1、验证遗传平衡定律 实验一、 【目的】1.掌握 Hardy-Weinberg定律的原理；2.以果蝇的各性状来分析并验证 Hardy-Weinberg定律；3.理解和验证分离定律；4. 掌握果蝇的杂交技术；5.记录交配结果和掌握统计处理的方法。二、 【原理】1.要验证遗传平衡定律首先要熟悉种群的概念群体遗传学所研究的群体并不是许多个体的简单集合，而是一种特定的孟德尔群体(Mendelian population)，即一群相互交配的个体，其基因的传递是遵循孟德尔定律的。在群体遗传学中，将群体中所有个体共有的全部基因称为一个基因库(gene pool)。因此一个孟德尔群体是一群能够相互繁殖的个体，它们
2、享有一个共同的基因库。在有性繁殖的生物中，一个物种就是一个最大的孟德尔群体，在某一区域孟德尔群体中所产生的突变只能在种之间扩散，而不会越过种的界线进行转移，这也是生物学上“种”概念(biological species concept)的基础，它不同于分类学上的“种”概念(typological species concept)，后者主要是以形态学上的相似性如形态、解剖结构等为基础的。另外，分布于同一地区同一个物种的个体间是可以进行基因的自由交流的，即可以认为组成了单一的孟德尔群体，但是，由于某种自然的或人为的限制条件妨碍其中个体间基因的自由交流，使它们各自保持着各自不同的基因库，这时就会有同
3、一地区共存几个孟德尔群体的情况。对于无性繁殖生物的群体则是指由共同亲本来源的个体的集合。群体遗传学的目的是研究孟德尔群体遗传组成变化的机制。要研究孟德尔群体的遗传组成，首先必须对基因库进行定量描述，这可以通过对这个群体中的基因型频率(genotypic frequency)和等位基因频率(allelic frequency)的计算来完成。所谓基因型频率是指群体中某特定基因型个体的数目占个体总数目的比率；等位基因频率是指在一个二倍体生物的某特定基因座上某一个等位基因占该座位上等位基因总数的比率，也称为基因频率(gene frequency)。假设在一由 N个个体所组成的群体中有一对等位基因 A/
4、a位于常染色体上，在可能的三种基因型中，有 n1个 AA、n 2个 Aa、n 3个 aa个体。在群体遗传学中，基因频率比基因型频率更常用、更重要，因为：等位基因数总是较基因型数少，因此使用基因频率就可以用较少的参数来描述基因库，如一个座位有三个等位基因，那么就需用 6种基因型频率来描述基因库，但只需用 3种基因频率就可以了；在有性繁殖的生物形成配子时，配子只含等位基因而无基因型，在世代相传过程中只有等位基因是连续的，基因库的进化是通过等位基因频率的改变来实现的在有性生殖生物中，一种性别的任何一个个体有同样的机会和相反性别的个体交配的方式称为随机交配(random mating)，换句话说，各种
5、类型的个体交配的频率完全取决于自身频率的大小，而不受任何其它因素的影响。随机交配的结果是所有的基因型都是由孟德尔式分离所产生的配子随机结合而形成的。如果知道在一个随机交配的群体中某一给定位点上的等位基因频率，我们就很容易计算出在这个群体中预期的基因型频率。这一事实最早于 1908年由英国数学家 G Hardy和德国医生 W Weinberg在各自的论文中得到证明，这就是我们现在所说的哈迪-温伯格定律(Hardy-Weinberg Principle)，哈迪-温伯格定律是群体遗传中最重要的原理。它是指在一个不发生突变、迁移和选择的无限大的随机交配的群体中，基因频率和基因型频率在一代一代的繁殖传代
6、中保持不变，即在没有进化影响下当基因一代一代传递时，群体的基因频率和基因型频率将保持不变，因此，哈迪-温伯格定律也称为遗传平衡定律(law of genetic equilibrium)。如果一个群体达到了这种状态，就是一个遗传平衡的群体，未达到这种状态就是一个遗传不平衡的群体。遗传不平衡的群体只需随机杂交一代后，即可达到遗传平衡。2.哈迪-温伯格定律的描述假设一个群体中有一对等位基因 A/a，基因 A的频率为 p，基因 a的频率为 q，这里p+q=1，如果这个群体中 3种基因型的频率是：AAp 2，Aa2pq，aaq 2，这三种基因型所产生的两种配子的频率是：A = p2 + (2pq) =
