1、摘 要I硕士学位论文一种荧光手术导航目镜系统的设计与应用研究摘 要在过去的几年里，近红外（NIR）荧光成像技术得到了迅速的发展，并在各个临床的试验中得到了广泛的应用。然而目前临床上应用的成像系统体积庞大，难以被用于正如头颈部肿瘤的手术切除中，因为外科手术医生很难利用这样的系统对深腔内的肿瘤区域进行成像以获取肿瘤图像信息。为了克服目前成像系统的局限性，我们设计了这样一套便携式荧光导航目镜系统用于手术过程中肿瘤边界的评估。该系统由计算机，头盔显示器（HMD ） ，近红外 CCD 相机，微型 CMOS 相机和 780nm 的激光光源组成。CCD 相机与 CMOS 相机分别用于获取荧光图像与背景图像，
2、通过配准把融合的图像实时地显示到头盔显示器上。为了验证系统的可行性，我们在离体的组织上进行了模拟实验。实验结果很好地证明了手术导航目镜系统对于手术的引导与边界检测的有效性。关键词：荧光成像 肿瘤边界 导航目镜系统Abstract2ABSTRACTOver the last few years, near-infrared (NIR) fluorescence imaging has witnessed rapid growth and is already used in clinical trials for various procedures. However, most clinica
3、lly compatible imaging systems are optimized for large and cannot be employed such as during head and neck oncologic surgeries because the system is not able to image inside deep cavities or allow the surgeon access to certain tumors due to the large footprint of the system.To overcome the limitatio
4、n of now exist imaging system, We describe a portable fluorescence goggle navigation system for tumor margin assessment during oncologic surgeries. The system consists of a computer, a head mount display (HMD) device, a near infrared (NIR) CCD camera, a miniature CMOS camera, and a 780nm laser diode
5、 excitation light source. The fluorescence and the background images of the surgical scene are acquired by the CCD camera and the CMOS camera respectively, co-registered, and displayed on the HMD device in real-time. The technical feasibility of the proposed goggle system is tested in an ex vivo tum
6、or model. Our experiments demonstrate the feasibility of using a goggle navigation system for intraoperative margin detection and surgical guidance.Key Words: fluorescence imaging; tumor margin; goggle navigation systemAbstract3目 录摘 要 .IABSTRACT .2目 录 3第一章 绪论 51.1 课题背景 51.2 课题研究的目的和意义 71.3 国内外研究现状 8
