1、高 效 液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 法 分 析6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素王 建 1, 2 李 忠 红 1 倪 坤 仪 3 1 王 志 群 11 (中 国 药 科 大 学 分 析 化 学 教 研 室 , 南 京 210009) 2 (浙 江 省 药 品 检 验 所 ,杭 州 310004)摘 要 采 用 高 效 液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 (HPLC2MSn )联 用 ,分 离 和 鉴 定 6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 及 其 中的 杂 质 ,并 探 讨 这 6种 结 构 相 似 的 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 的 质 谱 裂 解
2、 规 律 。 采 用 Agilent SB2C18 ( 250 mm 4. 6mm, 5 m)色 谱 柱 ,流 动 相 为 0. 05mol/L三 氟 乙 酸 溶 液 2甲 醇 ( 90 10 )和 0. 05 mol/L 五 氟 丙 酸 溶 液 2甲 醇(65 35) ;在 正 离 子 检 测 方 式 下 ,用 电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 法 对 阿 司 米 星 、 异 帕 米 星 、 大 观 霉 素 、 威 替 米 星 、 奈 替 米星 、 西 索 米 星 及 其 杂 质 进 行 多 级 质 谱 分 析 。 异 帕 米 星 、 威 替 米 星 、 奈 替 米 星 、 西 索 米 星 及
3、 其 杂 质 在 二 级 质 谱 分析 时 ,均 可 发 生 B环 (脱 氧 链 霉 胺 )与 C环 (氨 基 葡 萄 糖 )之 间 的 糖 苷 键 断 裂 ,生 成 脱 去 C环 的 碎 片 离 子 ,并 进一 步 发 生 A环 (氨 基 葡 萄 糖 )与 B环 之 间 的 糖 苷 键 断 裂 ,生 成 A环 或 B环 的 碎 片 离 子 。 鉴 定 了 6种 氨 基 糖 甙类 抗 生 素 中 7个 杂 质 的 结 构 。关 键 词 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 ,结 构 解 析 ,高 效 液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 阱 质 谱2005210209收 稿 ; 2006201212
4、接 受1 引 言氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 是 一 类 广 泛 用 于 各 种 革 兰 阴 性 菌 感 染 治 疗 的 化 合 物 。 该 类 抗 生 素 在 合 成 过 程 中会 产 生 一 些 副 产 物 及 降 解 产 物 ,产 生 的 杂 质 抗 菌 活 性 降 低 、 毒 性 增 加 ,影 响 临 床 使 用 效 果 。 因 此 ,有 必 要对 这 些 杂 质 进 行 鉴 定 和 控 制 。近 年 来 发 展 起 来 的 高 效 液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 (HPLC2MSn )联 用 技 术 ,将 色 谱 的 强 分 离 性 能与 质 谱 的 强 定 性
5、优 势 相 结 合 ,通 过 多 级 质 谱 分 析 ,可 获 得 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 分 子 丰 富 的 结 构 信 息 ,对 鉴定 已 知 杂 质 和 初 步 推 断 未 知 杂 质 的 可 能 结 构 ,显 示 出 极 大 的 优 越 性 1 5 。 本 研 究 通 过 实 验 ,建 立 了 适 合液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 联 用 分 析 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 的 液 相 色 谱 条 件 ,用 电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 对 6种氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 及 其 中 的 杂 质 进 行 多 级 质 谱 分 析 ,分 离 鉴 定 了
