1、Chi nese Journal of New Drugs 2014,23(10)1175中国 新 药杂志 2014 年第 23 卷第 10 期 基 金 项 目 国家自然科学基金 ( 81202567); 中央级公益性科研院所基本科研业务专项基金 ( IMBF201206) 作 者简 介 关艳 ， 女 ， 主管技师 ， 主要从事微生物与生化药学研究 。联系电话 :( 010) 63165277， E-mail: guanyan20163 com。 通讯作 者 肖春玲 ， 女 ， 研究员 ， 主要从事微生物与生化药学研究 。联系电话 :( 010) 63020226， E-mail: xiaoc
2、l318163 com。杨延辉 ， 男 ， 讲师 ， 主要从事微生物 与生化药学研究 。联系电话 : 13723391014， E-mail: yyhysf163 com。实验 研 究 以耻垢分枝杆菌为模式菌快速筛选新型抗结核药物关 艳1， 杨延辉2， 周 爽1， 何琪扬1， 蒙建州1， 司书毅1， 肖春玲1( 1 中国医学科学院医药生物技术研究所 ， 北京 100050; 2 宁夏医科大学基础医学院 ， 银 川 750004) 摘 要 目的 : 评价以耻垢分枝杆菌 ( Msm) 进行抗结核药物筛选的可行性与局限性 ， 并应用该菌快速筛选新型抗结核药物先导物 。方法 : 测定抗结核药物对 Ms
3、m 的最小抑菌浓度 ( MIC); 用基于微孔板的高通量方法筛选抑制 Msm 和结核分枝杆菌 ( MTB) 的 化合 物 ; 用 MTT 法测定抗结核化合物的细胞毒性 。结果 : 靶向于分枝菌酸和蛋白质合成 、能量和核酸代谢的药物 ， 在抑制 Msm 和 MTB 方面具有平行性 ; 从 7 万余样品中筛选到 5 个对 MTB( H37v) 的 MIC 小于 10gmL1的化 合 物 ; 其中的 IMBYH2232 为喹啉胺类化合物 ， 对MTB( H37v) 的 MIC 为 0125 gmL1， 该化合物对巨噬细胞 J774A1、人肝 细 胞 L02 和人肾上皮细胞 293T的 ID50分别
4、为 125， 152 和 105 gmL1。结论 : 本 研 究确定了 Msm 高效快速表型筛选模型的可行性与局限性 ， 发现了具有极强的抗结核活性的化合物 。 关键词 耻垢分枝杆菌 ; 结核分枝杆菌 ; 高通量筛选 ; 喹啉胺 中图分类号 9783 文献标志码 A 文章编号 1003 3734( 2014) 10 1175 06Quickly discovering novel antitubercular compounds basedon Mycobacterium smegmatis modelGUAN Yan1， YANG Yan-hui2， ZHOU Shuang1， HE Qi-
5、yang1， MENG Jian-zhou1， SI Shu-yi1， XIAO Chun-ling1( 1 Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100050， China;2 The School of Basic Medicine， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China) Abstract Objective: To evaluate the feasibility and boundedness
6、of Mycobacterium smegmatis ( Msm)used to screen antitubercular drugs， applying the bacterium to rapidly screen novel antitubercular lead compoundsMethods: The MICs of antitubercular drugs for Msm were measured A high through-put method based on micro-plate was used to screen compounds inhibiting the