7、1.4 本课题的目标和主要工作 9第二章 近红外荧光成像技术 112.1 引言 112.2 荧光成像系统概述 112.3 荧光成像系统的关键参数及系统组成 122.3.1 视场（FOV） 132.3.2 近红外激发辐射度 132.3.3 荧光激发光源 132.3.4 荧光成像相机 152.3.5 荧光成像滤光片 15第三章 导航目镜系统的设计 193.1 系统原理及实现 193.1 系统的硬件部分 193.1.1 光源 203.1.2 相机与镜头 213.1.3 滤光片 233.2 系统的软件部分 243.2.1 相机的控制模块 243.2.2 图像处理算法模块 273.2 模拟手术现场的工作
8、流程 31第四章 生物组织的光学特性及仿体的制备 324.1 生物组织的光学特性 324.2 生物组织光学仿体的制备流程 .34Abstract4第五章 实验设计部分 375.1 ICG 水溶液的荧光特性分析 .375.1.1 实验目的 375.1.2 实验仪器 375.1.3 实验步骤 375.1.4 实验结果 385.2 ICG 水溶液的荧光强度对比 .395.2.1 实验目的 395.2.2 实验仪器 395.2.3 实验步骤 395.2.4 实验结果 425.2.5 结果分析 425.3 荧光成像系统配准误差分析 435.3.1 实验目的 445.3.2 实验步骤 445.3.3 实验
9、结果 445.3.4 结果分析 455.4 荧光成像系统分辨率测试 455.5.1 实验目的 465.5.2 实验步骤 465.5.3 实验结果 475.5.4 结果分析 47第六章 总结与展望 48参考文献 49致 谢 52在读期间发表的学术论文与取得的科研成果 54第一章 绪论5第一章 绪论1.1 课题背景据联合国最新统计数据显示，全球目前平均每 8 个死亡病例中就有 1 人死于癌症，这比疟疾、艾滋病和结核病导致的死亡人数还要高，而且每年还有1000 多万人被确诊为癌症患者，在这庞大的数据当中，超过 60%的癌症病例主要集中在亚洲、非洲以及南美洲等中低收入国家，其中中国的新增病例和死亡人数
10、首当其冲。中国目前每 6 分钟内就有一人被确诊为癌症，每天将近有 8500人成为癌症患者，每七到八人当中就有一人死于癌症。这一连串的灰色数字使得人们对癌症谈虎色变。虽然目前癌症患者的比例还在不断地扩大当中，但癌症患者的生存率及癌症的控制性已经达到了前所未有的高度，人类对癌症生物层面的理解已经非常深入，癌症的预防、诊断、治疗等手段都取得了相当大的进展，这主要得益于生物医学的不断发展，科学家已经能够从基因水平上理解肿瘤的发生与发展，并在攻克癌症方面取得了显著的进步。目前在肿瘤治疗方面所用的方法主要有：（1）靶向疗法：研究发现，不同肿瘤患者的基因有所不同，比如，即使同是患有肺癌的患者，其对药物的反应
11、也可以完全不同。究其原因，在于肿瘤细胞的基因变化不同。靶向治疗的优势在于，治疗药物可以在细胞分子水平上，特异性地选择结合点，干扰肿瘤细胞的生长，将其置之于死地，而不会波及周围的正常细胞。通俗地说，就是只杀“坏细胞” ，而不错杀“好细胞” 。因此，相对于化疗，靶向治疗不仅精准，而且比较温和，副作用少，患者可以在家中服药治疗，因而也更加方便。（2）肿瘤外科：如今，癌症的外科手术更加精准，微创手术的广泛开展使患者的创伤更小，恢复更快，切口也更美观。临床证据已充分证明了微创手术在治疗癌症方面的安全性，打消了人们的某些顾虑。在不影响手术效果的前提下，肿瘤外科并发症更少、术后引起身体的变形得到更好的弥补。
12、比如，乳腺癌术后接受乳房再造手术的病人比例越来越高，取得的整形效果也更满意，提高了癌症患者术后的生活质量。（3）放射治疗：由于计算机技术、放射物理学、放射生物学、影像学的有力支持，肿瘤的放射治疗技术已经取得了革命性的进步。随着放疗精度的日益提高，精确放疗有效地保证和提高了放疗高剂量落在肿瘤靶区内，而其周边组织和器官处于低剂量照射。放疗在肿瘤治疗中的作用越来越大，世界卫生组织第一章 绪论6统计，癌症治愈患者中的近一半应归功于放疗。（4）药物研发：在现有的 170 多种抗癌药物中，大多数都是近十年研发出来的新药。此外，还有大约 1000 种抗癌药物及癌症疫苗在研发过程中。很多最新开发的抗癌药物，有
13、效地消除了恶心、疼痛、脱发等副作用，给予患者较高的生活质量。同时，另一些新开发的药物较好解决了某些肿瘤治疗的耐药性问题。（5）肿瘤筛查：医学界普遍认为，大约三分之一的癌症可以得到有效预防。其主要方式是：调整生活方式、改善饮食结构和早期筛查。例如，最新研究显示，乙状结肠镜检查能够有效降低结肠直肠癌的发生率和死亡率。与此相反的是，另一项研究得出结论，每年一次的胸部 X 线检查并不能够在普通人群中降低肺癌的死亡风险，因而不主张人们定期做这一检查。虽然治疗肿瘤的方法多种多样，而肿瘤外科是目前治疗肿瘤的首选方法，也是最古老和最有效的治疗方法，该方法是将癌症原发病灶（癌症最初发生的部位）及转移病灶（由原发
