1、大花君子兰总生物碱抗肿瘤作用的研究 *(20 黑体)于妮娜，包海鹰 *，何忠梅(4 号仿宋)吉林农业大学中药材学院，长春 130118 （号楷体）摘 要（小五黑体）：采用 MTT 法观察大花君子兰总生物碱（简写为 TACMR）对体外培养的人肺癌细胞 NCI-H446、人胃癌细胞 SGC-7901、人乳腺癌细胞 MCF-7 和人肝癌细胞 SMMC-77214 种细胞株的增殖抑制作用；用小鼠移植性肿瘤法检测 TACMR 对小鼠 H22 肝癌的生长抑制作用，并通过脾指数和胸腺指数等指标综合考察 TACMR对肿瘤小鼠免疫机能的影响。体外 MTT 结果显示：TACMR 对 NCI-H446、SGC-79
2、01 、MCF-7 和 SMMC-7721 均具有明显的细胞增殖抑制作用，且均呈现良好的量效关系，并且 TACMR 作用于 4 种不同人肿瘤细胞 48 h 的 IC50值分别为 38.55，12.08，8.85，7.04 g/mL；体内试验结果表明， TACMR 对 H22 肝癌生长具有一定的抑制作用。TACMR 剂量在 34 mg/kg 时，抑瘤率为 35.2%，脾指数与阳性对照组相比显著增加（P0.01） 。TACMR 剂量在136 mg/kg 时，抑瘤率仅为 3.7%，与阴性对照组比较，胸腺指数和脾指数明显减少（P0.01） ，与阳性对照组比较，胸腺指数明显减少（P0.01） 。上述体内
3、外试验结果表明 : TACMR 具有抗肿瘤作用，同时对免疫功能有一定的影响。 （.仿宋）关键词（小五黑体）：大花君子兰；总生物碱；MTT 法；H 22 荷瘤小鼠 （.仿宋）中图分类号（小五黑体）： 文献标识码（小五黑体）：A 文章编号（小五黑体）：1000-5684(2011)DOI（小五黑体）: 网络出版地址（小五黑体）：Anti-Tumor Effect of Total Alkaloids from Clivia miniata Regel （小三号Times New Roman 加粗）YU Ni-na ， BAO Hai-ying，HE Zhong-mei（号 Microsoft Jh
4、engHei）College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China（号 Times New Roman）Abstract（号 Arial）: In vitro, the inhibitory effects of total alkaloids from Clivia miniata Regel (TACMR) on proliferation of NCI-H446, SGC-7901, MCF-7, and SMMC-7721 were measured by
5、 MTT colorimetric assay. The inhibitory effects of TACMR on H22 hepatic cancer was observed in mice with subcutaneous inoculation on the tumor cells and its effect on immunological function of mice bearing tumor by observing the influence to spleen index, thymus index and so on. In vitro, the result
6、s of MTT showed that TACMR inhibited proliferation of NCI-H446, SGC-7901, MCF-7, SMMC-7721 and a good dose-effect relationship and the IC50 values on them were 38.55, 12.08, 8.85 and 7.04g/mL. In vivo, TACMR has significant inhibitory effect on H22 tumor cells. The inhibition ratio was 35.2% with th
7、e dosage of 34 mg/kg, compared with the positive control group, spleen index increased significantly (P0.01). The inhibition ratio was 3.7% with the dosage of 136 mg/kg, compared with negative control group, thymus index and spleen index decreased significantly(P0.01), compared with the positive con