7、 p2 + pq = p(p+ q) = p a = (2pq) + q2 = pq + q2 = (p+ q)q = q因为根据假设，个体间的交配是随机的，所以配子间的结合也是随机的，三种基因型AA、Aa、aa 的频率跟上一代完全一样。因此我们可以说，就这对基因而言，群体已经平衡了。这频率就是基因型的平衡频率。从上面也可以看出，不论亲代中基因型的频率是多少，只需雌雄配子中的等位基因的频率为 p和 q，配子随机结合后形成的子一代群体中的各基因型频率将达到(p 2，2pq，q 2)的平衡。综上所述，哈迪-温伯格定律的要点是：在一个无穷大的随机交配的孟德尔群体中，若没有进化的压力(突变、迁移和自然
8、选择)，基因频率逐代相传不变；无论群体的起始成分如何，经过一个世代的随机以后，群体的基因型频率将保持(p2，2pq，q 2)的平衡，即群体的基因型频率决定于它的基因频率；只要随机交配系统得以保持，基因型频率将保持上述平衡状态不会改变。从上述要点的第一点可以看出，哈迪-温伯格定律的成立是有条件的，除了随机交配外，定律指出这个群体是无穷大的，若一个群体的大小有限，可能导致基因频率和预期的比例发生偏差。所谓的无穷大完全是一个设想的模式，没有任何群体具有无穷的个体，然而只有对一个相当小群体来说，样本的误差会对基因频率有明显的影响，因此在实际应用中只要群体不至太小即可。第三个条件是没有进化的压力，在后面
9、我们会进一步讨论进化对哈迪- 温伯格定律的影响。上面这些条件在自然界是不可能存在的，所以称具备这些条件的群体为“理想群体“。另外需要说明的是，哈迪-温伯格定律所要求的随机交配并不是针对所有的性状。如果这样，那么人类群体就无法符合这一定律的要求，因人类择偶并不是随机的，而是对智商、外貌、性格、身高、肤色、学历以及社会地位等都有一定的要求。虽然如此，但对某些性状并没有要求而是随机的，如大部分人对血型等并无要求，甚至有的人并不知道自己的 M-N系统的具体血型。因此哈迪-温伯格定律要求的随机性是指诸如像血型这样一些性状，而不是那种非随机性状的座位。根据哈迪-温伯格定律，当一个座位上有两个等位基因时，在
10、群体达到平衡时，基因型频率将是 p2，2pq 和 q2，它等于等位基因频率之和的平方(p+q) 2。同样，对于三个等位基因 a1、a 2、a 3来说，若它们的频率分别为 p、q、r(p+q+r=1)，在平衡时基因型的频率也等于等位基因频率之和的平方：(p+q+r) 2 = p2 +q2 +r2 +2pq +2pr +2qr = p2(a1a1) + q2(a2a2) + r2(a3a3) + 2pq(a1a2) + 2pr(a1a3) + 2qr(a2a3)3.影响遗传平衡定律的因素迪-温伯格定律是对于一个理想群体而言的，遗传平衡定律是对基因在理想群体中的遗传行为的阐述。严格说来，在自然界中是
11、不存在这样的理想群体的，正象气体定律中的“理想气体“不存在一样。在自然界的生物群体中，妨碍按照这个定律达到预期平衡状态的各种因素在不断地起作用，其结果是导致群体的遗传组成发生改变，从而也引起生物的进化。需要注意的是，对于每一种改变平衡的动力总是有另一种使平衡回复的相反动力与之抗衡，因为这种保守因素总是力图维持原有的平衡，因此一个活的群体永远处在这两种相反力量的抗衡中。因此本章所要讨论的问题就是当所规定的各种不同的理想条件不存在时，群体中的基因频率和基因型频率所发生的改变。下面我们着重讨论在四种进化因子(突变、自然选择、迁移、基因漂变)的作用下，群体的基因频率是如何发生改变的。在有突变的情况下群
12、体中基因频率的改变1虽然基因突变是所有遗传变异的最终来源，但是它发生的频率是非常之低的，它对群体遗传结构的改变非常缓慢，可以说，如果仅仅只有突变改变遗传结构，那么生物的进化基本上是可以忽略的。在群体中引入突变的情况下，我们仍旧假定这是一个无限大的随机交配群体，并且没有自然选择。例如常染色体上有一对等位基因 A1和 A2，A 1基因的频率为 p0，每代 A1突变为 A2的突变率为 u。那么一代后 A1的频率 p1 = p0up 0 = p0(1u)；二代后 A1的频率 p2 = p1up 1 = p1(1u) = p0(1u) 2；t 代后 A1的频率将是 pt =p0(1u) t。由于 1u
