1、反 相 高 效 液 相 色 谱 法 快 速 测 定 长 春 花 中 4种 生 物 碱罗 猛 付 玉 杰 祖 元 刚 3 史 权 牟 松 李 庆 勇(东 北 林 业 大 学 森 林 植 物 生 态 学 教 育 部 重 点 实 验 室 ,哈 尔 滨 150040)摘 要 采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 分 离 测 定 4种 长 春 花 吲 哚 类 生 物 碱 。 以 水 二 乙 胺 = 986 14,用 磷 酸调 节 pH = 7. 2 (溶 液 A) ,甲 醇 乙 腈 = 4 1 (溶 液 B) , 380 mL A和 620 mL B混 合 作 为 流 动 相 ,流 速 2
2、 mL /m in,进 样 量 10 L, 220 nm下 检 测 ,以 恒 流 洗 脱 方 式 在 25 m in内 分 离 了 长 春 碱 等 4种 成 分 。 同 时 还 研 究 了 流 动 相组 成 、 pH值 等 对 分 离 效 果 的 影 响 。 对 实 际 样 品 分 析 ,取 得 了 较 好 结 果 。关 键 词 反 相 高 效 液 相 色 谱 ,吲 哚 类 生 物 碱2003211225收 稿 ; 2004204207接 受本 文 系 科 技 部 中 德 国 际 合 作 项 目 ( No. CHN02 /329 )、 教 育 部 重 点 基 金 项 目 ( No. 10419
3、1 ) 和 哈 尔 滨 重 点 科 技 攻 关 项 目 ( No.2003AA3CS112)资 助1 引 言长 春 碱 (V inblastine)、 长 春 新 碱 (V incristine)、 长 春 质 碱 (Catharanthine)、 文 多 灵 (V indoline)是 夹 竹桃 科 植 物 长 春 花 (Catharanthus roseus L. G. Don)中 所 含 有 的 4种 重 要 的 吲 哚 类 生 物 碱 。 其 中 长 春 碱 和长 春 新 碱 是 目 前 世 界 上 应 用 广 泛 的 抗 肿 瘤 药 物 ,长 春 质 碱 、 文 多 灵 是 合 成
4、长 春 碱 的 前 体 1 ,长 春 质 碱 有一 定 的 降 血 糖 作 用 ,文 多 灵 有 镇 痛 和 利 尿 的 功 效 。 目 前 长 春 碱 类 生 物 碱 主 要 还 是 从 长 春 花 植 物 中 提 取 ,建 立 长 春 花 中 这 4种 生 物 碱 的 快 速 检 测 对 长 春 花 GAP种 植 和 建 立 质 量 评 价 体 系 具 有 重 要 意 义 。已 经 报 道 的 长 春 碱 类 生 物 碱 的 含 量 测 定 方 法 有 薄 层 扫 描 法 2, 3 、 高 效 液 相 色 谱 法 4, 5 及 放 射 性 免 疫测 定 法 6, 7 等 。 但 对 4种
5、生 物 碱 同 时 测 定 ,国 内 尚 未 见 报 道 。 本 研 究 在 以 往 文 献 8 11 的 基 础 上 ,建立 了 快 速 测 定 4种 吲 哚 类 生 物 碱 的 反 相 高 效 液 相 色 谱 方 法 ,在 实 际 样 品 的 分 析 中 取 得 了 满 意 的 结 果 。2 实 验 部 分2. 1 仪 器 与 试 剂JASCO高 效 液 相 色 谱 仪 (日 本 JASCO公 司 ) , 1580泵 , 1575型 紫 外 检 测 器 , Version 6. 1色 谱 工 作 站 ;PB220型 精 密 pH计 (上 海 雷 磁 仪 器 厂 ) ; BS210S型 电
6、子 天 平 (北 京 Sartorious有 限 公 司 ) ;M 250型 玻 璃 过滤 器 (上 海 玻 璃 仪 器 厂 ) ; UV22550紫 外 2可 见 分 光 光 度 计 (日 本 岛 津 公 司 )。 长 春 碱 、 长 春 新 碱 (纯 度 99% , Sigma公 司 ) ,长 春 质 碱 、 文 多 灵 (纯 度 95% ,浙 江 海 正 药 业 股 份 有 限 公 司 ) ;长 春 花 样 品 采 自 海南 省 海 口 市 ;乙 腈 、 甲 醇 均 为 色 谱 纯 ;磷 酸 、 二 乙 胺 为 分 析 纯 ;水 为 二 次 蒸 馏 水 。 所 有 试 剂 使 用 前 均
7、 经0145 m的 微 孔 滤 膜 过 滤 。2. 2 对 照 品 与 样 品 配 制精 确 称 取 适 量 长 春 碱 、 长 春 新 碱 、 长 春 质 碱 、 文 多 灵 对 照 品 ,用 5 mL甲 醇 溶 解 并 定 溶 于 25 mL容 量瓶 ,摇 匀 ,所 配 制 的 浓 度 分 别 为 0. 5、 0. 5、 0. 5和 1. 0 g/L。 取 长 春 花 全 株 粉 末 10 g,室 温 下 分 别 用 60、 40、20 mL甲 醇 超 声 提 取 40、 30、 20 m in,过 滤 ,合 并 提 取 液 , 50 减 压 蒸 发 ,经 0. 45 m的 微 孔 滤 膜
8、 过 滤 ,滤液 定 容 至 50 mL。 所 有 样 品 保 存 于 4 冰 箱 中 备 用 。2. 3 色 谱 条 件色 谱 柱 : D iamonsilTM C18 ODS(250 mm 4. 6 mm i. d. , 5 m) ;流 动 相 为 水 二 乙 胺 = 986 14,用 磷 酸调 节 pH = 7. 2 (溶 液 A ) ;甲 醇 乙 腈 = 4 1 (溶 液 B ) , 380 mL A和 620 mL B混 合 作 为 流 动 相 ;流 速 为2 mL /m in;进 样 量 : 10 L;柱 温 : 23 ;检 测 波 长 : 220 nm。3 结 果 与 讨 论3.