8、trol group, thymus index decreased significantly(P0.01). In tumor inhibitory test, it was shown that TACMR has strong inhibition on tumor cells and certain impact on immunological function. （10 号 Times New Roman）Key words（号 Arial）: Clivia miniata Regel; total alkaloids; MTT; H22 tumor bearing mice（1
9、0 号 Times New Roman）大花君子兰（Clivia miniata Regel.）为石蒜科(Amaryllidaceae)君子兰属（Clivia）多年生常绿草本 植物，又名剑叶石蒜，大叶石蒜，达木兰。君子兰原产于南非，20 世纪初传入中国，我国栽培的品种吉林农业大学学 2011，03 http:/Journal of Jilin Agricultural University E-mail:* 基金项目（小五 黑体）：长春市惠宝君子兰科技养殖及药理活性研究项目（2010040101） （小五 宋体）作者简介（小五 黑体）：于妮娜，女，在读硕士，研究方向：生药学。 （小五 宋体）收
10、稿日期（小五 黑体）：2010-10-24 网络出版时间（小五 黑体）：* 通讯作者（小五 宋体）吉林农业大学学报 2011 年 03 月Journal of Jilin Agricultural University 2011 ，March以大花君子兰为主。吉林省长春市于 1984 年将君子兰定为长春市市花。君子兰含有生物碱类、花色苷类、黄酮类、氨基酸类、无机元素等多种化学成分 1-4。近年来的研究表明，君子兰水提液具有强心、抗心律失常作用 5-6。君子兰总生物碱具有抗菌、抗炎、抗氧化和保护肝肾的作用，同时可抑制小鼠肝癌实体瘤的生长 7-8。从根和叶中分离得到的石蒜碱，具有抗病毒、抗癌、抗寄
11、生虫和抗疟疾作用 9。目前，对 TACMR 体外抗肿瘤作用及体内抗肿瘤对免疫系统的影响研究报道甚少。本研究采用 MTT 法观察TACMR 对体外培养的人肺癌细胞 NCI-H446、人胃癌细胞 SGC-7901、人乳腺癌细胞 MCF-7 和人肝癌细胞 SMMC-7721 4 种细胞株的增殖抑制作用；用小鼠移植性肿瘤法检测 TACMR 对小鼠 H22 肝癌的生长抑制作用，并通过脾指数和胸腺指数等指标综合考察 TACMR 对肿瘤小鼠免疫机能的影响，为更好的开发利用大花君子兰资源以及临床应用等提供理论依据。 （10 号 宋体然后 Times New Roman）1 材料与方法（小四 黑体）1.1 供试
12、材料（五号 黑体）大花君子兰(Clivia miniata Regel.)，购自长春惠宝君子兰养殖基地，由吉林农业大学图力古尔教授鉴定。人肺癌细胞 NCI-H446、人胃癌细胞 SGC-7901、人乳腺癌细胞 MCF-7、人肝癌细胞 SMMC-7721 和小鼠 H22 肝癌瘤株，均由吉林省肿瘤医院提供。昆明小鼠，雌性，体重 202g，购于吉林大学实验动物中心。1.2 试剂与仪器CO2 培养箱（NAPCO 法国） ，酶标仪（芬兰 Lab systems 公司） ，注射用环磷酰胺 (CTX，山西普德药业有限公司，产品批号 20080602)，5-氟尿嘧啶（5-Fu，购于吉林省肿瘤医院） ，二甲基亚
13、砜 DMSO (Amersco)，胎牛血清（购于长春生物制品研究所） ，胰蛋白酶（购于上海化学试剂厂） ，四甲基偶氮唑盐（MTT， Sigma 公司） ，离心机（美国 SORVALL 公司） ，KX-21N 全自动血液分析仪（日本 SYSMEX 公司） 。1.3 TACMR 的制备取大花君子兰根粉末 1.5kg，用 95%乙醇 3 000mL 加热 60回流提取 8h，重复 3 次，合并提取液，过滤，减压浓缩至浸膏，然后用 0.01mol/LHCl溶解，静置 24h，取上清液，用等体积的氯仿反复萃取除去杂质，萃取后的酸水溶液用氨水调至 pH 10，用等体积的氯仿再次萃取，至与生物碱化学检识试剂
