1、MTT 实验1MTT 溶液的配制 通常 MTT 配成的终浓度为 5mg/ml,须用 PBS 或生理盐水做溶剂。市面上一般 MTT 的包装为 100mg,250mg 或 1g。1.1 对于 100mg 这样的小包装，厂家都是将 MTT 放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如 100mg 用 20mlPBS 来溶解。 具休做法：预先在 50ml 离心管加入 20ml PBS，从中先吸取 500-1000ul PBS 装入含 MTT 的小管中，吹打若干次后将其移入 50ml 离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的 MTT 不残留于管内。将 MTT 完全混
2、匀后，用 0.22m 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20 度。按细胞培养板每孔需加 10ul 计算，一般每 96 孔板约需 1ml，所以分装时可考虑每管分装 1ml。1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加。注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。配成的 MTT 需要无菌，MTT 对菌很敏感。MTT 一般最好现用现配，过滤后 4 度避光保存两周内（个人曾做过 4 度避光保存 4 周的 MTT 溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml 保存在-20 度长
3、期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用。MTT 有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. 2MTT 甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜 DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。MTT 法实验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至 5-10104/ml。 细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔 2000 个就可以（相当于细胞悬液密度为 21
4、04/ml），细胞毒性实验每孔 500010000 个（相当于细胞悬液密度为 5104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入 100ul, 这样待测细胞的密度为 500010000/孔（边缘孔用无菌 PBS 填充）。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加 6 个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于 MTT 的结果至关重要。3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后
5、即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般 5-7 个梯度,每孔 100ul,设 3-5 个复孔.建议设 6 个，否则难以反应真实情况。下图可做为 96 孔板的的参考步局。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到 96 孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在 EP 管中将不同浓度的药物配好，然后将 96 孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入 100ul 含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把 96 孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于 96 孔板干燥引起细胞死亡。4.
6、5%CO2，37孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。5.每孔加入 10ulMTT 溶液（ 5mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。 6. 终止培养，准备溶解结晶，用 DMSO 溶解1) MTT 加入培养 4h 后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把 Formazan 结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将 96 孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。
7、个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。2) 每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置 摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对 OD 值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测 OD 值就可以了。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。六、MTT 结果分析 关于如何计算 IC50 1、改良
8、寇式法 :lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得 MTT 值如下药物浓度 ug/ml 100 50 25 12.5 6.25 3.125 0OD 均值 0.080 0.093 0.236 0.374 0.441 0.531 0.614公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率抑制率=1-加药组 OD 值/ 对照组 OD 值，如对于 100ug/ml 的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：药物浓度 ug/ml 100 50 25 12.5 6.25 3.125抑制率 0.869 0.849 0.616 0.391 0.282 0.135代入计算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655 IC50=45.186该药物的 IC50 值为 45.186ug/ml
