1、第 11 期第 48 卷第 11 期2009 年 11 月湖 北 农 业 科 学Hubei Agricultural SciencesVol 48 No.11Nov，2009收稿日期 ：20090916基金项目 ：国家自然科学基金 （20505009）；江西省自然科学基金 （0620010）；江西省研究生创新基金 （YC08A072）作者简介 ：李军华 （1985），男 ，浙江东阳人 ，在读硕士研究生 ，（电话 ）07917046351（电子信箱 ）bluetear2008hotmailcom；通讯作者 ，郑龙珍（1971），男 ，教授 ，硕士生导师 ，（电子信箱 ）zlzecjtujxcn。
2、自 1967 年 Updick 和 Hicks1首次研制出葡萄糖氧化酶电极以来 ，由于酶生物传感器具有检测速度快 、灵敏度好 、制作简便等优点成为传感器领域的研究热点 。 酶生物传感器的原理是基于酶的化学反应和异相电子转移反应 ，在恒电位下 ，随着反应进行电流产生响应 。 因而在恒电位下 ，电子从反应中心转移到电极表面的速度快慢直接影响着电流型传感器的性能 。 通常氧化还原酶都含有一个或几个还原中心 ，而且大部分氧化还原酶的氧化还原中心都是深埋在内部 ，有的外部还包裹着厚厚的一层糖蛋白 ，这使得氧化还原中心和电极表面的电子转移变得十分困难2。 第一代酶生物传感器利用氧作为电子转移媒介体 ，在氧
3、化还原中心和电极表面传递电子 ，加快了它们之间的电子转移 。 但是这类传感器的响应速度慢 ， 容易受外界氧浓度的影响 ，背景电流大 。 而后出现人工合成媒介体 ，主要有二茂铁及其衍生物3，4、麦尔多拉蓝5、高分子媒介体68等 。 在这些媒介体中的小分子类媒介体虽具有良好的电化学性质 ，但都存在着媒介体修饰到电极上易流失 ，影响修饰电极的灵敏度等问题 。 而高分子类媒介体虽解决了这个问题 ，但此类媒介体修饰到电极上响应电流偏小 ，响应时间也较长 。无试剂型葡萄糖生物传感器的研制李军华 ，郑龙珍 ，孙 娟 ，李欣佳（华东交通大学基础科学学院 ，南昌 330013）摘要 ：利用制备的羧基 环糊精衍生
4、物包络二茂铁得到了羧基 环糊精二茂铁包络物作为新型媒介体 。采用廉价易得的蛋清代替价格较高的牛血清白蛋白 ，用蛋清戊二醛交联媒介体 、酶 ，成功制得了电流型葡萄糖传感器 。 由于羧基 环糊精提供的疏水空腔将二茂铁包络 ，减少了二茂铁的流失 ，另外亲水性的外壁为酶提供的良好的外环境保证了酶的活性 ，故该传感器具有良好的稳定性 ，对葡萄糖表现出良好的响应 ，重现性也较好 ，且响应时间短 。 检测线性范围为 ：1105268103molL-1，相关系数为 09994，检测限为 12106molL-1（SN3）。关键词 ：媒介体 ；葡萄糖氧化酶 ；生物传感器中图分类号 ：TP2123 文献标识码 ：A
5、 文章编号 ：04398114（2009）112857-04Development of A Reagentless Amperometric Glucose BiosensorLI Junhua，ZHENG Longzhen，SUN Juan，LI Xinjia（School of Basic Science， East China Jiaotong University， Nanchang 330013， China）Abstract： A cyclodextrin derivative （carboxylCD） was prepared and ferrocene was include
6、d into the cavity of carboxylcyclodextrin to form Fecarboxylcyclodextrin inclusion complex （FecarboxylCD） as a novel mediator A glucosebiosensor which using glutaric dialdehyde and egg white which be more faciler and cheaper than BSA crosslinked with glu-cose oxidase and FecarboxylCD was successfull