14、性转移的病灶）一并切除的治疗方法，该方法现在已经十分成熟，麻醉方法也很完善，病人可以接受安全的、没有痛苦的手术治疗，可以获得比其他治疗方法更多的治愈机会。虽然手术切除方法行之有效，但由于各种不可控因素的存在会导致肿瘤的复发。首先，是肿瘤本身的性质。从病理学的角度来讲，每种恶性肿瘤有各自不同的特点。有的虽然是恶性但又相对温和，我们称之为低度恶性，手术切除后很少复发或转移。而有的生长迅速，侵袭性很强，较易转移，可能肿瘤本身的体积很小，却已经有广泛的淋巴结或血道转移，这种我们称为高度恶性，手术后非常容易复发。第二，病程时间，即从起病到治疗之间的时间。我们以胃肠道肿瘤为例。如果病理诊断为粘膜内癌，则是
15、处于胃癌的早期阶段，及时进行手术切除，复发率低，预后好。如病理诊断为进展性癌或已经伴有淋巴结转移，提示已经是晚期胃癌，手术后复发率较高，预后差。第三，手术范围。恶性肿瘤与周围组织边界不清，医学上常形容为树根样浸润性生长，局部切除范围不够，必然复发。因此选择何种手术方式是医生术前要考虑的重要问题。合理的手术方式既要考虑将肿瘤彻底切除，同时还应兼顾患者身体状况能否承受及考虑患者生活质量等诸多问题。第四，是患者自身的体质和营养状况。患者术前的身体状况及术后的恢复情况能影响机体对抗癌细胞的能力，在较弱的机体中，机体内残留癌细胞的生长可能容易占上风而“死灰复燃” 。反之，如机体免疫力强，可通过自身免疫反
16、第一章 绪论7应消灭残留的肿瘤细胞。因此，加强营养，提高免疫力一直以来都是抗癌的基础疗法。总而言之，肿瘤复发的根本原因在于即使将肿瘤大本营切除，机体内还可能存有少量残留肿瘤细胞，这些细胞通过生长，不断“发展壮大” ，最终导致临床复发。1.2 课题研究的目的和意义以最大限度减少患者创伤为目标的微创治疗和将创伤降至最低点的无创治疗已经成为近年来医学领域的新治疗手段。由于在微创或无创治疗过程中没有生成传统治疗中的伤口，也就无法对病灶进行直接的肉眼观察，因此需要影像的精确导航，以便准确的将病变组织在不扩大病变区域的前提下完全处理掉。通过影像的精确导航，疾病的治疗可以更加准确、系统和完善。分子影像技术不
17、仅可以用于早期发现和精确诊断，还可以为基于影像的手术导航提供强有力的支持，从而极大地推动生命科学和临床医学的发展。对于基于分子影像技术的临床手术导航而言，影像不仅起到导航的作用，同时也起到监控成像和疗效评价成像的作用。与传统基于超声波技术的临床手术导航相比，基于分子影像技术的临床手术导航能够从分子病理水平指导手术，能够实现更精准的手术定位。近年来，由于分子影像学技术的不断发展，继放射性核素成像、正电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层和磁共振成像之后，出现了高分辨率的体内光学成像，其中近红外荧光成像倍受关注，目前前哨淋巴结成像、评价冠状动脉搭桥术后通畅度、术中识别肿瘤、医源性胆道损伤的诊断、以
18、及淋巴管和血管的成像等都应用了近红外荧光成像技术，逐步形成了近红外荧光成像辅助外科手术导航的新的医疗技术、新的医疗设备和新的临床学科。在医学临床领域，如何早期发现肿瘤组织及如何在手术过程中实现肿瘤的精确定位一直是国际上的挑战问题。外科手术过程中外科医生主要依据组织的色泽、质地、形态进行肿瘤的切除，所以判断切除的范围与医生的临床经验和切缘的病理阳性率有关。进一步研究认为医生在术中能够得到实时的肿瘤解剖结构图像，将提高手术成功率、降低手术创伤、减少医疗费用、避免手术意外发生、促进病人康复。而放射性核素成像、正电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层和磁共振成像等成像设备不可能搬到外科手术室，而且这些
19、成像设备在操作过程中对医生和病人有一定的损害，所以需要进一步探索，手术过程实时成像、操作方便、非侵入、无损害的技术。第一章 绪论81.3 国内外研究现状2002 年美国波士顿 Beth Israel Deaconess 医学中心首先介绍了第一代外科成像系统，该系统可以实时摄取彩色和近红外荧光，最大的特点是既能摄取近红外荧光，又能看到手术野的解剖结构，系统被称为荧光辅助切割和探测外科成像系统（简称 FLARETM） ，多年来该系统主要在大动物上进行外科手术的研究，有望应用到人类外科。在 2009 年世界分子影像大会上，2008 年度诺贝尔化学奖获得者钱永健先生报告了如何用荧光显微镜成像引导切除荧
