1、设备培训-高效液相色谱,2013.05.14,概述,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。,色谱原理,色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同在固定相中滞留时间不同从而先后从固定相中流
2、出。又称为色层法、层析法,高效液相色谱仪,高效液相色谱仪的结构：一般可分为5个主要部分：高压输液系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统、数据处理系统。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,一、高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液装置、脱气装置、高压输液泵、过滤器等组
3、成，其中高压输液泵是核心部件。输液泵分为恒流泵和恒压泵两种，但是目前恒流泵已经基本取代了恒压泵。1、输液泵应具备性能:A、流量稳定，其变异系数应小于0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；B、流量范围宽，分析型应该在01-10mL/min范围内连续可调，制备型应能达到100mL/min；C、输出压力高，一般应能达到150-300kgf/cm2（kgf/cm2=98.0665kpa）；D、液缸溶剂小；E、密封性好，耐腐蚀。,2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相
4、不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定。,二、进样系统,高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外
5、展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 1、进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱柱系统的压力、流量影响小。2、进样方式：隔膜泵进样、停留进样、阀进样、自动进样。,三、 色谱分离系统,色谱分离系统包括：色谱柱、固定相和流动相。其中，色谱柱是其核心部分。1、色谱柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料
6、的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。2、色谱柱的类型色谱柱按照用途分为分析型和制备型两类。a、常规分析柱（常量柱）一般色谱柱长1030cm，内径为25mm（常量4.6mm，国内有4mm和5mm），凝胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。b、窄径柱（细管径柱、半微量柱）柱长1030cm，内径12mm,c、毛细管柱（微柱）内径0.20.5mm d、半制备柱，内径5mm。 e、实验室制备柱，柱长10 30cm，内径20 40mm f、生产制备柱，内径可达几十厘米。 注：一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固
7、定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。,3、色谱柱的使用和注意事项,A、避免温度和压力的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下会影响柱内的填充情况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流量时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。 B、应逐渐改变溶剂组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改为全部是水，反之亦然。 C、一般情况下色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱内杂质，否则反冲会迅速降低柱效。 D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱，分析柱
8、是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。,E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以经常更换。,F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接头拧紧，防止溶剂会发干。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内，静置过夜或更长时间。 H、色谱柱使用过程中，如果压力升高，可能的原因有：色谱柱进口过滤芯被污染、冲洗阀过滤芯被污染、色谱柱被污染、连接管路的毛细管堵塞、进样器转子上的凹槽被污染、进样针或
9、针座被堵塞。若发现压力升高，进行分段检查，排除故障。,四检测系统,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:,（l）可变波长测器 （2）荧光检测器 (3) 示差折光率检测器几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 （4）二极管阵列检测器性能/优点：灵敏度高、
10、有四种类型的DAD模块选择、具有1024个二极管和可变狭缝、可根据需要选择不同的流动池、可进行自动峰检索、利用紫外谱图可进行色谱峰定性。(5)蒸发光散射检测器,日常维护,常见色谱故障-基线噪音 可能原因:a、检测池脏b、检测池灯能量下降c、由泵引起的脉冲d、检测器上的温度效应e、检测其中有气泡通过 常见色谱故障-基线漂移 可能原因:a、梯度洗脱所用溶剂有吸收b、流动相脏c、色谱柱没有用流动相平衡d、系统中污染物溢出e、实验温度不稳定,常见色谱故障-鬼峰常见原因是流动相脏，尤其是水相。要求使用超纯水，最多两天就常见色谱故障-双峰可能原因：a、柱头塌陷或柱床运动b、柱前滤芯堵塞c、组分共流出d、样
11、品量过大f、进样器的进样流路存在分叉流路常见色谱故障-峰扩展可能原因：a、柱效降低或有柱塌陷b、进样体积过大c、流动相粘度大,常见色谱故障-拖尾峰 可能原因： a、柱效降低或有柱塌陷 b、进样体积过大 c、柱外扩散效应 d、碱性基质与硅羟基作用 e、重金属反应 常见色谱故障-前伸峰 可能原因： a、色谱柱过载 b、进样体积过大 c、大峰之前有未彻底分离的小峰 常见色谱故障-负峰 可能原因： a、样品吸收比流动相吸收小 b、溶解样品的溶剂通过色谱柱平衡被破坏 c、示差检测器中最常见，溶质的折光指数小于 溶剂的折光指数。,常见色谱故障-压力过高可能原因： a、色谱柱进样口过滤芯被污染b、冲洗阀过滤芯被污染c、色谱柱被污染d、连接管路的毛细管堵塞e、进样器转子上凹槽被堵塞f、进样针或针座被阻塞常见色谱故障-压力过低可能原因： a、溶剂进样口过滤芯堵塞b、连接管路泄漏c、溶剂或流速改变d、主动阀失灵、四元比例阀失灵或单向阀失灵e、色谱柱失效（固定相流失）,
