4 冰箱 1 h 后再转入-20冰箱约 2 h，后放入 -80冰箱过夜，次日放入液氮罐内存储。2.2 二步法免疫组
37、化法检测 VEGF、Flt-1 及 KDR 蛋白的表达2.2.1 实验试剂的配制：0.02 M PBS 缓冲液的配制NaCl：8.5 g；Na 2HPO4：2.8 g；NaH 2PO4：0.4 g。后用蒸馏水定容至1000 mL，现用现配。2.2.2 细胞爬片（1）Bel-7402 、HepG 2 及 SMMC-7721 细胞于 5% CO2、37的培养箱内培养，待细胞生长铺满瓶底约 80%面积时，用 0.25%胰蛋白酶消化，制备密度为 5104/mL 单细胞悬液；（2）切角、消毒理好载玻片置于 12 孔板内（此前先用适量的培养基铺底） ，将各细胞 1.5 mL 的单细胞悬液接种于 12 孔板
38、载玻片上，于 5% CO2、 37的培养箱内继续培养；（3）24 h 后，细胞大约生长铺满瓶底的 80%左右，用 0.01 mol/L 其pH 约为 7.4 的 PBS 缓冲液冲洗 5 min3 次，冷丙酮（ -20放置）于 4下固定约 15 min，取出玻片， -20保存备用。免疫细胞化学分析 Bel-7402、HepG 2 及 SMMC-7721 细胞株中 VEGF、Flt-1 及 KDR 蛋白的表达。2.2.3 免疫细胞化学12（1）细胞爬片于 12 孔板内用 0.01 mol/L pH 7.4 的 PBS 缓冲液冲洗5min3 次；（2）每孔内加入 100 L 预冷的 Triton-1
39、00 于 4冰箱内 3 min；（3）用 3% H2O2 去离子水温室孵育 10 min，阻断内源性过氧化物酶；（4）PBS 缓冲液冲洗 5 min3 次；（5）滴加一抗（兔抗人 VEGF 按 1:100 稀释，Flt-1 和 KDR 按 1:50 稀释） ，冰箱内 4 过夜（设滴加 PBS 为阴性对照） ；（6）PBS 缓冲液冲洗 5 min3 次；滴加生物素化山羊抗兔 IgG 抗体，37孵育 30 min；（7）PBS 缓冲液冲洗 2 min3 次；滴加 DAB，铺匀，显色 520min，镜下控制；（8）自来水冲洗，终止显色反应；（9）将细胞爬片于 1%的盐酸酒精快速过一次，在 45水中返
40、蓝，后用自来水冲洗；（10）在梯度酒精 75%、90%和 100%内各洗 5 min2 次，晾干；（11）于二甲苯内浸泡 1 min 透明，后晾干；（12）在准备好的载玻片上滴加一滴中性树胶，盖玻片翻转后封片；（13）显微镜下观察并拍照。2.3 ELISA 测细胞培养上清液 VEGF 蛋白表达量2.3.1 细胞培养选取处于对数生长期的肝癌细胞 Bel-7402、HepG 2 和 SMMC-7721，对其进行消化、离心，然后用含 10%标准胎牛血清的 RPMI1640 培养基调整到细胞密度 3105/mL，用加样枪吸取 6.0 mL 细胞悬液分别移入培养瓶内，于 37、5%CO 2 培养箱内培养
41、。2.3.2 制备上清液经过 48 h 培养后，倒出三瓶培养瓶内的所有上清液于离心管内，41310000 rpm 离心 10 min,后再取上清液各 1.5 mL 于 EP 管中备用。2.3.3 VEGF 含量测定（1）从 ELISA 试剂盒内的 48 孔板内取出 18 个加样孔，标准孔内分别添加 50L 的标准品，浓度从 1 号到 5 号分别为：50、100、200、400、800 ng/L。空白孔不加任何试剂，剩下的酶标孔分别添加 40 L 的样本稀释液，再添加 10 L 的各对应细胞的上清液，轻轻摇晃均匀，用封板膜封板，于 37温育 30 min；（2）弃去液体，甩干，每孔加满 30 倍
42、稀释后洗涤液，振摇 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复 5 次；（3）除去空白孔外，每孔加入 50 L 酶标试剂。轻轻晃动均匀，用封板膜封板，于 37温育 30 min；（4）弃去液体，甩干，每孔加满 30 倍稀释后洗涤液，振摇 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复 5 次；（5）每孔先加入显色剂 A 50 L，再加入显色剂 B50 L，轻轻振荡摇匀，用封板膜封板，37避光显色 10 min；（6）取出酶标板，每孔加终止液 50 L，终止反应；（7）测定：15 min 以内，以空白孔调零，在 450 nm 波长下测量各孔的吸光度值（OD 值） 。2.4 RT-PCR 分析 Bel-7