7、 growth of Msm and MTB The cytotoxicity of antitubercular com-pounds was analyzed by MTT assay esults: Drugs， which target to the biosynthesis of mycolic acid and proteins，the metabolism of energy and nucleic acid， had similar antimicrobial activity on MTB and Msm In about 70 000samples， we found th
8、at MICs of 5 compounds for MTB ( H37v) were under the concentration of 10gmL1 IM-BYH2232， one of the 5 compounds， was a member of quinolin amines The MIC of IMBYH2232 for MTB( H37v) was 0 125 gmL1 The ID50of IMBYH2232 for macrophagocyte ( J774A 1)， human hepatocyte( L02) and human kidney epithelial
9、cells ( 293T) were 12 5， 15 2 and 10 5 gmL1， respectively Conclu-sion: The feasibility and limitation of an efficient and fast phenotypic screening model based on Msm have beenconfirmed We also found a lead compound with very efficient antitubercular activity Key words Mycobacterium smegmatis; Mycob
10、acterium tuberculosis; high through-put screening; quinolinamineChi nese Journal of New Drugs 2014,23(10)1176中国 新 药杂志 2014 年第 23 卷第 10 期近年来 ， 结 核病的不断攀升使其又一次成为严重威胁人类健康的传染性疾病 1 2。结核 病 与艾滋病的共感染以及结核耐药问题的日益严重 ， 使结核病的临床治疗面临巨大挑战 3。近 60 年来 全 球只发现了一种全新的抗结核药物 4， 开发新型抗结核药物成为防治结核病的当务之急 。目 前 ， 新药筛选的两种主要方法是以分子靶标为
11、基础的药物筛 选 和表型筛选 ， 其中基于全菌的表型筛选是发现新型活性先导物更为有效的手段 5 6。但是 结 核分枝杆菌 ( Mycobacterium tubercu-losis， MTB) 具有高度的传染性和较长的生长周期 ，使得直接应用 MTB 进行表型筛选发现抗结核新药的研究受到了极大的限制 ， 目前仅 Stanley 等 7开展过 相 关的研究 ， 但是他们的筛选样品量也仅有 2 万左右 。虽然已经有研究者尝试使用耻垢分枝杆菌( Mycobacterium smegmatis， Msm) 、海分枝杆菌 、金黄色分枝杆菌和卡介苗等为模式菌进行寻找抗结核药物的研究 ， 但结果显示运用以上
12、模式菌不能与以MTB 进行筛选所得到的结果完全平行 8 10。至 于哪种作用机制的药物适合应用模式菌筛选仍是悬而未 决 的问题 。为了解决上述问题 ， 本研究应用已有的抗结核药物 ， 深入分析这些药物对 Msm 的抑制特点 。证实作用于分枝菌酸和蛋白质合成 、能量和核酸代谢的药物 ， 对 Msm 和 MTB 的抑制活性上具有较好的一致性 ， 以 Msm 为模式菌有可能获得此类作用机制的抗结核药物 。目前 ， 进入临床 III 期的抗结核药物 TMC207 是采用表型筛选得到的 11 12， 这一成 功 的案例也证明应用模式菌开展表型筛选可以快速有效地发现新型抗结核药物 。综上所述 ， 运用模式
13、菌构建出有效 、安全 、快速的高通量表型筛选模型是加快开发新型抗结核药物进程的重要解决方案之一 。本研究的目的就在于评价各种抗结核药物对Msm 的作用情况 ， 发现 Msm 作为模式菌的可行性与局限性 ， 进而实现构建以 Msm 为模式菌的高通量抗结核药物筛选模型 ; 应用该模型筛选抗 Msm 的化合物 ， 进一步分析了抗 MTB 活性和细胞毒 ， 快速发现新型的抗结核药物先导化合物 。材 料1 细胞 株 及菌株耻垢分枝杆菌 ( MC2155) 购自美国标准生物品收藏中心 ( ATCC); 结核分枝杆菌 ( H37v) 由北京市结核病胸部肿瘤研究所免疫室保存 ; 小鼠巨噬细胞 ( J774A