20、光标记的小鼠肿瘤组织，开启了光学分子影像技术在手术导航领域的先河。2011 年，欧洲科学家已经研发出分子影像手术导航的原型系统，并成功应用到人体卵巢癌的临床手术中。中国科学院分子影像重点实验室团队根据前期在分子影像领域的研究基础，研发出光学分子影像手术导航系统，目前美国波士顿 Frangioni 实验室、日本滨松光电、法国 Fluoptics 公司、加拿大和荷兰等研究机构从事相关研发。（1）FLARE TM摄像系统 1,2FLARETM摄像系统首先是由美国波士顿 Beth Israel Deaconess 医学中心和乔治亚州立大学在 2002 年研制成功，FLARE 是 fluorescenc
21、e - assisted resection and exploration 的缩写，即荧光辅助切除和探测。FLARETM设计的基本方案是在外科手术时，显示器上既能显示外科手术的解剖结构，还能显示肉眼看不到的近红外荧光，并且能够重叠在彩色图像上。FLARETM系统的基本组成：400W 冷光源，其中白光 40000 lux，波长400650nm，其二近红外激发光源之一，技术参数是光强度 4mW/cm2，波长700nm (656678nm)，其三近红外激发光源之二，技术参数是光强度14mW/cm2，波长 800nm (745779nm)，近红外光源采用环行 LED 排列，线性驱动集成；摄像系统包括
22、彩色摄像 CCD， 400650nm 峰值量子率效高,700nm近红外摄像 CCD，689725nm 峰值量子率效高，和 800nm 近红外摄像 CCD ，800848nm 峰值量子率效高,共三种 CCD 同时获取、像素 640480、系统分辩力 125125m (x,y)到 625625m (x,y)、显示刷新 15 Hz、NIR 暴光时间为 100sec 到 8sec，免持光学自动变焦和聚焦。（2）Fluobeam 手持式成像系统 2Fluobeam 是法国 Grenoble 的 Fluoptics 公司研制，Fluobeam 是手持式成像系统，依据近红外成像原理，具有高灵敏度，可探测到皮
23、摩尔级（10-12）甚至飞摩尔级（10-15）的荧光信号开放式设计。成像速度快，10ms-1s 即可完成清晰成像。开放式的成像设计，不受动物大小的限制，灵活可移动，操作简易等特点，能够在白光下直接检测。目前，Fluobeam 成像系统分为 Fluobeam 700第一章 绪论9和 Fluobeam 800 两种型号，激发波长分别为 680nm 和 780nm，被广泛应用于大动物成像，药物示踪，生物大分子体内示踪，肿瘤成像及体内分布，淋巴结和血管成像，手术实时引导，其他疾病的早期诊断等。（3）Artemis 手持式成像系统Artemis 手持式成像系统是世界上首个同时采集全色和荧光的医疗成像系统
24、，该系统将手术室成像提升到一个新的水平。能够同时显示彩色图像和点到点荧光叠加图像让这款仪器在精密手术和诊断中变得有价值。该成像系统通过使用一个简单的切换镜头和腹腔镜，可用于外科和微创手术。这款便携式系统的一大优点是体积小,比目前学术界的解决方案提供更好的操作性，具有 800nm吲哚青绿和 700nm 荧光探针成像两种功能，适用于腹腔镜和开放手术。成像系统分辨率是 659494 像素、大约 330000 pixels、图像输出 5.6 x 5.6m、帧频 560fps、读取噪音 30 electrons、井位能 25000 electrons，还配置390mm 和 190mm 两种型号的腹腔镜。
25、该系统主要应用于心血管、切断术、血管渗漏、前哨淋巴结定位、肿瘤检测等。（4）Novadaq 探测成像系统 3Novadaq 探测成像系统（Novadaqs SPY Imaging System）是由加拿大 Novadaq Technologies Inc.研制，是目前第一个，也是唯一一个被 FDA 许可进行心脏冠状动脉搭桥术后评估通畅度的设备，是整形和重建外科手术，评估游离皮瓣血运的重要工具。还可应用于器官移植，小儿外科和泌尿外科等领域。Novadaq 探测成像系统重要的功能之一是能够在手术室中灵活使用，定量评定手术中的关键步骤。（5）The Photodynamic Eye 成像系统The