14、碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸反应均呈阴性。萃取液减压浓缩得黄色固体粉末，与生物碱化学检识试剂碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸反应均呈阳性，即为 TACMR，备用。 1.4 体外试验方法1.4.1 细胞培养 （五号 楷体） 将肿瘤细胞接种于含 10%胎牛血清、100U/mL 青链霉素的 RPMI-1640 培养液中，放入 37、5%CO 2 培养箱培养，待细胞进入对数生长期后用 0.25%胰蛋白酶消化传代培养。1.4.2 药物配制 受试药分 8 个浓度，依次为200，100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56g/mL；阳性药 5-Fu 浓度为 25gmL-1。1.4.3 MTT试验步骤
15、将细胞以 1105 个/mL 浓度接种于 96 孔板，每孔 100L，37、5%CO 2 饱和湿度培养 24h 后，按设计浓度加受试药，每个剂量 4个平行孔，每孔加药量 100L。再培养 72h 后，每孔加入 MTT 液 20L（浓度为 5gL-1） ，继续培养4h，弃去所有上清，每孔加 150L DMSO，微量振荡器振荡 10min，置酶标仪上测定各孔在 570nm 波长处吸光度值。细胞增殖抑制率（%）= (阴性对照组 A 值- 受试药组 A 值)/ 阴性对照组 A 值100。药物的半数抑制量 IC50=lg-1Xm-i(P-0.5) ，其中 Xm 为设计的最大浓度的对数值；i 为各浓度倍比
16、浓度的对数值；P 为各组生长抑制率之和；0.5 为经验常数。1.5 体内试验方法选择腹腔接种 68d 生长良好的 H22 肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水稀释成细胞个数为 1106/mL 的细胞悬液，接种于小鼠右腋皮下，每只 0.1mL。然后随机分成 6 组，即空白组，阴性对照组，阳性对照组，TACMR 高、中、低剂量组，即 136，68，34 mg/kg（相当于 LD50 的1/25，1/50，1/100） ，每组 10 只。次日开始每天灌胃给药 1 次，连续 12d。阳性对照组按 20mg/kg 浓度、每隔 1d 腹腔注射 CTX，体积为 0.1mL/10g。第 13
17、d颈椎脱臼处死小鼠，摘眼球取血 0.51.0 mL，抽取400L 血液，转移到真空抗凝管中，使用 KX-21N全自动血液分析仪对白细胞数进行检测。将取血后小鼠处死，摘取瘤块、胸腺和脾，分别称重并计算抑瘤率和脾指数、胸腺指数。肿瘤抑制率=（阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤重100%。胸腺指数为每克体重中胸腺的毫克数，脾指数为每克体重中脾脏的毫克数。1.6 统计方法 于妮娜等：大花君子兰总生物碱抗肿瘤作用的研究吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University测定指标采用 s 表示，所有数据由 SPSS18.0x统计软件进行 O
18、ne-Way ANOVA 分析，并计算相应的统计学参数。2 结果2.1 TACMR 对体外培养的 4 种不同人肿瘤细胞增殖的影响TACMR 对体外人肺癌细胞 NCI-H446、人胃癌细胞 SGC-7901、人乳腺癌细胞 MCF-7 和人肝癌细胞 SMMC-7721 均具有很强的细胞增殖抑制作用，并呈良好的剂量-效应依赖性。TACMR 作用于 4 种不同人肿瘤细胞 48h 的 IC50 值分别为38.55，12.08，8.85，7.04g/mL（图 1） 。01020304050607080901001.563.136.2512.5 25 50 100 200NCI-H446 SGC-7901S
19、MMC-7721 MCF-7浓 度 /gmL-1抑制率%InhibitoryratioConcentration2.2 TACMR 对 H22 肝癌荷瘤小鼠的体内肿瘤抑制 作用2.2.1 TACMR 对肿瘤生长的抑制作用 体内试验结果（表 1）显示，TACMR 对 H22 荷瘤小鼠肿瘤生长具有一定的抑制作用。阳性对照组与给药组的平均瘤重均低于阴性对照组。在给药剂量为 34mg/kg 时，抑瘤率为 35.2%，与阴性对照组相比，差异显著（P0.05）见表 2。表 2 TACMR 对 H22 荷瘤小鼠免疫器官的影响 (n=10)Table 2. Effects of TACMR on immune
20、 organs in H22 tumor bearing mice(n=10)组别Group剂量/(mgkg -1)Dose脾指数/(mgg -1)Spleen index 胸腺指数/(mgg -1) Thymus index白细胞数(10 9L-1)WBC空白组Blank group 4.300.03* 3.75 0.041 3.760.48阴性对照组Negative control group 7.160.11 3.310.011 0.590.66阳性对照组Positive control group 20 4.730.04* 2.730.012 0.900.86TACMR 136 4.2