7、y constructed Because of ferrocene was included into the hydrophobiccavity of carboxylcyclodextrin， it was not easily washed out Due to the hydrophile ektexine of carboxylcyclodextrinsupply an excellent environment to the enzyme， the biosensor had a good response property and its stability and life
8、timewere both improved obviously Under the optimal conditions the response of the biosensor to glucose was linear in the con-centration rang of 1105268103mol/L， and the detection limit was 12106molL （SN3）Key words： mediator； glucose oxidase； biosensor湖 北 农 业 科 学 2009年本文利用制备的羧基 环糊精衍生物 ， 并利用它的疏水空腔包络二茂
9、铁得到了一种新型的媒介体 。 解决了媒介体易流失的问题 ，同时修饰该媒介体的电极也具有较大的响应电流和较快的响应时间 。 利用蛋清和戊二醛作为交联剂将媒介体和葡萄糖氧化酶修饰到电极上 ，研制出了电流型葡萄糖氧化酶生物传感器 。 研究了该传感器对葡萄糖的催化性能和最佳工作条件等 ，结果表明该传感器具有响应速度快 、灵敏度高 、稳定性好等优点 。1材料与方法11 仪器与试剂超声波清洗器 （SK1200H，上海科导超声仪器有限公司 ）；电化学工作站 （CHI600，上海辰华仪器公司 ）； 电化学反应三电极系统 ： 修饰电极为工作电极 ，AgAgCl 电极为参比电极 ，铂电极为对电极 。葡萄糖氧化酶
10、（GOD，15 100 Umg，Sigma 公司 ）；羧基 环糊精 （参照文献 9合成 ）；甘氨酸 、硼氢化钠 、25戊二醛购自国药集团化学试剂有限公司 ；其他试剂均为分析纯 ；葡萄糖溶液配制后放置 24 h 后再使用 。 试验用水为二次蒸馏水 。12 羧基 环糊精衍生物的合成根据已报道的羧基 环糊精的合成9：将羰基 环糊精 （005 mol）溶解于少量 DMF 中 ，甘氨酸 （015 mol）用吡啶和等量 KOH 溶解 。 将羰基 环糊精溶液缓慢加入到甘氨酸的吡啶溶液中 ，加料完毕后 ，升温至 7080。 搅拌反应约 78 h，至溶液呈黄色 ， 滤去未反应的原料 ， 滤液分批加入 568 g
11、硼氢化钠 ，再用盐酸调节 pH 值至酸性 （pH 值为 34），向滤液中加入大量丙酮生成沉淀 ，抽滤 ，将沉淀用丙酮和乙醇多次洗涤 ，干燥后得目标产物 。13 媒介体的合成将二茂铁的乙醇溶液加入到羧基 环糊精水溶液中 （摩尔比 11），在室温下搅拌 10 min 后移入到高压釜中 ，于 100反应 12 h。 冷却后 ，反应混合液变为黄色透明的液体 。 反应混合物依次用丙酮和无水乙醇洗涤数次以除去水 ，然后在减压条件下将溶剂移除 。 产物在 60下隔夜真空干燥 。14 修饰电极的制备先用 Al2O3粉将玻碳电极抛光成镜面 ， 然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗 5 min。 将清洗后的玻碳电极
12、置于 05 molL1H2SO4中 ， 在 0516V 下进行循环伏安扫描 ， 扫描速度 100 mVS-1，直至 CV 曲线达平衡 。修饰液制备 ：取新鲜蛋清 40 L，25的戊二醛40 L，16 mgmL1的葡萄糖氧化酶 40 L， 浓度005 molL1的媒介体 40 L， 迅速搅拌至完全混合 。 吸取 12 L 修饰液滴在处理过的玻碳电极上 ，置于常温下晾干 ，晾干后可看到电极表面一层淡黄色的膜 ，即制得修饰电极 。15 试验方法采用三电极检测体系 ：AgAgCl 电极作为参比电极 ，葡萄糖氧化酶传感器作为工作电极 ，铂丝电极作为对电极 。 在 5mL pH 为 70，浓度为 01mo