26、Photodynamic Eye 成像系统是由日本滨松光电研制，主要用于乳腺癌及其他恶性肿瘤前哨淋巴结定位，术中探查残余肿瘤，胆道造影，冠状动脉搭桥效果评估，脑血管的术中显像，皮瓣血液供应的探查，生物活体的荧光成像研究等领域，其图像感受器是 CCD，发射光源是 LED 。1.4 本课题的目标和主要工作本课题的目标是针对术中导航的需求，旨在开发一种轻型便携式的可佩戴的手术导航目镜，用于手术过程中的荧光造影，服务于实时肿瘤手术边界的评估，使其在影像性能和质量上达到大中型设备的水准，填补医疗影像和导航手术领域的国内和国际空白。第一章 绪论10本文的主要工作包括：（1）方案的提出。调研目前国内外相关的
27、研究工作，针对目前国内外现有的手术导航系统的不足与缺陷，提出自己的设计方案，并分析方案的可行性。（2）系统的搭建。购置相关的硬件设备，整合硬件设施，并从硬件和软件的角度进行相关的研究工作。硬件部分主要是硬件的选型与整合，照明光源的设计与改进等。软件部分主要是相机控制程序的设计，图像处理算法的实现等。（3）系统的测试。主要从实验的角度，如 ICG 水溶液的荧光强度测试，进行系统的灵敏度分析，不同间距与粗细条纹的识别测试系统的分辨率，以及离体的模拟肿瘤切除实验对系统的可行性进行了分析。（4）系统的优化。针对初步搭建的系统的潜在性问题，结合临床上肿瘤切除手术说要面临的问题，进行系统优化与改进。如提高
28、系统的操作性与集成度，增强系统的稳定性，图像处理算法的优化等。第二章 近红外荧光成像技术11第二章 近红外荧光成像技术2.1 引言近年来，随着医学影像技术的不断发展，分子影像学作为生物医学领域的一门新兴的学科得到了广泛的开展。传统的医学影像技术主要以生物体本身的物理或者生理特性为载体进行诊断成像，在细胞或者分子水平不具有特异性。而分子影像技术是在细胞或者分子水平对生物体进行在体成像，从而获取生物体本身的内部特征，因此可以很好地促进疾病的早期诊断，相关药物的研制以及生命机理的分析。分子影像技术按成像原理的不同可分为光学、核医学和磁共振（MRI）成像技术。在光学成像技术中，荧光分子成像（FI）在体
29、内和体外细胞和组织的可视化成像模式的应用中有独特的优势。这些优势主要包括：对比度（也叫信噪比）高：通常，荧光的波段与周围其他光的波段能够很好地被分割出来，通过特定的成像系统能够把只有荧光没有背景的图像很好地呈现出来。灵敏高：荧光在造影剂浓度很低的情况下也能够被光电传感器探测到，在大部分应用中，其灵敏度近乎放射性同位素。稳定性高：荧光素标记的物质信号稳定性优势明显，能够稳定存在较长时间，这为荧光标记物的存储提供了方便。低毒性成本低：多数情况下，荧光标记和检测的全过程试验用手套即可对实验者提供足够的保护，且易于运输和实验后处理。在荧光分子成像中，需要借助荧光探针或靶向分子对某些特定的生物组织进行观
30、察和定量分析，荧光分子探针按其成像过程的不同可分为非特异性探针、靶向探针和智能探针。其中智能探针不仅适用于光学成像，同时也适用于核磁共振成像。荧光成像主要基于反射成像理论 4，简单地说就是光源与探测器处于被照物的同一侧时，探测器能够探测到光源所发出的光子。反射成像是目前被用于探测体内荧光探针分布最典型的一种方法，该方法还可用于无需外界激发的，生物体的自发荧光成像中。2.2 荧光成像系统概述第二章 近红外荧光成像技术12荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系，这是荧光成像系统应用于生物学研究的理论基础。在荧光成像系统研究领域，近红外荧光成像技术主要针对于那
31、些能够被激发出的荧光波长通常在 700nm 到 900nm 的荧光造影剂，图 2.1 所示的是一个典型的反射式荧光成像系统 4,6。图 2.1 一种典型的反射式荧光成像系统 与可见光相比，近红外光具有：生物组织对近红外光的吸收和散射效应小，可穿透更深层的组织；由于生物组织的近红外自体荧光较小，信噪比（Signal to background ratio，SBR)相对高等优点，有可能成为未来临床医学在体实时成像的重要理论。总的来说，荧光成像系统主要由一个频谱光源（安装有滤光片的宽频带光源，发光二极管或激光二极管）用于激发混有荧光团的混浊介质，被激发得到的荧光通常由 CCD 相机来捕捉并成像，而用