9、 1 流 动 相 的 组 成 对 分 离 效 果 的 影 响第 33卷2005年 1月分 析 化 学( FENX I HUAXUE) 研 究 简 报Chinese Journal of Analytical Chem istry第 1期87 89实 验 表 明 ,流 动 相 中 甲 醇 和 乙 腈 的 比 例 对 峰 形 有 较 大 影 响 ,随 着 甲 醇 比 例 的 升 高 ,分 离 物 出 现 严 重脱 尾 现 象 。 当 甲 醇 乙 腈 达 到 4 1时 ,峰 形 良 好 。 同 时 ,在 流 动 相 中 选 择 二 乙 胺 2磷 酸 溶 液 为 缓 冲 体 系 ,并 通 过 调 节
10、溶 液 A与 溶 液 B的 比 例 使 4种 物 质 得 到 较 好 的 分 离 。 在 实 验 中 ,当 A与 B 的 比 例 大 于38 62时 ,最 后 出 峰 的 长 春 碱 保 留 时 间 延 长 ;当 A与 B的 比 例 小 于 38 62时 ,长 春 新 碱 与 长 春 质 碱 峰 形 交叉 ,不 能 得 到 较 好 的 分 离 。 因 此 , A与 B的 比 例 在 38 62时 较 为 适 宜 。3. 2 流 动 相 的 pH值 对 分 离 效 果 的 影 响实 验 以 缓 冲 溶 液 调 整 流 动 相 的 pH值 。 将 缓 冲 溶 液 的 pH值 分 别 设 为 6.
11、8、 7. 0、 7. 2、 7. 4、 7. 6、 7. 8和 8. 0,观 察 pH值 对 峰 形 及 分 离 效 果 的 影 响 。 结 果 表 明 :当 缓 冲 溶 液 pH值 为 7. 2时 ,各 峰 间 分 离 度 增图 1 4种 长 春 花 生 物 碱 的 色 谱 图Fig. 1 Chromatogram for 4 vinca alka2loids1. 文 多 灵 ( vindoline) ; 2. 长 春 质 碱 ( catha2ranthine) ; 3. 长 春 新 碱 ( vincristine) ; 4. 长 春碱 ( vinblastine)。大 ,峰 形 较 好
12、。 因 此 ,选 择 缓 冲 溶 液 pH值 为 7. 2。3. 3 流 动 相 的 流 速 对 分 离 效 果 的 影 响流 动 相 的 流 速 对 各 物 质 的 保 留 时 间 有 较 大 影 响 。 分 别 设 定1. 0、 115、 2. 0 mL /m in,长 春 碱 在 前 两 个 流 速 下 保 留 时 间 分 别 在 42和 33 m in左 右 ,使 检 测 时 间 延 长 ,而 当 流 速 为 2. 0 mL /m in时 ,4种 物 质 可 在 25 m in内 即 可 完 成 分 离 。 考 虑 到 加 大 流 速 对 色 谱柱 及 液 相 系 统 的 影 响 以
13、及 所 确 定 检 测 条 件 的 普 适 性 ,因 此 选 择 流动 相 的 流 速 为 2 mL /m in。3. 4 色 谱 图 和 校 正 曲 线图 1为 4种 长 春 碱 类 生 物 碱 对 照 品 混 合 样 品 的 RP2HPLC色谱 图 。 由 图 中 可 以 看 出 , 4种 生 物 碱 得 到 了 很 好 的 分 离 ,且 峰 形 良好 。 由 回 归 分 析 得 到 的 4种 组 分 的 校 正 曲 线 列 于 表 1。 以 3倍 信噪 比 求 得 检 出 限 。 由 表 1可 以 看 出 峰 面 积 与 样 品 浓 度 呈 良 好 的线 性 关 系 ,线 性 范 围 适
14、 当 ,检 出 限 低 。 在 上 述 色 谱 条 件 下 , 注 入 供试 品 溶 液 , 平 均 理 论 塔 板 数 大 于 1500, 相 邻 各 峰 间 的 分 离 度 大 于 1. 5。表 1 4种 长 春 花 生 物 碱 标 准 曲 线 的 回 归 分 析 及 检 出 限Table 1 Regression analysis of calibration curves and detection lim it of 4 Catharanthus roseus alkaloids生 物 碱 标 准 品A lkaloids回 归 方 程Regression equations相 关 系
15、 数( r)线 性 范 围 ( g/L)L inear range检 出 限 ( g/L)Detection lim it长 春 碱 V inblastine Y = 22489190. 9565X + 130543. 8696 0. 9997 0. 06 0. 5 0. 021长 春 新 碱 V incristine Y = 16186790. 5771X + 205465. 3043 0. 9999 0. 01 0. 5 0. 003长 春 质 碱 Catharanthine Y = 28504756. 3636X + 431144. 0000 0. 9962 0. 1 0. 5 0. 0
16、42文 多 灵 V indoline Y = 12369067. 0040X + 86367. 9130 0. 9998 0. 1 1. 0 0. 042X:浓 度 ( concentration) , g/L; Y:峰 面 积 (peak area)3. 5 方 法 的 精 密 度 和 重 现 性在 上 述 色 谱 条 件 下 ,对 同 一 对 照 品 溶 液 ,重 复 测 定 5次 后 证 实 4种 物 质 在 此 测 定 方 法 下 ,峰 保 留 时间 波 动 小 于 0. 1 m in,测 得 峰 面 积 的 RSD为 :长 春 碱 0. 011% ;长 春 新 碱 0. 035% ;