14、1) 、人肝细胞 ( L02) 和人肾上皮细胞( 293T) 均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心 。2 药品与试剂异烟肼 、利福平 、乙胺丁醇 、吡嗪酰胺 、链霉素 、卡那霉素 、卷曲霉素 、阿米卡星 、环丙沙星 、氧氟沙星 、对氨基水杨酸 、D-环丝氨酸 、磷霉素和头孢菌素均购自中国药品生物制品鉴定研究院 。3 培养基7H9 液体培养基 、OADC 和 ADC 均购自 BD 公司 ， DMEM( dulbeccos modified eagle medium) 复苏液购自 Promega 公司 。4 样品筛选样品来自中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药 ( 微生物 ) 筛选实
15、验室化合物库保藏的 7万余种化学合成 、微生物及天然来源的结构多样性样品 ， 储存质量浓度为 10 mgmL1， 初筛 样 品库为五合一化合物 ， 即由 5 种化合物混合而成 ， 每种化合物质量浓度为 2 mgmL1。方 法1 分析 模 式菌 Msm 的可行性与局限性选用 14 种现有抗结核药物 ， 测定药物对 Msm的最小抑菌浓度 ( MIC) 。将抗结核药物加入到用7H9 液体培养基稀释后的 Msm 菌液 ( A6000 02)中 ， 使化合物的终质量浓度分别 为 128， 64， 32， 16，8， 4， 2， 1， 05， 和 025 gmL1， 96 孔板 中 每孔的总体积为 100
16、 L。用封口膜封口后 37 静置培养1 d， 观察结果 。2 建立基于 Msm 全菌的高通量表型筛选模型21 种子的培养 从 80 保存的 Msm 菌种划线接种到 7H10 固体培养基上 ， 37 倒置培养 2 d。挑取单菌落接种于 7H9 液体培养基中 ， 37 ， 200rmin1培养 1 d 至 平台期 ( A60020) 。22 接 种 量 的确定 将培养的种子液用 7H9 液体培养基稀释到 A600=20， 在 7H9 液体培 养基中测定不同接菌量 ( 0 1%， 0 2%， 0 4%， 0 8% 和 1 0%)和不同培养时间 ( 从接种开始每隔 1 h 测定 1 次共测定 30 次
17、 ) 下的菌体生长速度和最终浓度 。23 筛选条件的确定 基于 96 孔板法进行筛选的反应体系总体积为 200 L， 体系组成见表 1。Chi nese Journal of New Drugs 2014,23(10)1177中国 新 药杂志 2014 年第 23 卷第 10 期表 1 筛选反 应体系实验 设 置 菌体培养液 7H9 培养基 无菌 DMSO 待测 样 品 乙胺丁醇筛选样品 198 L 2 L 空白 对 照 198 L 2 L 阴 性对照 198 L 2 L 阳性对照 198 L 2 L37 培养 1 d 后 ， 用 酶标仪测定 600 nm 处的吸收 ， 按照如下公式计算抑制率
18、 ， 利用阳性药物乙胺丁醇确定阳性标准 。样品的抑制率 /% = 1 ( 实验组吸收值 空白对照组吸收值 ) /( 阴性对照组吸收值 空白对照吸收值 ) 1003 高通量表型筛选模型的应用根 据优化后的筛选方法 ， 选取种子的接种量为 0 8% ， 筛选过程中使化合的终质量浓度为 20gmL1并且 DMSO 的终浓度为 1% ， 依据方法中“2. 3”项下方案设置对照 ， 37 静置培养 1 d。在培养前后分别用仪器检测 A600， 最后结合肉眼观察排除 培 养前 A600较高 的 假阴性结果 。按照 “2 3”项下方法 ， 测定该浓度下化合物对 Msm 的抑制活性 。4 抗 MTB 活性评价
19、从 80 保存的 MTB ( H37v) 菌液接种于7H9 液体培养基 ， 37 静置培养 14 d 至平台期( A60040)， 将培养 液 1% 转接于新鲜 7H9 液体培养基 ， 终浓度 A600值约 为 0 04。采用二倍稀释法在无菌的 96 孔板中测定化合物对 MTB 的 MIC。最高质量浓度为 128 gmL1， 最低 质 量浓度为 0 25gmL1。每种 化 合物做 3 组平行 ， 每个 96 孔板上还设置不含 MTB 的不生长对照 、含不同浓度梯度DMSO 的生长对照和无 DMSO 的无干扰生长对照 。5 细胞毒性评价将巨噬细胞 ( J774A1) 、人肝细胞 ( L02) 和