6、6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 中 的 7种 杂 质 ,并 探 讨 这 6种 结 构 相 似 的 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 及 其 中 杂 质 的 质 谱 裂 解 规 律 。2 实 验 部 分2. 1 仪 器 与 试 剂1100高 效 液 相 色 谱 系 统 、 1100 质 谱 仪 (包 括 电 喷 雾 离 子 源 、 离 子 阱 质 谱 检 测 器 ) (美 国Agilent公 司 )。 二 次 蒸 馏 水 ;五 氟 丙 酸 、 三 氟 乙 酸 :分 析 纯 ;甲 醇 :色 谱 纯 。 硫 酸 阿 司 米 星 原 料 药 及 硫 酸异 帕 米 星 原 料 药 (浙 江 海 正
7、药 业 股 份 有 限 公 司 ) ;硫 酸 奈 替 米 星 原 料 药 、 硫 酸 西 索 米 星 原 料 药 (浙 江 震 元制 药 有 限 公 司 ) ;硫 酸 威 替 米 星 原 料 药 (浙 江 康 乐 药 业 有 限 公 司 ) ;盐 酸 大 观 霉 素 原 料 药 (浙 江 金 华 康 恩贝 药 业 股 份 有 限 公 司 )。2. 2 实 验 方 法2. 2. 1 供 试 品 溶 液 的 制 备 取 阿 司 米 星 、 异 帕 米 星 、 大 观 霉 素 、 威 替 米 星 、 西 索 米 星 、 奈 替 米 星 各 适 量 ,分 别 加 水 溶 解 并 稀 释 制 成 5 g
8、/L的 供 试 品 溶 液 。2. 2. 2 液 相 色 谱 条 件 色 谱 柱 : Agilent SB 2C18 (250 mm 4. 6 mm, 5 m) ;阿 司 米 星 、 大 观 霉 素 、 威 替 米星 、 西 索 米 星 、 奈 替 米 星 分 析 用 流 动 相 0. 05 mol/L三 氟 乙 酸 溶 液 2甲 醇 (90 10) ,异 帕 米 星 分 析 用 流 动 相0. 05 mol/L五 氟 丙 酸 溶 液 2甲 醇 (65 35) ;流 速 : 1. 0 mL /m in;蒸 发 光 散 射 检 测 。第 34卷2006年 7月分 析 化 学( FENX I HU
9、AXUE) 研 究 简 报Chinese Journal of Analytical Chem istry第 7期979 9822. 2. 3 质 谱 条 件 离 子 源 ( ESI)喷 射 电 压 : 3. 50 kV;雾 化 器 (N2 )压 力 : 0. 208 MPa;干 燥 气 (N2 )流 速 :7. 0 L /m in;干 燥 气 温 度 : 350 ;锥 体 电 压 : 40 V;毛 细 管 输 出 电 压 : 94 V;离 子 扫 描 范 围 : 50 1000 m / z;正 离 子 方 式 检 测 ,采 用 全 扫 描 一 级 质 谱 ( Full scan)和 离 子
10、全 扫 描 二 级 质 谱 ( Full scan MS2 ) 2种 方 式 同 时测 定 ;柱 后 分 流 比 : 10 1。3 结 果 与 讨 论3. 1 色 谱 条 件 的 选 择 及 杂 质 分 离氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 极 性 很 大 ,在 ODS柱 上 不 保 留 。 可 通 过 与 酸 形 成 离 子 对 ,降 低 极 性 以 增 加 在 色谱 柱 上 的 保 留 。 同 时 为 了 适 合 液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 联 用 分 析 技 术 ,流 动 相 中 所 加 的 酸 必 须 是 挥发 性 酸 ,并 采 用 尽 可 能 低 的 浓 度 。 在
11、 所 选 择 的 色 谱 条 件 下 ,保 留 时 间 适 宜 , 6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 和 其中 的 杂 质 分 离 良 好 ,见 色 谱 图 a f。图 1 硫 酸 异 帕 米 星 ( a)、 硫 酸 奈 替 米 星 ( b)、 硫 酸 西 索 米 星 ( c)、 硫 酸 阿 司 米 星 ( d)、 盐 酸 大 观 霉 素 ( e)和 硫 酸威 替 米 星 ( f)的 杂 质 色 谱 图Fig. 1 Chromatogram of isepam icin and impurity( a) , netilm icin and impurity( b) and sisom ic
12、in and impurity( c) ,astrom icin and impurity( d) , spectinomycin and impurity( e) and vertilm icin and impurity( f)3. 2 电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 条 件 的 选 择 及 质 谱 裂 解 规 律根 据 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 的 结 构 特 点 ,选 择 了 ESI源 对 该 类 化 合 物 进 行 分 析 。 在 正 离 子 检 测 方 式 下 ,用 电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 法 对 6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 及 其 中 的 杂 质 进 行