17、长 春 质 碱 0. 091% ;文多 灵 0. 011%。 对 同 一 批 样 品 按 供 试 品 溶 液 的 制 备 方 法 平 行 制 备 5份 ,分 别 进 样 10 L ,同 时 取 混 合 对照 品 溶 液 10 L进 样 测 定 ,按 外 标 法 测 定 其 含 量 并 计 算 RSD ,长 春 碱 为 1. 01% ;长 春 新 碱 为 0157% ;长春 质 碱 为 0158% ;文 多 灵 为 1. 52%。3. 6 供 试 样 品 的 稳 定 性取 混 合 对 照 品 以 甲 醇 配 制 成 对 照 品 储 备 液 ,置 冰 箱 4 保 存 。 在 上 述 色 谱 条 件
18、 下 ,对 同 一 供 试 品 ,在 保 存 0、 6、 12、 24、 48 h后 ,用 当 日 新 配 制 的 对 照 品 溶 液 按 外 标 法 测 定 ,并 计 算 其 RSD小 于 2. 0% ,说 明供 试 品 在 48 h内 稳 定 。3. 7 实 际 样 品 分 析在 上 述 色 谱 条 件 下 ,对 2. 2所 制 备 的 实 际 样 品 溶 液 进 行 检 测 。 以 标 准 加 入 法 测 定 其 加 样 回 收 率 ,所得 结 果 列 于 表 2。 本 方 法 定 量 准 确 、 迅 速 、 重 现 性 好 。88 分 析 化 学 第 33卷表 2 实 际 样 品 分
19、析 结 果Table 2 Analytical results of the alkaloids of Catharanthus roseus样 品Samp les加 入 量Added ( g/L)测 得 量Found ( g/L)回 收 率Recovery ( % )相 对 标 准 偏 差RSD ( % , n = 3)长 春 碱 V inblastine00. 020. 040. 0765800. 0961940. 116813-99. 6100. 22. 322. 731. 98长 春 新 碱 V incristine00. 020. 040. 0108200. 0307580. 050
20、871-99. 8100. 12. 162. 591. 99长 春 质 碱 Catharanthine00. 100. 200. 1828800. 2777880. 382497-98. 299. 92. 973. 113. 02文 多 灵 V indoline00. 100. 200. 4872390. 5731450. 682428-97. 699. 32. 823. 042. 98References1 Pennanen S, Huhtikangas A. Photochem. and Photobiology, 1990, 51 (5) : 515 5182 Tam M N, N ik
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26、ortheast Forestry U niversity, Harbin 150040)Abstract A method for the rap id determ ination of 4 vinca alkaloids by reversed phase high performanceliquid chromatography (RP2HPLC) was p roposed. These 4 ingredients were separated on a D iamonsil ( C18column 250 mm 4. 6 mm i. d. , 5 m ) using water d
27、iethylam ine = 986 14 adjust pH to 7. 2 H3 PO4 , assolvent A and methanol acetonitrile = 4 1 as solvent B , and the mobile phase was composed of 380 mL A and620 mL B. The detection was performed at a flow rate of 2. 0 mL /m in, and detected at 220 nm within 25 m in.The effect of distribution p roportion of the mobile phase and pH value were discussed. And from the samp leanalysis we get the op timal result.Keywords Reversed phase high performance liquid chromatography, vinca alkaloids(Received 25 November 2003; accep ted 7 Ap ril 2004)98第 1期 罗 猛 等 :反 相 高 效 液 相 色 谱 法 快 速 测 定 长 春 花 中 4种 生 物 碱