13、小于1，因此随着 t的增加，p t值越来越小，当这一过程无限延续下去时，则基因 A1的频率最终变成 0，这是因为每一代都有 u的 A1变成 A2的缘故。尽管如此，这种变化的频率还是非常之低的，例如，以真核生物典型的突变率 u = 105 为例，经历 1,000代后基因 A1的频率仅从 1.00变为 0.99；2,000 代后基因频率从0.50到 0.49；以及 10,000代后基因频率仅从 0.10到 0.09。通常，随着 A1频率的减少，使其频率降低某一确定数值(如上面的 0.01)所需的时间更长。上述只有正向突变而无回复突变的情况可以应用在某些突变中，如一条染色体会以一定的速率产生倒位从而
14、导致基因重排，但基因一旦发生重排，回复到原来的顺序是几乎不可能的。但基因突变经常是可逆的，即 A2可能回复突变成为 A1。假设 A2可能回复突变成为 A1的回复突变率为 v，在基因 A1的频率为 p0时，基因 A2的频率为 q0，那么繁殖一代后，基因 A1的频率变为：p 1 = p0up 0 + vq0。如果基因 A1的频率改变用 Dp表示，则：D pp 1p 0(p 0up 0 + vq0)p 0vq 0up 0。在这种情况下，每一代中共有 p0u的 A1突变为 A2，有 q0v的 A2突变为 A1。若p0uq0v，则基因 A2的频率增加；若 p0uq0v，则基因 A1的频率增加；若 p0u
15、q 0v，即 Dp等于 0，即基因频率没有净改变时，这时正向突变和反向突变之间存在一种平衡，如果用 和 代表平衡等位基因的频率，则：u = v 。在平衡时，等位基因 A2是 A1的 10倍。但是由于从 A1到 A2的突变也是从 A2到 A1的突变的 10倍，因此每个方向的突变总数是相同的。更进一步地说，当 0.09时，尽管 u是v的 10倍，基因 A1的频率还是增加的，这是因为 Dpvq 0up 0，它既与基因频率有关，也与突变率有关。由上可见，突变对基因频率的改变是一个独立的因素，只要知道了突变率，就能预知其引起等位基因频率改变的方向和速率。由于相反方向所导致的平衡只依赖于突变率而与起始基因
16、频率无关，这与哈迪-温伯格定律不同。在这里有两点还需要强调一下，第一点是当正向和回复突变都存在时比仅仅只有一个方向的突变时，基因频率的改变要更慢一些，因为回复突变部分抵消了正向突变的作用，这再次强调通过突变本身来达到基因频率的大的改变是一个相当长的过程，群体很少能达到突变的平衡；第二点是另外一些因素如自然选择对基因频率的影响比突变要大得多，如人类软骨发育不全的侏儒症(achondroplastic dwarfism)是常染色体显性性状，虽然它是一种频发突变(recurrent mutation)，但人群中这种疾病的发生频率是由突变压(mutation pressure)和自然选择的相互作用所决
17、定的。在自然选择作用下群体中基因频率的改变2突变可以改变基因的频率，但这种改变是否增加或减少生物体对环境的适应却是随机的，所谓适应是指通过性状的演化使生物体更加适应环境的过程。自然选择(natural selection)过程是与生物的适应和高度的组织化的特性相关联的，因而自然选择是最重要的进化过程。进化不仅仅是各种生物体的发生和灭绝，而更重要的是生物与其生存环境相适应的过程，因为具有与环境适合较好的表型的个体在竞争中有更多的生存机会从而留下较多的后代。根据这一事实，自然选择作用是指不同的遗传变异体的差别的生活力(viability)和(或)差别的生殖力(fertility)。自然选择是达尔文
18、(C Darwin)于 19世纪中期提出的，他被誉为进化论之父(the father of evolutionary theory)。自然选择的本质就是一个群体中的不同基因型的个体对后代基因库作出不同的贡献，即带有某些基因型的个体比另一些基因型的个体具有更多的后代。这些基因在下一代中的频率得到增加，通过自然选择对生存和繁殖有利的性状逐代增加，生物以这样的方式来适应它们的环境。自然选择对遗传的影响是多方面的。有时自然选择可以剔除遗传变异，但另一些时候它又可以维持遗传变异；它既可以改变基因频率，也可以阻止基因频率的改变；它既可以使群体产生遗传趋异(genetic divergence)，也能维持群
19、体的遗传一致性(uniformity)。究竟发生哪种作用主要取决于群体中基因型的相对适合度和等位基因的频率。小群体中的随机遗传漂变对群体平衡的影响3在我们开始学习遗传学基本原理的时候就知道，对于理论遗传比率如3:1、1:2:1、9:3:3:1 等都是以一个相当大的样品为基础的，这种情况对于群体遗传学中基因频率和基因型频率的研究是同样重要的。在这之前所讨论的群体遗传平衡都是基于一个大的群体而言的，在大群体中，不同基因型的个体生育的子代数目虽有波动，但不会明显影响基因频率。但是如果在一个大小有限的群体，即在小的隔离群体中，基因频率会发生一种特殊的改变，这种改变与由突变、选择和迁移所引起的变化是完全