32、于激发的光源通常会带有一个滤光系统 5,7。2.3 荧光成像系统的关键参数及系统组成荧光成像系统按成像方式可分为平面成像系统和断层成像系统两类。平面成像系统通过 CCD 相机直接采集某个方向的光子投影信号，由于其开发和操作简单以及通率高等优点，因此在实际中得到了广泛的应用。然而由于该成像系统的信号主要来源于多个深度的信号叠加而成，因此导致系统的分辨率低，图像模糊等特点，同时通过该系统得到的信号强度与组织的深度是非线性的，因而量化比较困难。而荧光分子断层成像（FMT）可以很好解决上述成像系统所存在的问题，该系统对采集到的荧光图像透过图像重建来获取目标的深度信息，克服了平面成像系统的局限性，此外，
33、荧光分子断层成像成本低、性能稳点、第二章 近红外荧光成像技术13灵敏度高等优点使得该系统在近几年内取得了很大的发展 5。目前商品化的荧光成像系统的应用层出不穷，比较典型的如 IVIS 小动物活体成像系统，该系统通过化学发光和荧光标记技术，标记基因、多肽和细胞，可以直接检测活体生物体内的细胞活动和基因行为，观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、疾病的发生发展、基因的表达等生物学过程，可以直接实时观察标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应，并可用于体外培养细胞实验,因而在活体荧光成像中得到了广泛的应用。虽然荧光成像系统在概念上很简单，但是几乎每一项设计参数都将影响到系统的性能及信噪比。2.3.1
34、视场（FOV）荧光成像系统的视场一般都是可调节的，并且它的调节可以通过缩放或者是固定放大倍率的透镜来完成。通常为了使之适用于任何一项外科手术，荧光成像系统的视场最大范围不能低于直径为 10cm 当然最好是 20cm 的圆 8。当然，为了切除一些小的肿瘤避免薄壁神经的干扰，最佳的视场大小一般会被定义在直径为不低于 1cm 到 2cm 的圆。在荧光成像系统的设计中，视场的大小要与激发光通量，光子的收集率与相机的分辨率相权衡。视场的范围越大，激发光的功率也要越大，而对于有限像素的 CCD 相机来说，对分辨率的要求也会降低。2.3.2 近红外激发辐射度荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度，提高激
35、发光强度固然可以提高信号强度，但激发光的强度不是可以无限提高的，当光源的辐射功率超过一定限度（50 mW/cm 2）时 8，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子，出现光漂白现象。同时，高辐射度会使生物组织温度过高，造成组织损伤。通常情况下，激发辐射度应可调以适应所有可能的临床需求。2.3.3 荧光激发光源能够用于荧光激发的光源主要有三种，安装有滤光片的宽频带光源，发光二极管和激光二极管，而对三种光源的选择通常没有一个严格的界限，因为它们各有各的优势与劣势。安装有滤光片的宽频带光源：该光源最大的问题就是发光效率问题，该光源所产生的大部分光子通过窄带滤光片会被滤除掉，只有一小部分用于荧光的激发
36、，光源产生的过热现象要被及时地消散掉，否则就会损坏光源。这种光源第二章 近红外荧光成像技术14通常会有一个相对比较大的立体角，也就意味着更少的一部分光照射到手术区域，而且想要把光线用透镜来聚焦也是比较困难的，基于这些因素的考虑，目前很少把这种光源应用于荧光手术导航中。发光二极管（LED）：LED 在功率（能达到数十毫瓦以上） ，谱约束（半宽最大值FWHM50nm） ，发光效率以及价格上都会提供一个比较好的选择。而且，LED 在消费市场上所占的份额使得它们在性能和封装尺寸上都有比较大的优势。然而，把 LED 应用于荧光手术领域却面临着巨大的挑战，最主要的一点就是LED 阵列的散热问题。为了减少
37、LED 的半宽最大值FWHM，必须在 LED 前安装一个激发滤光片，同时需要附带一个准直器来限制光源的立体角以使 LED 发出的光基本上能够被激发滤光片滤除。而且，无论在 LED 内部或者外部都必须采用一个透镜来聚光从而得到一个合适的视场大小。激光二极管（LD）：相比较 LED，LD 具有以下特点：单色性好。激光的颜色很纯,其单色性比普通光源的光高 10 倍以上。因此，激光光源是一种优良的相干光源，可广泛用于光通信。方向性强。激光束的发散立体角很小,为毫弧度量级,比普通光或微波的发散角小 23 数量级。光亮度高。激光焦点处的辐射亮度比普通光高 10100 倍。但激光光源的缺点也很明显，激光二极