21、70.07* 1.310.014* 0.620.80TACMR 68 6.060.05 1.560.014* 0.800.58图 1 MTT 法检测 TACMR 对 4 种不同人肿瘤细胞的增殖抑制率（小五 黑体）Fig. 1. Effect of TACMR on 4 different human tumor cells proliferated by MTT（小五 Arial Narrow）吉林农业大学学报 2011 年 03 月Journal of Jilin Agricultural University 2011 ，MarchTACMR 34 7.320.03 3.090.012 0
22、.970.23注：与阴性对照组相比“*”P0.05， “*” P 0.01；与阳性对照组相比“ ”P 0.05， “ ”P 0.01Note: Compared with negative control group “*” P 0.05, “*” P 0.01; compared with positive control group “”P 0.05, “”P 0.013 讨 论笔者采用 MTT 法观察了 TACMR 对体外培养的4 种不同人肿瘤细胞的增殖抑制作用，用小鼠移植性肿瘤法检测了 TACMR 对小鼠 H22 肝癌的生长抑制作用，同时观察了 TACMR 对肿瘤小鼠免疫器官的影响。通
23、过体外试验发现，TACMR 能显著抑制NCI-H446、SGC-7901、MCF-7、SMMC-7721 细胞的增殖，量效关系明显。一般情况下，当药物浓度10g/mL，其抑制率达到 50%以上时，药物对该肿瘤细胞株就会产生细胞毒作用 10。TACMR 在浓度为 6.25 g/mL 时，对 SGC-7901、MCF-7、SMMC-7721 细胞的抑制率已超过 50%，推测 TACMR 对肿瘤细胞具有较强抑制作用可能与其细胞毒作用有关。体内试验结果表明，TACMR 对荷瘤小鼠 H22 肝癌细胞具有一定的生长抑制作用，抑瘤率可达 35.2%，但抑瘤率与剂量呈负相关，可能与其抑制免疫功能有关。TACM
24、R 对免疫器官指数也有一定影响。胸腺是 T 细胞分化成熟的免疫中枢器官。从骨髓迁入的淋巴样祖细胞在胸腺经过复杂的分化发育过程，最终成为功能性 CD4+细胞及 CD8+细胞，定位于外周淋巴器官及组织发挥作用 11。脾是机体的外周淋巴器官即成熟的淋巴细胞定居及外来抗原发生免疫应答的场所，脾中 B 淋巴细胞，与体液免疫密切相关12。本研究中，在给药剂量为 136mg/kg 时，抑瘤率为 3.7%，脾指数、胸腺指数和白细胞数明显降低，并且胸腺指数与阴性对照组和阳性对照组相比，差异极显著（P0.01)，其原因可能与 TACMR 中含有苄基苯乙胺类生物碱有关，此类生物碱的分子骨架主要由苄基和苯乙胺两部分组
25、合而成 13。TACMR中以石蒜碱型生物碱为主，并且石蒜碱的含量最高，石蒜碱能导致小鼠的胸腺萎缩，同时能使中性粒细胞和嗜酸性细胞减少，并对 HIF-1Mpha 因子诱导的转录活性有抑制作用 14-15。随着剂量的增大，脾指数、胸腺指数和白细胞数逐渐减少，说明给药剂量的增大对免疫功能存在一定的影响，可能会导致 T和 B 淋巴细胞减少。因此，只有选择合适的剂量，才能使 TACMR 发挥其较强的抑瘤作用，然而TACMR 中所含的石蒜碱对小鼠肝癌细胞的抑制作用不明显 16，暗示可能含有其他具有肿瘤抑制作用的成分，其有效成分及详细机理有待于进一步研究。参考文献:（五号 黑体）1李树殿 .君子兰化学成分及
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27、rom purple asparagus(Asparagus officinalis)J. Phytochemistry, 2008, 69(8):1763- 1766.4江泽慧 .中国君子兰 M.北京:中国林业出版社,2003:112-113.5许展 ,吕密凯 ,张冬梅 ,等.君子兰的强心作用J.佳木斯医学院学报,1998,21(1):976黄彩云 ,谢世荣,黄胜英 .君子兰水提液抗实验性心律失常的作用J.医药导报,2003,2(3):154-156 7杨依磊 ,尹建元,孙宁 ,等.君子兰化学成分和药理研究进展J.特产研究,2010（1）:76-79.8高鹏华 ,杨绍娟,卜丽沙 ,等.君子兰
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