1、小鼠(Mouse) FMS 样酪氨酸激酶 3(Flt-3)ELISA 检测试剂盒本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆试验原理：Flt-3 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知 Flt-3 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将 Flt-3 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的 HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物 A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中 Flt-3 的浓度呈比例关系。试剂盒内容及其配制试剂盒成份(2-8保存) 96 孔配置 48 孔配置 配制96/48 人份酶标板 1 块板(96T
2、) 半块板(48T) 即用型塑料膜板盖 1 块 半块 即用型标准品：400nmol/L 1 瓶(0.6ml) 1 瓶(0.3ml) 按说明书进行稀稀空白对照 1 瓶(1.0ml) 1 瓶(0.5ml) 即用型标准品稀释缓冲液 1 瓶(5ml) 1 瓶(2.5ml) 即用型生物素标记的抗 Flt-3 抗体 1 瓶(6ml) 1 瓶(3.0ml) 即用型亲和链酶素-HRP 1 瓶(10ml) 1 瓶(5.0ml) 即用型洗涤缓冲液 1 瓶(20ml) 1 瓶(10ml) 按说明书进行稀释底物 A 1 瓶(6.0ml) 1 瓶(3.0ml) 即用型底物 B 1 瓶(6.0ml) 1 瓶(3.0ml)
3、 即用型终止液 1 瓶(6.0ml) 1 瓶(3.0ml) 即用型自备材料1 蒸馏水。2 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3 振荡器及磁力搅拌器等。安全性1 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。操作注意事项1 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4 使用一次性的吸头以免
4、交叉污染，吸取终止液和底物 A、B 液时，避免使用带金属部分的加样器。5 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。7 底物 A 应挥发，避免长时间打开盖子。底物 B 对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取 OD 值。8 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。9 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。样品收集、处理及保存方法1、 血清-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000g 离心 10分钟将血清和
5、红细胞迅速小心地分离。2、 血浆-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000g 离心 30 分钟去除颗粒。3、 细胞上清液-1000g 离心10 分钟去除颗粒和聚合物。4、 保存-如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在 37或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。试剂的准备1 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：400 nmol/L (6 号标准品) 原倍浓度不用稀释直接加入 50ul。200 nmol/
6、L (5 号标准品) 100ul 的原倍标准品加入 100ul 的标准品稀释液100 nmol/L (4 号标准品) 100ul 的 5 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液50 nmol/L (3 号标准品) 100ul 的 4 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液25 nmol/L (2 号标准品) 100ul 的 3 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液12.5 nmol/L(1 号标准品) 100ul 的 2 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液0 nmol/L (空白对照) 原始浓度不用稀释直接加入 50ul。2 洗涤缓冲液(50)的稀释：蒸馏水 50 倍稀释。操作步
7、骤1 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。3 加入稀释好后的标准品 50ul于反应孔、加入待测样品 50ul 于反应孔内。立即加入 50ul 的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育 1 小时。4 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。5 每孔加入 80ul 的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37
8、温育 30 分钟。6 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。7 每孔加入底物 A、B 各50ul，轻轻振荡混匀，37温育 10 分钟。避免光照。8 取出酶标板，迅速加入 50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。9 在 450nm 波长处测定各孔的OD 值。建议使用的实验方案标准品浓度(nmol/L)A 400 400 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品B 200 200 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品C 100 100 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品D 50 50 样品样品样
9、品样品样品样品样品样品样品样品E 25 25 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品F 12.5 12.5 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品G 0 0 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品H 样品 样品 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品局限6 号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。试剂盒性能1. 灵敏度：最小的检测浓度小于 1 号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990。2. 特异性：不与其它细胞因子反应。3. 重复性：板内、板间变异系数均小于 10%。结 果 判 断 与 分 析1、仪器值：于波长 450nm 的酶标仪上读取各孔的 OD 值2、以吸光度 OD 值为纵坐标(Y)，相应的 Flt-3 标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的 Flt-3 含量可根据其 OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。3、检测值范围：0-400nmol/L4、敏感度： 1.0 nmol/L