38、管的光谱带宽通常比较窄并且很难被集成，高功率的激光器价格昂贵，而且很容易引发安全问题，所以用这类激光器时要做好个人防护，如佩戴激光护目镜等。由于温度的变化会引起波长的改变，高温也会降低激光二极管的使用寿命，因此，激光二极管需要采用比例-积分-微分控制回路对电流和温度进行精确的控制。近年来，功率在 1w 到 2w 范围内的近红外激光二极管被应用地越来越多，但并不是每一个波段都能用高功率来封装。一种典型的采用激光二极管的荧光信号扫描收集系统，振镜式扫描系统如下图 2.2 所示：图 2.2 振镜式扫描系统工作示意图第二章 近红外荧光成像技术15该系统是通过快速摆动反射镜将反射光信号捕获，从而缩短了二
39、维荧光信号的收集时间，同时适用于收集较厚样品的纵深荧光信号。与此同时，由于收集到的发射荧光信号的角度有一定差别，所以会引起一定的视差偏差效应，通过适用 f-theta 透镜可以使这种视差效应引起的失真影响降到最低。2.3.4 荧光成像相机目前，在影像导航手术上用的比较多的是基于硅集成的 CCD 相机，但这种相机并不是最理想的。它们通常对于 800nm 左右的光的量子效率比较低（一般小于 25%） ，并且帧数也相对比较低（一般每秒在 15 到 30 帧左右） ，但是 CCD相机在温度较低的环境下其输出噪声也会很低（10 e- rms） ，而且 CCD 相机通常会有一个比较高的分辨率。另外一种我们
40、用的比较多的相机是 CMOS 相机，相比较 CCD 相机，CMOS 相机通常在尺寸，功耗和帧数上都有很大的改进，但同样，它的量子效率低，噪声大。最近有一款新的相机科学型 CMOS 相机（SCMOS）能够很好地满足我们的要求，它们噪声小（3 e- rms） ，在 800nm光的量子效率低（33%）的特点能够很好地被我们用在近红外手术导航领域，当然价格会比较贵。2.3.5 荧光成像滤光片滤光片是荧光成像系统不可或缺的一部分，对荧光成像质量的好坏起着关键性的作用。荧光成像滤光片分为激发滤光片和发射滤光片，分别安装于激发光路和发射光路上，用于滤除不必要的光，得到我们所想要波段的光。目前，市面上有很多种
41、类型的滤光片，依据其工作原理可以分为两大类：颜色滤光片，这是各种颜色的平板玻璃或明胶片,其透射带宽数百埃，多用在宽带测光或装在恒星摄谱仪中，以隔离重迭光谱级次。其主要特点是尺寸可做得相当大。薄膜滤光片，又分为薄膜吸收滤光片和薄膜干涉滤光片两种。前者是在特定材料片基上，用化学浸蚀或真空蒸镀方法形成单层薄膜，使本征吸收线正好位于需要的波长处。一般透过的波长较长，多用做红外滤光片。后者是在一定片基上，用真空镀膜法交替形成具有一定厚度的高折射率或低折射率的金属-介质-金属膜，或全介质膜,构成一种低级次的、多级串联实心法布里-珀罗干涉仪。膜层的材料、厚度和串联方式的选择，由所需要的中心波长和透射带宽确定
42、。目前能够制造从紫外到红外任意波长、波长为 1 到 500 埃的各种干涉滤光片。当然，滤光片还有其他分类方法。光谱波段：紫外滤光片、可见滤光片、红外滤光片；光谱特性：带通滤光片、截止滤光片、分光滤光片、中性密度滤光片、第二章 近红外荧光成像技术16反射滤光片；膜层材料：软膜滤光片、硬膜滤光片。虽然有很多价格很便宜，但这些滤光片的透射率（包括表面反射）和变化坡度通常比较低，很难满足我们对某些波段光的要求，因此并不适用于荧光成像系统中。而对于一个特定的荧光系统，通常要求其滤光片的透射率能够达到 90%以上（OD 6） ，并且有一个接近垂直的变化坡度，当然这种滤光片的价格也比较贵。滤光片的主要技术参
43、数有：（1）入射角度：入射光线和滤光片表面法线之间的夹角。当光线正入射时，入射角为 0 。（2）光谱特性：滤光片光谱参数（透过率、反射率、光密度、位相、偏振状态等相对于波长变化的特性） 。 （3）中心波长：带通滤光片的中心称为中心波长（CWL） 。通带宽度用最大透过率一半处的宽度表示（FWHM） ，通常称为半宽。 （4）有效孔径：光学系统中有效利用的物理区域。通常于滤光片的外观尺寸相似，同心，尺寸略小些。 （5）截止位置/前-后：cut-on 对应光谱特性从衰减到透过的 50%点，cut-off 对应光谱特性从透过到衰减的 50%点。有时也定义为峰值透过率的 5%或者10%点。 （6）公差 T