20、不同的。在一个小群体中，由于抽样的随机误差(chance errors)所造成的群体中基因频率的随机波动，称为随机遗传漂变(random genetic drift)。这是由群体遗传学家 S Wright于 1930年提出的，所以有时又称为莱特效应(Wright effect)。由于随机误差而产生的基因频率的改变在小的群体中是一种重要的进化的力量。设想在某个岛上住着只有由 10个人组成的人类最小群体，5 个人是绿眼睛，5 个人是棕色眼，假设眼睛的颜色是由单基因决定的(实际上眼睛的颜色是由多基因遗传的)，且绿色眼的等位基因 b对棕色眼的等位基因 B是隐性的，该群体中绿眼等位基因的频率是 q =
21、0.6，眼色绝不会影响存活的概率。在一次台风袭击后，群体中 50即 5位居民死于风暴，正巧这死去的 5人全是棕色眼，因此台风之后这个岛上绿色基因的频率变为 1.0。在这次风暴中绿色眼的人都得以幸存完全出于偶然，其群体中绿眼基因的频率从 0.6变成 1.0完全是机会所造成的。如果设想这个群体不是 10人，而有 1,000人，群体中也是 50是绿色眼，50棕色眼，同样一次台风袭击有一半人死于灾害，若死亡是随机的，那么在这个群体中，正好死亡的都是棕色眼的概率是极小的。这个例子说明了遗传漂变的一个重要特点：偶然因素只能在很小的群体中使基因频率发生改变。在自然群体中偶然产生的死亡率(如前面例子中的台风)
22、仅是产生遗传漂变途经中的一种。与预期的配子和合子比例的偶然偏差也会导致遗传漂变的产生。例如将一个杂合子和一个纯合子杂交(Aa aa)，预期后代中 Aa:aa为 1:1，但我们不能预期每次的结果都是精确的 1:1。若后代的数目比较小，那么获得的实际比例可能和预期值产生较大的偏差。如果由于偶然性，后代的实际数与预期比例存在偏差，那么基因型频率可能就不符合哈迪-温伯格比例，结果，基因频率就可能发生改变。结果与预期比之间的随机偏差称为取样误差(sampling errors 或 sampling variation)。遗传漂变是取样误差的一个特例，取样误差的程度与样本的大小成反比，样本愈小，基因频率的
23、随机波动愈大；样本愈大，基因频率的随机波动愈小。需要注意的是，对于生物而言，有效群体大小(effective population size)是由能够产生下一代的亲本数目决定的，而不是群体内的个体总数，群体中生殖的个体越少，遗传漂变引起等位基因频率的变化往往越大。小群体中的随机遗传漂变对群体平衡的影响对于取样误差与样本大小的反比关系是容易理解的，这与掷硬币的情况相类似。当掷硬币时我们预期 50%是正面，50是反面，如果仅仅只掷一次，虽然正面的概率仍为 50%，但我们要么 100%得到正面，要么根本得不到；如果掷 10次全部都出现正面的话，我们就会觉得奇怪，相反出现 6次正面，4 次反面则很正常
24、，在这种情况下，出现正面的频率是 0.6而不是 0.5；如果掷 1000次全部都出现正面的话，我们就会对这个硬币产生极大的怀疑，哪怕是出现 600次正面，400 次反面都会怀疑，虽然在这种情况下，出现正面的频率与掷10次时的 0.6一样，但是，对出现 504次正面、496 次反面即出现正面的频率为 0.504的结果，我们是可能接受的。这个掷硬币的例子说明随着样本的增大，取样误差越来越小，如正面出现的频率从 1(掷 1次)、0.6(掷 10次)到 0.504(掷 1000次)，逐渐接近预期值0.5。对于群体来说也是如此，产生后代的个体数越多，预期等位基因频率与实际等位基因频率越接近。但是掷硬币与
25、遗传漂变有一个重要的差别。在掷硬币中，无论前面的结果如何，下一次出现正面的概率都是 0.5；但在群体中，一个已知样本中的等位基因频率将成为下一个样本中出现这个等位基因的概率，如果在某一代中等位基因的频率从 0.5改变为 0.6，那么在下一代中获得等位基因的概率就变成了 0.6，因此等位基因频率的改变是一代代累加的。然而，由于遗传漂变的方向是随机的，只要等位基因的频率不变成 0或 1，这种改变是可以逆转的 (图 12-5，点击查看)，即在每代中基因频率可能增加或减少，从而使逐代频率随机波动和漂变。图 12-5表示 3个不同大小的群体由于遗传漂变所造成基因频率变化的计算机模拟结果：各群体的起始基因