13、质 谱 分 析 。 为 获 得 更 多 的 结 构 信息 ,对 准 分 子 离 子 峰 进 行 多 级 质 谱 分 析 ,获 得 相 应 的 碎 片 离 子 。 结 果 异 帕 米 星 、 威 替 米 星 、 西 索 米 星 、 奈替 米 星 及 其 杂 质 在 二 级 质 谱 分 析 时 ,均 可 发 生 B环 (脱 氧 链 霉 素 )与 C环 (氨 基 葡 萄 糖 )之 间 的 糖 苷 键断 裂 ,生 成 脱 去 C环 的 碎 片 离 子 ,并 进 一 步 发 生 A环 与 B环 之 间 的 糖 苷 键 断 裂 ,生 成 A环 或 B环 的 碎 片离 子 。 主 要 的 多 级 质 谱 碎
14、 片 离 子 见 表 1。3. 3 结 构 解 析异 帕 米 星 是 B环 1位 NH2被 异 丝 氨 酸 (C3 H3 O3N )取 代 ,而 异 帕 米 星 中 所 含 杂 质 A杂 质 分 子 量 比 异帕 米 星 大 87,可 能 为 双 取 代 物 ,即 异 帕 米 星 分 子 中 B环 的 3位 NH2也 被 异 丝 氨 酸 (C3 H3 O3 N )取 代 形 成的 副 产 物 。 结 合 多 级 质 谱 裂 解 可 初 步 推 断 该 杂 质 是 异 帕 米 星 分 子 中 3位 NH2与 异 丝 氨 酸 结 合 失 去 一 个分 子 H2 O所 得 的 两 分 子 异 丝 氨
15、 酸 取 代 物 (1N, 3 N 2异 帕 米 星 )。奈 替 米 星 中 所 含 杂 质 B一 级 质 谱 获 得 准 分 子 离 子 峰 m / z 350,二 级 质 谱 脱 去 B环 ,生 成 m / z 160的碎 片 离 子 ,脱 去 A环 生 成 m / z191的 碎 片 离 子 。 奈 替 米 星 在 105 条 件 下 放 置 2 h后 ,色 谱 图 中 杂 质 B089 分 析 化 学 第 34卷表 1 6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 及 其 中 杂 质 的 主 要 多 级 质 谱 碎 片 离 子Table 1 ( + ) 2Electrosp ray ion t
16、rap mass spectrometic ( ESE2MS) n major fragments of six am inoglycoside antibiotics and impu2rities一 级 质 谱MS full scanM + H +二 级 质 谱 MS2 full scan碎 片Fragment类 型Type of loss一 级 质 谱MS full scanM + H +二 级 质 谱 MS2 full scan碎 片Fragment类 型Type of loss异 帕 米 星 Isepam icin570411250- C环 ( ring)- C and A 环 (
17、ring)异 帕 米 星 中 杂 质 AIsepam icin impurity A657498337160- C环 ( ring)- C and A 环 ( ring)- C and B 环 ( ring)奈 替 米 星 Netim icin476350191- C环 ( ring)- C and A 环 ( ring)奈 替 米 星 中 杂 质 BNetim icin impurity B350160191- B 环 ( ring)- A 环 ( ring)西 索 米 星 Sisom icin448322160- C环 ( ring)- C and B 环 ( ring)西 索 米 星 中
18、 杂 质 ASisom icin impurity A322160 - B 环 ( ring)阿 司 米 星 A strom icin406246388- A 环 ( ring)- H2O阿 司 米 星 中 杂 质 BSstrom icin impurity B349207 - A 环 ( ring)大 观 霉 素 Spectinomycin333189 - C, B 环 ( ring)and H2O大 观 霉 素 中 杂 质 CSpectinomycin impurity C335大 观 霉 素 中 杂 质 DSpectinomycin impurity D351207333207- C a