20、人肾上皮细胞 ( 293T) 分别用 DMEM 复苏 ; 用 DMEM 进行四倍稀释后 ， 于 37 含 5% CO2细胞 培 养箱中培养 3 d; 倒掉培养基 ， 加入新鲜的 DMEM， 用移液器将细胞从壁上吹打下来 ; 用细胞计数板计数后用DMEM 将细胞稀释成每毫升 106个 ; 将该细 胞稀释液加入 96 孔板中 ， 每孔 100 L; 于 37 含 0 5%CO2培养 箱 中培养 1 d; 取出 96 孔板加入 DMSO 溶液的活性化合物使其终浓度为 20 gmL1， 同时 设置 加 DMSO、不加 DMSO 的对照组和空白对照组 ， 将96 孔板继续放入 37 含 5% CO2细胞
21、培养箱中培养 2 d; 取 出 96 孔 板 每孔加入 10 L MTT 检测试剂 ，放入 37 含 5% CO2细胞培养箱中反应 2 h; 取出96 孔板用酶标仪检测 570 nm 的 吸收值 ， 用 MicrosoftExcel 计算对照与实验组的比值 ， 用 Origin 8 1 对数据进行分析和绘图 。结 果1 Msm 作为模式菌的可行性与局限性评价为 了 评 价用 Msm 是否可用于抗结核药物的初步筛选 ， 测定了不同作用机制不同结构类型的抗结核药物对 Msm 的敏感性 ， 从而评价以 Msm 为模式菌进行抗结核药物筛选的可行性和局限性 。共测定了 14 种现有临床应用的不同作用机制
22、的抗结核药物对 Msm 的 MIC 值 ， 将实验测定的 MIC 同文献报道的药物对于 MTB 的 MIC 进行比较 ， 发现乙胺丁醇 、吡嗪酰胺 、链霉素 、卡那霉素 、卷曲霉素 、阿米卡星 、环丙沙星和磷霉素对两种菌的 MIC 比较接近( 表 2) 。抗结核活性较好的异烟肼和利福平对Msm 不太敏感 。其原因可能在于异烟肼为前药 ，对 MTB 具有高度的选择性 。而利福平的平行性较差可能是由于两种菌的差异使利福平能够达到药物靶标的药物浓度不同 ， 或者是两种菌中的利福平的药物靶标的敏感性不同导致的 。综上所述 ，靶向于分枝杆菌的细胞壁阿拉伯聚糖层合成的乙胺丁醇 ， 蛋白质合成的链霉素 、卡
23、那霉素 、卷曲霉素和阿米卡星以及靶向于核酸合成的环丙沙星类药物对 Msm 和 MTB 的 MIC 结果相当 ， 具有较好的平行性 。说明以 Msm 为模式菌有可能筛选到具有以上作用机制的抗结核药物或药物先导物 ， 也可能筛选到抑制两种菌中一致性较好的未知药物靶标的化合物 。Chi nese Journal of New Drugs 2014,23(10)1178中国 新 药杂志 2014 年第 23 卷第 10 期表 2 抗结核 药物对 7H9 培养基中的 Msm 和 MTB( H37v) 的 MIC抗结 核 药物 药物靶点MICs/ gmL1( molL1)Msm mc2155 MTB H3
24、7v异烟肼 分 枝菌酸生物合成 16 ( 11667) 002 02 ( 015 146) 10利福平 NA 合成 16 ( 1944) 010 ( 012) 10乙胺 丁 醇 分枝菌酸生物合成 025 ( 122) 047 ( 230) 10吡嗪酰 胺 脂肪酸合成途径 128 ( 1 03972) 100 ( 81226) 10链霉素 多 肽的生物合成 05 ( 086) 01 05 ( 017 086) 10卡那霉 素 蛋白质的合成 2 ( 413) 1 4 ( 206 825) 13卷曲霉 素 蛋白质的合成 4 ( 533) 1 2 ( 133 266) 13阿米卡 星 蛋白质的合成 1
25、 ( 171) 05 10 ( 085 171) 13环丙沙 星 DNA 回旋酶 / 异构酶 025 ( 075) 025 10 ( 075 302) 13氧氟沙 星 DNA 回旋酶 / 异构酶 0125 ( 034) 1 2 ( 277 553) 10对氨基 水杨酸 叶酸和分枝菌酸生长素的合成途径 128 ( 83584) 1 ( 653) 10D-环丝氨 酸 肽聚糖的合成 128 ( 1 25380) 5 25 ( 4897 24488) 10磷霉素 细 胞壁的早期合成 128 ( 92713) 200 ( 144866) 10头孢菌 素 青霉素结合蛋白 128 ( 26734) 25 (