26、频率都是 0.5，在有效群体大小 N25 时，经过 42代的随机交配，基因 A即固定下来，等位基因 a则消失；如果在一个 N250 的群体中，即使经过 100代的随机交配基因 A和 a都不会固定，也没有消失；在 N2500 的群体中，基因A和 a的频率在每代中的波动都较小，等位基因 A和 a永远不会固定或消失。遗传漂变在小群体中特别有效，它可以掩盖、甚至违背选择所起的作用，即使选择不利于一个等位基因，这个等位基因也会由漂变而建立和固定，只要它不是不利到导致携带者死亡。相反，选择对有利的等位基因在选择还没有充分表现出它的效应之前就会被漂变所淘汰。然而只要一个基因从群体中消失了(p0)或是被固定了
27、(p1)，在以后的世代中，除非由突变产生新的等位基因或由迁移重新引入，其基因频率不再发生变化。当一个新的群体只由少数个体建立起来时，它们的基因频率就决定了其后代中的基因频率，这种效应就称为奠基者效应(founder effect)，虽然群体随后可以增大，但群体的基因库源自于最初建立时存在的基因。另一种称为瓶颈效应(bottleneck effect)的现象与奠基者效应相类似，它是指当一个群体的大小发生戏剧性的骤减时，某些基因可能从基因库中消失，然后由存活的少数个体重新建立一个新的群体，刚好这存活的少数个体并不具有典型的原群体结构，因此新群体与发生变化前的群体结构是不同的，基因频率于是发生了改变
28、，前面讲的由于飓风使 10个人的群体中的绿眼基因频率从 0.6变成 1就是这种情况。奠基者效应和瓶颈效应这两种情况都是由为数不多的个体所建立起来的新群体，是一种极端的遗传漂变作用。进化因子对群体遗传平衡影响的总结4以上我们主要讨论了几种重要进化因子对群体中基因频率改变、群体遗传歧化和群体中遗传变异的增加或减少的影响。突变、自然选择、遗传漂变和迁移都具有改变群体基因频率的潜力。然而，由于发生突变的频率通常很低，它对基因频率的改变是微不足道的；遗传漂变虽可产生大的基因频率改变，但它只在小的群体中才会发生。更进一步地说，突变、自然选择、和迁移可能导致群体的遗传平衡，这时基因频率虽不再发生改变，但进化
29、的力量是继续存在的。另外，很多群体对于某些性状而言并不是随机交配的，如人类高矮性状的婚配，这种非随机交配(nonrandom mating)并不改变基因频率，但它却会影响群体的基因型频率：近交导致纯合子的增加，杂交导致杂合子的增加。有些进化因子导致群体间的遗传歧化(genetic divergence)。因为遗传漂变是一个随机的过程，在不同群体中的基因频率可能向不同的方向漂变，因此遗传漂变能产生群体间的遗传歧化。迁移则具有刚好相反的作用，它可以增加有效群体的大小以及使群体间的基因频率均化。如果在小群体中，不同的群体产生不同的突变，因此，突变也可导致群体分化(population differe
30、ntiation)。自然选择既可以通过对不同群体的不同等位基因进行选择来增加群体间的遗传差异，也可以通过对一致群体中基因频率的保持从而阻止遗传歧化。非随机交配自身并不能产生群体间遗传差异，但它可以通过增加或减少有效群体的大小(如自交或近交不育、杂种优势等)对其它进化因子产生影响。基因流和突变由于能够使基因库中产生新的等位基因，因而它们倾向于增加群体的遗传变异。遗传漂变则产生相反的效应，在一个小群体中通过等位基因的丢失使遗传变异减少。由于近交增加纯合性，它也可以减少群体间的遗传变异；相反，由于杂交增加杂合性，它使群体间的遗传变异增加。自然选择可以增加或减少遗传变异，如果某个等位基因更有利，通过选
31、择可使群体中的另一等位基因减少甚至消失，自然选择也可以通过超显性(overdominance，即杂合子比纯合子的适应性更强，如前面提到的人类镰形细胞贫血的例子)或其它形式的平衡选择使群体的遗传变异增加。在实际中，这些进化因子并不是孤立地起作用的，而是以一种复杂的方式组合和相互作用的。在大多数自然群体中，这些因子的组合效应(combined effects)和它们的相互作用就决定了基因库中遗传变异的方式。三、 【材料】仪器、设备：恒温培养箱（一台） 、培养瓶（若干） 、双筒解剖镜、高压蒸汽灭菌锅（一台） 、棉花塞（若干） 、烧杯（500ml 两个、250ml 四个） 、玻璃棒（两根） 、铁架台（