13、lL1的 PBS 溶液中 ，在 25下进行循环伏安测试 ，扫描速度为 50 mVs-1， 扫描电位为 005V（AgAgCl）。记录 CV 曲线 ，加入一定浓度的葡萄糖后 ，记录酶电极对葡萄糖的安培响应 。 在搅拌条件下 ，加入不同浓度的葡萄糖 ，记录 it 曲线 。2结果与分析21 羧基 环糊精二茂铁包合物修饰电极的电化学性质媒介体修饰电极在 01 molL1pH 为 7 的 PBS中 ，在 005V 电位范围内 ，做不同扫速下的循环伏安曲线 ，由图 1 可以看出在 02V 和 026V 处有一对氧化还原峰 ，而且峰电位基本不随扫速的增加而改变 ，氧化还原峰电位差 （ Ep）约为 60 mV
14、，与单电子反应的理论值接近 ，表明修饰在电极上的媒介体具有良好的氧化还原可逆性 。 做扫速平方根和峰电流的曲线发现呈线性关系 （内插图 ），表明媒介体在电极上的氧化还原受扩散控制 ，这是由于修饰在电极表面的膜具有一定的厚度 ，媒介体从膜中扩散至电极表面发生氧化还原反应 。22 羧基 环糊精二茂铁包合物修饰电极对葡萄糖的催化性能图 2 为修饰电极在不同浓度葡萄糖下的循环伏安曲线 。 a 为修饰电极在 PBS 溶液中的 CV 图 ，可以看到一对可逆的氧化还原峰 ， 当向溶液中加入 1图 1 修饰电极在不同扫速下的循环伏安图底液 01 molL1pH7 的 PBS， 扫速分别为 10、20、30、4
15、0、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、400、500 mVs1；内插图 ：扫速与峰电流的线性关系6420-2-4-6I/A0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5E/V（vs.Ag/AgCl）50020103210-1-2-3I/A0 5 10 15 20 25V1/2/（mV/S）1/2IpaIpc2858第 11 期mmolL1葡萄糖后 ，026V 处的氧化峰电流显著增大 ， 还原峰电流迅速减小 （b），c、d、e、f 分别为加入2、3、4、5 mmolL1葡萄糖的 CV 曲线 ， 可以看到当加入 5 mmolL1葡萄糖的时
16、候 ，氧化峰电流急剧增大 ，还原峰电流几乎消失 ，表明修饰在电极上的媒介体在酶的氧化还原中心和电极表面起到了良好的电子传递作用 ，表现出修饰电极对葡萄糖具有良好的催化氧化性能 。 修饰电极对葡萄糖的催化机理如下10，11。DglucoseGOD （FAD）GluconolatonGOD（FADH2）GOD（FADH2）2FcCDCOOHGOD（FAD）FcCDCOOH2H2FcCDCOOH2FcCDCOOH2e23 温度对修饰电极的影响温度对酶的活性和催化反应具有重要影响 ，我们考察了试验温度在 550之间 ，氧化峰电流与温度的关系 ，如图 3 所示 ，在 535之间 ，氧化峰电流随着温度的升
17、高而增加 ，但超过 35以后氧化峰电流逐渐下降 ， 到 50的时候氧化峰电流已经很低了 ，这是由于温度过高 ，酶的大量失活造成 。 考虑到环境因素和修饰电极的使用寿命 ，我们选择的最佳试验温度为 25。24 电位对修饰电极的影响考察了不同电位下修饰电极对葡萄糖的响应 ，如图 4，在 0103V 之间随着电位的升高 ，氧化峰电流增大较快 ，0306V 之间随着电位升高氧化峰电流趋于平稳 ，这可能由于电位升高 ，虽然灵敏度也增加 ，但电活性物质对传感器的干扰也增加 。 所以试验选择最佳电位 025V。25 pH 值对修饰电极的影响考察 pH 在 5780 之间 ，氧化峰电流与 pH 的关系 。 如
18、图 5 所示 ，当 pH 为 7 时氧化峰电流最大 ，因而试验选择最佳 pH 为 7。26 修饰电极的性能参数主要考察了传感器的线性范围 、响应时间和检测限 。 图 6 为在 025V 电位下 ，连续加入不同浓度的葡萄糖的 it 曲线图 ，由图 6 可得 ，每次加入葡萄糖 ，修饰电极都能对葡萄糖做出迅速响应 ，响应时间为 35 s， 根据获得的响应电流大小和相应的葡萄糖浓度 ，绘制出该修饰电极的校正曲线图 （内插图 ），可以得到线性回归方程为 y1174 7x0016 3，线性相关系数为 0999 4， 线性范围 1105到 268103molL1，检测下限 12106molL1（SN3）。2