19、nd B 环 ( ring)- H2O- H2O and C, B 环 ( ring)威 替 米 星 Vetilm icin490350191160- C环 ( ring)- C and A环 ( ring)- C and B环 ( ring)威 替 米 星 中 杂 质 AVetilm icin impurity A462322160- C环 ( ring)- C and B环 ( ring)峰 面 积 明 显 增 大 ,说 明 杂 质 B为 奈 替 米 星 遇 热 产 生 的 降 解 产 物 。 结 合 多 级 质 谱 裂 解 可 进 一 步 推 断 杂 质B是 奈 替 米 星 分 子 中
20、发 生 B环 与 C环 之 间 的 糖 苷 键 断 裂 ,生 成 的 脱 去 C环 (氨 基 葡 萄 糖 )的 降 解 产 物 ,与 英 国 药 典 中 所 列 杂 质 B (12N2ethylgaram ine)结 构 一 致 。西 索 米 星 中 杂 质 A一 级 质 谱 获 得 准 分 子 离 子 峰 m / z 322,二 级 质 谱 脱 去 B环 ,生 成 m / z 160的 碎 片离 子 。 西 索 米 星 在 105 条 件 下 放 置 2 h后 ,色 谱 图 中 杂 质 A峰 面 积 明 显 增 大 ,说 明 杂 质 A为 西 索 米 星遇 热 产 生 的 降 解 产 物 。
21、 结 合 多 级 质 谱 裂 解 可 初 步 推 断 西 索 米 星 中 杂 质 A是 西 索 米 星 分 子 中 发 生 B环与 C环 之 间 的 糖 苷 键 断 裂 ,生 成 的 脱 去 C环 (氨 基 葡 萄 糖 )的 降 解 产 物 。阿 司 米 星 中 所 含 杂 质 B一 级 质 谱 获 得 准 分 子 离 子 峰 m / z 349,二 级 质 谱 脱 去 A环 ,生 成 m / z 207的碎 片 离 子 。 阿 司 米 星 水 溶 液 室 温 条 件 下 放 置 1个 月 后 ,色 谱 图 中 杂 质 B峰 面 积 明 显 增 大 ,说 明 杂 质 B为 阿 司 米 星 水
22、解 产 生 的 降 解 产 物 。 结 合 多 级 质 谱 裂 解 可 进 一 步 推 断 阿 司 米 星 中 杂 质 B是 阿 司 米 星 分子 中 发 生 酰 胺 键 断 裂 生 成 的 降 解 产 物 。6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 及 杂 质 的 结 构 式 及 可 能 的 ESI/MSn裂 解 方 式 见 表 1及 图 2。图 2 6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 中 杂 质 的 结 构 式 及 可 能 的 ESI/MSn裂 解 方 式Fig. 2 Chem ical structures and the ESI/MSn fragmentation pathways of
23、 impurities189第 7期 王 建 等 :高 效 液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 法 分 析 6种 氨 基 糖 甙 类 抗 生 素 References1 Carson M C, Heller D N. J. Chrom atogr. B , 1998, 718: 95 1022 Hornish R E, W iest J R. J. Chrom atogr. A , 1998, 812: 123 1333 Zhou M J, W ei G L. J. Chrom atogr. A , 2004, 1057: 125 1314 L i L i(李 丽 ) , Dou
24、 J ianpeng(窦 建 鹏 ). Chinese J. A nal. Chem. (分 析 化 学 ) , 2005, 33 (3) : 317 3205 Zhang Xueqin (张 雪 琴 ) , Zhou Xin (周 欣 ). Chinese J. A nal. Chem. (分 析 化 学 ) , 2005, 33 (2) : 241 244Ana lysis of S ix Am inoglycoside An tib iotics and the the Im pur ities byH igh Performance L iqu id Chroma tography U
25、singElectrospray Ion Trap M a ss Spectrom etryW ang J ian1, 2 , L i Zhonghong1 , N i Kunyi3 1 , W ang Zhiqun11 (China Pharm aceutical U niversity, N anjiang 210009) 2 ( Zhejiang Institute for D rug Control, Hangzhou 310004)Abstract A high performance liquid chromatogrpahy2electrosp ray ion trap mass