43、402、HepG 2 及 SMMC-7721 细胞的 VEGF mRNA的表达2.4.1 实验试剂的配制 （1）DEPC 水：于通风橱内吸取 1 mL 的 DEPC 水放在 1000 mL 的双蒸水中配成 1的 DEPC 水，过夜备用。（2）50TAE buffer 的配制：称量 Tris 242 g，Na 2EDTA2H2O 37.2 g 于 1 L 烧杯内；向 1 L 容量瓶14内加入约 800 mL 去离子水，充分搅拌溶解；加入 57.1 mL 的冰醋酸，充分溶解；加去离子水定容至 1 L。（3）1TAE buffer 的配制：取 20 mL 50TAE Buffer 于 1 L 量筒内
44、，加入去离子水定容至 1 L，摇匀。（4）2%的琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖(agarose) 2.0 g 放于 200 mL 的烧杯，加入 100 mL 的1TAE buffer 试液，微波炉内加热至融化，在室内冷却至 60时，加入2.5 L 的 20 mg/mL 的 EB 染液，轻轻摇晃混匀，然后倒胶，半小时后拔下琼脂糖凝胶上的梳子，现做现用。2.4.2 细胞培养Bel-7402、 HepG2 及 SMMC-7721 用含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基培养，0.25%胰蛋白酶消化，常规传代培养，于 37、5%CO 2 培养箱内孵育。取对数生长期的各细胞进行总 RNA 的提取。
45、2.4.3 总 RNA 的提取（1）细胞裂解：弃去培养瓶内的液体，用预冷的 PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次1.2 mL，尽量吸尽液体，然后直接在培养板内以 10 cm2 面积加 1 mL的裂解液 RZ 裂解细胞，用移液器吹打 30 次。将加入 RZ 裂解液的培养瓶在室温放置 5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。后将培养瓶内的液体吸入 1.5 mL 的 EP 管内。（2）RNA 粗提取：将 EP 管于 4 12000 rpm 离心 5 min，取上清于另一个 RNase-free1.5 mL 的 EP 管内，此时误触及中间层。于此离心管内加入 200 L 氯仿，盖好管盖，震荡 15 s 室
46、温放置 3 min。再于 412000 rpm 离心 10 min，样品会出现三层：黄色的15有机层、中间层与无色的水相，RNA 存在于水相内，体积约为裂解液 RZ 的 50%，把水相移至另外一 RNase-free1.5 mL 的 EP 管内。缓慢加入约 0.5 倍体积的无水乙醇，混匀，后将其转入吸附柱CR3 内再接入 2 mL 的收集管内，412000 rpm 离心 30 s，弃去收集管内的废液。（3）RNA 的漂洗：向吸附柱 CR3 中加入 500 L 去蛋白液 RD，后于 412000 rpm 离心 30 s，弃去废液。向吸附柱 CR3 中加入 700 L 漂洗液 RW，温室静置 2
47、min，后于 412000 rpm 离心 30 s，弃去废液。向吸附柱 CR3 中加入 500L 漂洗液 RW，温室静置 2 min，后于 412000 rpm 离心 30 s，弃去废液。（4）RNA 的收集：将吸附柱放入 2 mL 的收集管内，412000 rpm 离心 2 min，去除残留的漂洗液 RW，再于超净台上通风 1 min，予以充分晾干。将吸附柱 CR3 转入一个新的收集管内，加入 80 L 的 RNase-free ddH2O，室温放置 2 min，后于 412000 rpm 离心 2 min。收集的RNA 于-70 保存，以防止降解。2.4.4 RNA 浓度的测定运用 ND-
48、1000 微量紫外可见分光光度计测所提取的 RNA 浓度。2.4.5 反转录（1）混合以下试剂，作为反转录体系，冰浴保存：16MgCl2 4.0 L10RT Buffer 2.0 LRNase Free dH2O （9.5-x）LdNTP Mixture 2.0 LRNase Inhibitor 0.5 LAMV Reverse Transcriptase 1.0 LRandom 9 mers 1.0 L提取总的 RNA x LTotal 10 L/Sample 注：x 根据各细胞的 RNA 浓度自行调整，最终使得每个细胞的总 RNA 量是一致的。（2）在超净台内将上述试剂混匀后，于 PCR 仪内进行反转录过程，反转录的循环设置有（一个循环）：30 10 min50 30 min99 5 min5 5 min（3）反应结束后，将所得的 cDNA 分装后于 -20保存。2.4.6 PCR（1）引物（primers ）的合成：通过 Primer Premier 合成 VEGF 基因（CCDS55011.1）的上下游引物VEGF：上游引物（sense primer ）：5-C