32、一架） 、电子天平（一台） 、药匙（一至两个） 、称量纸（若干） 、电炉（一台） 、石棉网（一张）毛笔（一只） 、白板纸试剂：乙醚材料： 1. 黑腹果蝇 ( Drosophila melanogaster ) 的两个品系： 野生型：长翅果蝇 (+ +) 突变型：残翅果蝇 (vg vg) 野生型果蝇的双翅为长翅 (+ +) ，翅长超过尾部。残翅果蝇 (vg ， g) 的双翅几乎没有，只留少量残痕，无飞翔能力。灰体果蝇（+/+）和黑体果蝇 （e/e） 黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)品系,野生型红眼 (+)和突变型白眼 (white eye,w).决定黑腹果蝇红眼和白眼
33、的基因位于 X染色体上,是一对等位基因.2. 玉米粉、糖、酵母粉、琼脂等四、 【实验前思考】1.为什么选择果蝇来进行遗传平衡定律的验证？我们之所以选择果蝇做遗传平衡定律验证的“工具” ，主要有一下几点原因：1）首先是饲养容易，用一只牛奶瓶，放一些捣烂的香蕉，就可以饲养数百甚至上千只果蝇。2）第二是繁殖快，在 25左右温度下十天左右就繁殖一代，一只雌果蝇一代能繁殖数百只。孟德尔以豌豆为实验材料，一年才种植一代。3）果蝇只有四对染色体，数量少而且形状有明显差别；4）果蝇性状变异很多，比如眼睛的颜色、翅 膀 的形状等性状都有多种变异，这些特点对遗传学研究也有很大好处。5）果蝇作为实验材料比价廉价，不
34、会浪费资源。2、培养基的防霉因为酵母菌与霉菌生活环境相似，均为 pH4560。所以在培养基的配制、酵母液的制备乃至转管时瓶塞的取放等每一个细节都要按无菌操作的基本要求去完成，防止霉菌的污染。对于已经被霉菌大量污染的培养基应及时倒掉，不宜再用。3、培养的温度温度对果蝇的生长发育繁殖至关重要。果蝇生活的最适温度为 2025。当温度降至0 以下时，生活周期延至 57 d以上，生活力明最降低而高于 30时引起不育和死亡。因此，选培养箱培养最为妥当。4、保证果蝇种系的纯正要想保证遗传学实验的杂交测试不受干扰一定要保证亲本果蝇的纯正。如发现有从瓶中逃逸者，必须捕杀。并且经常对亲本果蝇进行性状检查排除杂交者
35、或突变者。5、酵母菌的选择以往常常使用干酵母片，但其菌体活力较差难以大量繁殖。现在改用发酵面包专用活性酵母粉来制备酵母菌液，效果较好。五、 【方法】（一）果蝇饲料的配制果蝇是以酵母菌作为主要食料的，因此实验室内凡能发酵基质，都可用作果蝇饲料。常用的饲料有玉米饲料、米粉饲料、香蕉饲料等。配方如下表：果蝇饲料的几种配方玉米饲料 米粉饲料 香蕉饲料水（毫升）琼脂（克）蔗糖（克）香蕉浆（克）玉米粉（克）米粉（克）麸皮（克）酵母粉（克）丙酸（毫升）2001.513171.41100210881.41501.6501.40.511）玉米饲料：i)取应加水量的一半，加入琼脂，煮沸，使充分溶解，加糖，煮沸溶解
36、。ii)取另一半水混和玉米粉，加热，调成糊状。iii)将上述两者混和，煮沸。以上操作都要搅拌，以免沉积物烧焦。iv）待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，分装。按附表用量配制，可得饲料200毫升左右。2）米粉饲料：i)取应加水量的一半，加入琼脂，煮沸，使充分溶解，加糖，煮沸溶解。ii)取另一半水混和米粉，加热，调成糊状。iii)将上述两者混和，煮沸。以上操作都要搅拌，以免沉积物烧焦。iv）待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，分装。按附表用量配制，可得饲料200毫升左右。3）香蕉饲料：i)将熟透的香蕉捣碎，制成香蕉浆。ii)将琼脂加到水中煮沸，使充分溶解。iii)将琼脂溶液加入香蕉浆，煮沸。iv）
37、待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，分装。注释：丙酸的作用是抑制霉菌污染，用量参照附表，每200毫升饲料约加1毫升左右。如无酵母粉，也可用酵母液代替，但用法不同。若用酵母菌液则在饲料分装到培养瓶中以后再加入，每瓶加数滴。（二）培养基进行灭菌高压蒸气灭菌锅的温度为121，灭菌1520分钟。培养基常用高温高压（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121）蒸气灭菌的方法，灭菌时间应根据培养瓶体积大小及其内培养基容量多少而定（见表4） 。体积和容量越大，所需灭菌时间就越长。空试管、空三角瓶和滤纸要在130下灭30分钟或121灭60分钟。注意事项及解释说明：空的培养容器不应同盛装培养基的培养容器一起