26、 spectrometric (HPLC2MSn )method for the separation and structural identification of six am inoglycoside antibiotics and the impurities wasdeveloped. The column wasAgilent SB 2C18 (250 mm 4. 6 mm, 5 m). The mobile phaseswere 0. 05 mol/Ltrifluoroacetic acid2methanol ( 90 10, V /V ) and 0. 05 mol/L pe
27、ntafluorop rop ionic acid2methanol ( 65 35,V /V ). In positive mode, netilm icin, sisom icin, vetilm icin, spectinomycin, isepam icin, astrom icin and theimpurities were elucidated by the use of electrosp ray ion trap mass spectrometry in the multi2stage MS full scanmode. It is demonstrated that the
28、 netilm icin, sisom icin, vetilm icin, isepam icin and the impurities gave abun2dant p roduct ions by loss of the C2ring ( am ino2 2D2glycopyranose) in MS2 full scan mode. The p rom inentfragmentation ions were formed from the fragmentation ions by loss of the B 2ring ( 22deoxy2D2strep tam ine)furth
29、ermore. The possible structure of seven impurities in six am inoglycoside antibiotics were deduced basedon the HPLC2MSn data.Keywords Am inoglycoside antibiotics, structural elucidation, high performance liquid chromatography2electrosp ray ion trap mass spectrometry(Received 9 October 2005; accep te
30、d 12 January 2006)“ 第 四 届 国 际 华 夏 学 者 分 析 化 学 研 讨 会 ” 会 议 通 知The Fourth In terna tiona l Sym posium of W orldw ide Ch inese Scholars onAna lytica l Chem istry ( ISW CSAC 2006)第 四 届 国 际 华 夏 学 者 分 析 化 学 研 讨 会 ( ISWCSAC 2006) ,原 名 国 际 华 裔 学 者 分 析 化 学 研 讨 会 ,经 中 华 人 民 共 和 国 外交 部 和 中 国 科 学 技 术 协 会 批 准 ,由
31、 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所 主 办 ,将 于 2006年 9月 22日 26日 在 大 连 召 开 。此 次 会 议 的 宗 旨 是 进 一 步 加 强 海 内 外 华 裔 分 析 化 学 学 者 的 相 互 了 解 与 合 作 研 究 。 会 议 期 间 将 同 时 举 办 分 析 化 学 新产 品 、 新 技 术 展 示 会 。 充 分 展 示 分 析 化 学 、 生 命 科 学 和 实 验 室 设 备 的 最 新 产 品 和 技 术 成 果 。征 文 内 容 包 括 : 原 子 光 谱 和 分 子 光 谱 、 核 磁 共 振 、 电 分 析 化 学 、 色 谱 、 质 谱 ,以 及 其 他 种 类 分 析 仪 器 及 应 用联 系 人 张 丽 华 张 维 冰地 址 :大 连 市 中 山 路 457号 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所邮 编 : 116023 电 话 /传 真 : + 86 - 411 - 84379779E2mail: iswcsac2006 dicp. ac. cn 详 情 访 问 http: / / iswcsac2006. dicp. ac. cn.289 分 析 化 学 第 34卷