44、olerance：:任何产品都有制造公差。以带通滤光片为例，中心波长要有公差，半宽要有公差，因此定购产品时一定要标明公差范围。滤光片实际使用过程中并 非公差越小越好，公差越小，制造难度越大，成本越高。用户可以根据实际需要，提出合理公差范围。2.4 近红外荧光材料近红外荧光（NIRF）学是荧光光谱学领域一个新兴的分支 9。在过去的五十年里，荧光光谱学在分析化学领域发挥了重要的作用。近年来，国内外越来越多学者也投入到了近红外光谱（波段范围在 700-1000nm）的研究。该研究主要致力于开发一种新颖的近红外荧光材料，并把这些材料作为一种荧光标记试剂作用于生物体的样本组织。与紫外区域荧光和可见区域荧
45、光不同的是，近红外荧光能够从生物样品中获取到比较低的背景信号，并且对生物体更具有穿透性（其穿透性在生物组织中能够达到 2-5cm） ，而生物体的自发荧光现象在紫外和可见光区域会产生比较大的背景干扰。因此，如果用可见波段的荧光来探测生物样本就会影响探测的结果。而在近红外区域内，由于生物体对近红外光的低散射和高穿透力以及生物体在该波段的低自发荧光现象，很容易可以通过近第二章 近红外荧光成像技术17红外激发来获取生物体的内在结构信息。基于这些特殊的性质，通过把近红外标记和传感器的结合，能够使之更好地应用于活体成像领域。因此，近红外区域也通常被叫做“生物窗” ，意在近红外荧光成像对疾病的检测，治疗和评
46、估有个显著的效果。目前近红外荧光造影剂的种类繁多，常用的近红外荧光造影剂及其理化与光学特性如下表 2.1 所示。在这些试剂中，临床上用的最多的就是吲哚菁绿（ICG） ，虽然它并不是很理想的荧光造影剂，但是它是目前唯一被美国食品药品管理局（FDA）批准用于临床的近红外成像试剂。自从 03 年 ICG 荧光造影首次应用于乳腺癌前哨淋巴结导航以来，其临床应用广泛流传，并迅速向其他领域扩散。表 2.1 常用的近红外荧光造影剂及其理化与光学特性 82.4.1 吲哚菁绿（ICG）的理化特性吲哚菁绿，英文名 Indocyanine Green(ICG)，是三羧花氰系中的一种暗绿青色色素，分子式为 C43H4
47、7N2NaO6S2，相对分子质量 774.96，由于其分子结构（如图 2.3 所示）是由碳链组成的两个多环部分，而每个多环部分又带有一个硫酸基团，这种复杂的结构使得吲哚菁绿具有两性分子特性：水溶性和亲脂性8。第二章 近红外荧光成像技术18图 2.3 吲哚菁绿的分子结构及光子特性与很多羰花青染色剂一样，吲哚菁绿也会形成聚合物，聚合的发生主要依赖于 ICG 浓度的大小与溶剂的性质。在水溶液中，如果 ICG 的浓度低于 5M，吲哚菁绿主要为单体呈现，如果浓度达到 100M，吲哚菁绿就会形成低聚物，而在生理盐水溶液中，吲哚菁绿就会形成聚合物。所以，吲哚菁绿在注射前必须溶解到水里。2.4.2 吲哚菁绿（
48、ICG）的光学特性吲哚菁绿的吸收光谱特性主要依赖于 ICG 的浓度与溶剂的性质，聚合过程一旦发生，就会影响 ICG 在水溶液中的吸收光谱形状。其吸收峰值便会随着ICG 浓度的增加而减少。如图 2.4 所示 8,10不同浓度的 ICG 水溶液的吸收光谱曲线图。当 ICG 在水溶液中处于单体情况时，其吸收峰值在 785nm，而当 ICG在水溶液中发生聚合时，其吸收峰值便会降低到 690nm。如果在 ICG 水溶液中同时又加入人体血清蛋白时，其吸收峰值就会达到 805nm 或 810nm，主要原因在于血清蛋白与 ICG 的粘合会减少 ICG 聚合物的形成。因此，通过静脉注射之后，ICG 溶液的吸收波
49、峰就会发生从 780nm 到达 805nm 偏移。第二章 近红外荧光成像技术19图 2.4 不同浓度 ICG 水溶液的吸收光谱曲线图在水溶液中，ICG 的发射光谱的峰值能够达到 810nm 或 820nm11-19，同样通过静脉注射以后，其发射光谱的峰值也会发生变化。通常，在刚开始注射后的几秒内，ICG 发射光谱的峰值发生快速的偏移，能够达到 820nm 或 830nm，而在注射后的一段时间，其峰值从 834nm 到 826nm 有个缓慢的下降之后趋于平稳。变化趋势如下图 2.5 所示。图 2.5 荧光峰值在注射后随时间的偏移量2.4.3 吲哚菁绿荧光产生过程第二章 近红外荧光成像技术20当我们用特定波段（780nm）的近红外激光器激发吲哚菁绿（ ICG）时，会测量到一更高波段，中心位于 810nm 的荧光。那么该荧光是如何产生的呢？首先，荧光的产生过程可用如下的动力学方程表示： *20ShvSEXF01*式中， h为普朗克常数， EXv为入射光光子的频率， 为产生的荧光的频率。前一个式子为光化学初级过程，表示具有荧光性的分子吸收入射光的能量后，其中的电子从基态 0S（通常为自旋单重态）跃迁至具有相同自旋多重度的激发态 *2S。后一个式子为荧光产生