38、高压蒸气灭菌，不同体积培养容器或盛装不同容量的培养基也不能一起高压蒸气灭菌，而应该分别进行。因为热穿透力是一个需要考虑的因素，体积大的培养容器需要较长的时间灭菌，是因为热量穿透大体积培养基要比体积小的花更多的时间。利用高压蒸气灭菌锅进行灭菌具有简单、快速，并且可以附带杀灭病毒又不吸收的优点（与过滤灭茵比较） 。其缺点是会引起 pH值的变化、发生化学变化和引起某些化合物的分解，使得某些培养基成分的活性丧失。高压蒸气灭菌会引起以下物质分解：蔗糖（分解为葡萄糖和果糖） 、秋水仙素、玉米素（核甙） 、赤霉酸（90%会丧失反应活性）维生素 B1、B12、C 和泛酸、抗生素、酶、植物提取液（活性丧失） 。
39、所以，原生质体培养用培养基应采用过滤法灭菌。（三）收集雌果蝇品系的处女蝇。可在实验前 2-3 天陆续收集，雌雄个体分开培养数目多少根据需要而定。雌蝇的生殖器中有贮精囊，可保留交配所得的大量精子，雌蝇一次交配所得的精子，足够它多次排出的卵受精，因此在做杂交试验时，雌蝇必须选用处女蝇（没有交配过的雌蝇） 。一般来说，刚羽化出来的果蝇在 12 小时之内是不进行交配的，所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见，可以在羽化后的 8 小时内挑选。因此，在杂交实验开始的一段时间内，各实验小组要根据自己的实验设计，精心挑选处女蝇。为了操作方便，可以在每天晚上 22 ： 00 23 ： 00 将培养瓶
40、内的成蝇杀死，次日早晨 8 ： 00 9 ： 00 对新羽化出的果蝇进行挑选。（四）果蝇的麻醉果蝇具有趋光性，并且喜欢向上爬。利用这些特性，我们就能很方便地将果蝇转移到麻醉瓶中进行麻醉。1. 轻拍培养瓶，使果蝇落于培养瓶底部；2. 右手两指取下培养瓶塞，将培养瓶与麻醉瓶紧密对接；3. 左手握紧两瓶接口处，倒转使培养瓶向上；4. 右手轻拍培养瓶将果蝇震落到麻醉瓶中；5. 分开两瓶，将瓶盖各自盖好；6. 将麻醉瓶的果蝇轻拍到瓶底，迅速拔出塞子，滴上几滴乙醚，重新塞上麻醉瓶，平放在桌面上；（不能将培养瓶竖立，以免果蝇落入培养基中不便取出）7. 半分钟后，观察果蝇，不再爬动，并在瓶壁上站不稳，麻醉完成
41、。注意不能麻醉过度，如果果蝇的翅膀与身体呈45 角翘起，表明麻醉过度，不能复苏而死亡。补救措施：如果蝇在观察中苏醒过来，可用一平皿，内贴一带乙醚的滤纸条，罩住果蝇进行麻醉补救；（五）接种选择的处女蝇即为亲代果蝇1、前期准备：从“果蝇形态与生活史的观察”实验中选择红眼、白眼、长翅、残翅、灰体、黑体果蝇若干。从中选出同一性状果蝇 10只放入另一培养瓶内进行杂交。选取子代健壮的个体作为实验的亲本。2、处女蝇的选取：一般来说，刚羽化出来的果蝇在 12h之内是不进行交配的，所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见，在羽化后的 8h内挑选。为了操作方便，我们可以在每天晚上 22：0023：00
42、将培养瓶内的成蝇杀死，次日早晨 8：009：00 对新羽化出的果蝇进行挑选，并移入处女蝇瓶中保存备用。在选取处女蝇的同时也选出了雄性果蝇。3、准备好培养基，按正反交组合，各挑选 10只已麻醉好的红眼（处女蝇）X 白眼、和红眼X 白眼（处女蝇），长翅（处女蝇）残翅和残翅（处女蝇）长翅，灰体（处女蝇）黑檀体和 黑檀体（处女蝇）灰体分别放入一个大的培养瓶（亲本瓶）进行杂交4、在培养瓶上贴好标签，注明杂交内容、日期、实验组号等，然后将培养瓶放入 25的培养箱内进行培养5、将上述培养瓶放入 25的恒温培养箱中培养。注：接种前往培养瓶内放一张折叠的灭过菌的吸水纸。 （作用：a 吸收瓶内多余的水分 b有利于
43、果蝇的产卵 c扩大幼虫的活动范围 d有利于蛹的发育） （六）F 1代实验：1、从以上杂交中各选择同一性状的雌雄个体各 10只(红眼X 白眼和红眼X 白眼，长翅残翅和残翅长翅，灰体黑檀体和 黑檀体灰体)分别放入一个大的培养瓶进行培养，都进行正反交，贴上标签，注明时间，接种量，交配方式，性状。每种性状 23瓶。 （此处无需处女蝇）2、在接种后 12天内对培养瓶内的果蝇进行观察，对雌雄比例严重失调或者大部分死亡的培养瓶进行重新的接种。记录好时间，数量以及果蝇的具体生长情况。3、待接种果蝇数目恒定后，每天进行观察，并记录时间、温度、以及果蝇的生长情况。4、67 天后有幼虫及蛹出现，将亲本果蝇放入另一个