19、7 修饰电极的稳定性和抗干扰性用同一修饰电极对 015 molL1的葡萄糖溶液连续测定 200 次 ，催化电流下降仅 49。 电极不用图 3 温度对传感器响应的影响底液 01molL1PBS（pH7），含 02mmolL1葡萄糖 ，扫描速度50mVs10.280.260.240.220.200.180.160.14I/A0 10 20 30 40 50T/0.20.10.0I/A0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6E/V图 4 电位对传感器响应的影响底液 01 molL1PBS（pH7），含 008 mmolL1葡萄糖李军华等 ：无试剂型葡萄糖生物传感器的研制图 2 修饰电极在不同浓
20、度葡萄糖下的循环伏安图底液 01 molL1PBS（pH7），扫描速度 50 mVs1，加入的葡萄糖浓度 a（空白 ），b（1 mmolL1），c（2 mmolL1），d（3 mmolL1），e（4mmolL1），f（5 mmolL1）76543210-1I/A0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5E/V（vs.Ag/AgCl）fedcba底液 01 molL1PBS（pH7）含 015 mmolL1葡萄糖 ，扫描速度50 mVs10.200.190.180.170.160.150.14I/A5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0pH图 5 pH 对传感器响应的影响2859湖
21、北 农 业 科 学 2009年时用蒸馏水冲洗吸干后放置于 4的 PBS（01molL1pH7）上方 。放置 3 周后活性下降到原来的 90。在实际检测中 ，一些电活性物质如尿酸 、抗坏血酸 、半胱胺酸等常会和葡萄糖共存 ，从而干扰葡萄糖的测定 ，在 01 molL1的 PBS（pH7）中 ，我们加入尿酸 、抗坏血酸 、半胱胺酸和葡萄糖来考察修饰电极的抗干扰性 ， 图 7 中可以看到 002 mmolL1半胱胺酸 、002 mmolL1的抗坏血酸和 002 mmolL1的尿酸以及不同浓度 （011、008、0025 mmolL1）的葡萄糖分别是在 50、100、150、200、250、300 s
22、 时加入的 ，半胱胺酸 、抗坏血酸和尿酸产生的电流和加入葡萄糖产生的电流相比非常小 ，说明这几种物质对葡萄糖的测定不产生干扰 。 这是由于较低的电位和二茂铁包络进入羧基 环糊精的空腔 ， 将电活性物质阻挡在外面 ，有效地减少了干扰 。3小结与讨论二茂铁具有优良的电化学性质 ，但由于本身不溶于水 ，而氧化态又溶于水 ，使用普通的修饰方法如物理吸附到电极表面或使用聚合物包埋媒介体修饰到电极表面等 ， 二茂铁在电极表面容易泄漏 ，导致传感器的灵敏度降低 ，寿命缩短 ，使其应用受到限制 。 采用在二茂铁上修饰一些活性基团 （-NH2、COOH、CHO 等 ），虽然能使二茂铁通过共价键较好的固定在电极表
23、面 ，但经过化学修饰的二茂铁在酶的活性中心和电极表面传递电子的能力明显减弱 ，并且较高的工作电位也使得传感器的抗干扰能力不强 。 本文制备了一种带羧基的 环糊精衍生物将二茂铁包络进它的疏水空腔 ，保证了二茂铁的稳定性 ， 再利用交联法将媒介体和酶修饰到电极上 ，制备了葡萄糖氧化酶生物传感器 。 由于 环糊精衍生物亲水性的外壁保证了酶的稳定 ，疏水性空腔极大减少了二茂铁的流失 ，电子媒介体与酶相互交联固定 ，使得酶的氧化还原中心更好的和媒介体接触 。 因而该传感器具有稳定性良好 、抗干扰性好 、响应速度快等优点 ，扩大了二茂铁作为电子媒介体的应用范围 。参考文献 ：1 UPDIKE S J，HI
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30、200 400 600 800 1000 1200 1400t/s0.05mM0.08mM0.15mM0.2mM1AsI/A3.53.02.52.01.51.00.50.0I/A0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0C/mmol-1y1174 7x0016 3r=0999 4图 7 传感器对 002 mmolL1的半胱胺酸 、002 mmolL1抗坏血酸 、002 mmolL1尿酸和 011、008、0025 mmolL1葡萄糖的安培响应0 50 100 150 200 250 300 350t/s0.800.750.700.650.600.550.50I/AL-cysAAUAGlucose0.11mM0.08mM0.025mM0.02mM0.02mM 0.02mM（责任编辑 王晓芳 ）2860