44、空培养瓶内，记录并将其处死。 （一定要除干净！）5、待培养瓶内出现 F1带果蝇成虫时连续观察 56 天，并分别记录好正常翅和残翅、红眼与白眼、灰体与黑体的雌雄果蝇的只数（正反交） 。计算此时群体中正常翅和残翅、红眼与白眼、灰体与黑体基因的频率。（七）F 2代实验：1、从 F1代第一次羽化的果蝇中选择本实验观察的性状明显的个体作为 F2代的亲本各 10只(红眼X 白眼和红眼X 白眼，长翅残翅和残翅长翅，灰体黑檀体和 黑檀体灰体)分别放入一个大的培养瓶进行培养，都进行正反交，贴上标签，注明时间，接种量，交配方式，性状。每种性状 23瓶。观察、计数。2、以下步骤同 F1代步骤得到 F2的结果。（八）
45、F 3、 F 4、F 5代实验重复 F1代实验 1至 5步骤直至记录到 F2、F 3、 F 4、F 5（九）进行数据归类、卡平方测验、结果分析、结论。六.【数据记录】表 1、F 1代 A组合: 长翅残翅和 B组合: 残翅长翅数据表C组合: 长翅残翅 D组合: 残翅长翅长翅 残翅 长翅 残翅观察日期 合计表 2.F1代 C组合: 灰体黑檀体和 D组合: 黑檀体灰体数据记录表E组合 : 灰体 黑檀体 F组合: 黑檀体灰体观察日期 灰体 黑檀体 灰体 黑檀体合计表 3:F1代 E组合: 红眼白眼和 F组合: 白眼红眼数据统计表:E组合: 红眼白眼 F组合: 白眼红眼红眼 白眼 红眼 白眼观察日期 合
46、计表 4：F 2代 A组合: 长翅残翅和 B组合: 残翅长翅数据统计表C组合: 长翅残翅 D组合: 残翅长翅长翅 残翅 长翅 残翅观察日期 合计表 5：F 2代 E组合: 灰体黑檀体和 D组合: 黑檀体灰体数据统计表E组合 : 灰体 黑檀体 F组合: 黑檀体灰体观察日期 灰体 黑檀体 灰体 黑檀体合计表 6：F2 代 E组合: 红眼白眼和 F组合: 白眼红眼数据统计表:E组合: 红眼白眼 F组合: 白眼红眼红眼 白眼 红眼 白眼观察日期 合计七.【结果分析】A.果蝇的长翅（+）和残翅（vg）遗传平衡的验证表 16.F1F 2残翅和长翅数据归总表观察 代数 各类果蝇数目长翅 残翅F1F2:分析一
47、对基因在杂合状态中保持相对的独立性，而在配子形成时，又按原样分离到不同的配子中去。理论上配子分离比是 1:1，子二代基因型分离比是 1:2:1，若显性完全，子二代表型分离比是 3:1。果蝇的长翅（+）和残翅（vg）是一对相对性状。它们是位于常染色体上的一对等位基因。野生型果蝇的双翅是长翅，（+/+）翅长过尾部。残翅果蝇（vg/vg）的双翅几乎没有，只有少量残痕，无飞翔能力。vg 的座位是第二染色体 67.0。长翅对残翅显性完全。交配方式：用长翅果蝇与残翅果蝇交配，得到子一代都是长翅，子一代雌雄个体间相互交配，子二代产生性状分离，出现两种表型，呈 3:1之比。现以长翅雌蝇与残翅雄蝇交配为例P：
48、长翅（ ） 残翅（ ）+/+ vg/vgF1： 长翅 /vg . 相互交配F2： 长翅 残翅(1 +/+,2 /vg) (1 vg/vg)故如果在不受其他因素影响的条件下+：+vg：vgvg=1：2：1我们得到的实际数据中果蝇的显性纯合+和显性杂合+vg 的数量无法单独得知，我们测得的数据只是长翅这种基因控制的表型的数量，要知道显性纯合+和显性杂合+vg各自的数量，只能通过以上提出的三种基因型的比例（+：+vg：vgvg=1：2：1）从而推测出它们各自的数量。在配子形成时， vg这个基因只能出现在两种配子中，即+vg ,vgvg中，我们很容易得知隐形纯合 vgvg的数量，如果它实际的数量比理论值多，则说明多出来的果蝇数目既是显性杂合+vg表 17：F 2残翅和长翅实际数目分析表长翅+ 长翅+vg 残翅 vgvg 总数理论比值理论数目实际数目表 23：F 2灰体黑体实际数目分析表灰体+ 灰体+e 黑体 ee 总数理论比值 1 2 1理论数目 77 154 77 309实际数目 78 156（154+2） 75 309C.白眼和红眼遗传平衡的验证表 29：红眼白眼和 B组合: 白眼红眼合并 F1F 5白眼和红眼的只数结果统计表:各类果蝇数目观察 代数 红眼 红眼 白眼 白眼F1 4