26、 5221) 102 基于 Msm 全细胞的表型筛选模型的构建21 接菌量的确定 将分光光度计测定吸光度A600约为 002 的稀释菌液分装到 96 孔板 ， 每孔 100L， 37 静置培养 ， 每隔 1 h 用酶标仪测定 1 次A600， 25 h 以 后 接 菌量大于 0 8% 的 Msm 达平台期 ，此时的 A600约为 029( 图 1) 。96 孔板的初始 A600约为 004。由此可计算出信号背景比最高可 达 7 25。因此 ， 在随后的筛选中选取 0 8% 的接菌量比较合适 。图 1 生长 曲 线22 DMSO 浓度的影响 由于样品库的化合物样品都溶解于 DMSO， 为了消除
27、DMSO 对菌的生长造成的影响 ， 需要实验测定 DMSO 对 Msm 的影响 。用酶标仪测定每孔的 A600， 同一 浓 度的 A600求平 均 值并制成折线图 ( 图 2) 。结果显示 ， DMSO 浓度在 0% 6%虽然对菌体的生长有影响 ， 但仍能生长到较高的浓度 ; DMSO 浓度在 9% 12% 生长受到较明显抑制 ， 超过 12%基本不能生长 。图 2 DMSO 浓度 对 Msm 的影响当 DMSO 的浓度在 2% 以下时 ， 对菌体的生长影响较小 。当 DMSO 浓度在 2% 8% 时 ， 显示出抑制作用 ， 但 A600保持 在 本底值的 3 倍以上 。由于本实验过程中需要对
28、保存的化合物进行 100 倍的稀释 ， 最终的 DMSO 筛选浓度为 1%， 所以对筛选结果几乎不会产生干扰 。因此 ， 将筛选时的 DMSO 浓度定在 1%。23 评价高通量表型筛选模型 开展高通量筛选之前 ， 选取了约 2 000 个化合物对高通量表型筛选模型的 Z 因子进行评价 ， 运用 96 孔板 ， 在不同日期和不同板间开展了 22 次筛选 ， 根据这 22 次筛选的Chi nese Journal of New Drugs 2014,23(10)1179中国 新 药杂志 2014 年第 23 卷第 10 期阴性和 阳性对照 ， 计算出耻垢全菌模型的 Z 因子为069 011 14，
29、 阳性变异系数为 0042， 阴性 变 异系数为 0044， 阳性结果和阴性结果的平均值相差倍数约为 7 倍 ( 图 3) 。综上所述 ， 构建的筛选方法是稳定性和灵敏度都较好的高通量筛选方法 ， 能够用于进一步的样品筛选 。图 3 不同板间的对照3 高通量表型筛选模型的应用对模 型评价后剩余的 68 000 多份样品进行筛选 ， 并将培养前仪器检测 A600值比 较 高的样品用肉眼观察排除假阴性结果 。最终从约 70 000 个化合物中发现了 89 个在 20 gmL1的质 量 浓度下具有抑制 Msm 活性的化合物 。4 评价阳性化合物的抗 MTB( H37v) 活性化合物在 20 gmL1
30、质量 浓 度下 ， 获得 42 个具有抑制 MTB( H37v) 作用的化合物 。只有 5 个化合物在 10 gmL1质量 浓 度下对 MTB ( H37v)具有抑制活性 。进一步评价了这 5 个化合物对MTB( H37v) 的 MIC， 结果见表 3。表 3 化合物对 7H9 培养基中的MTB( H37v) 的 MIC编号 MICs/gmL1( molL1)IMBYH2231 800 ( 2400)IMBYH2232 013 ( 040)IMBYH2233 400 ( 1678)IMBYH2234 200 ( 678)IMBYH2235 80 ( 2818)5 评价 抗 MTB 化合物的细胞
31、毒性IMBYH2232 对巨噬细胞 ( J774A 1) 、人肝细胞( L02) 和人肾上皮细胞 ( 293T) 的 ID50分别 为 12 5，152 和 10 5 gmL1( 图 4) 。将治 疗 指数定义为半数致死量 ( ID50) 和 99% 有效 量 ( MIC) 的比值 ， 用以表示药物的安全性 。经评价化合物 IMBYH2232对于各类细胞的治疗指数分别为 96， 117 和 81。图 4 化合 物 IMBYH2232 的细胞毒性讨 论目前 ， 可 以 使用的快速安全的模式菌如 Msm 8、金黄 色 分枝杆菌 10、谷氨酸棒状杆菌 15、海分枝 杆菌 9和 BCG 8等都 不 能
32、够同 MTB 完全平行 。相比较而言 ， Msm 的安全性高 、生长最快 ， 并且目前进入临床 III 期的抗结核药物 TMC207 也是通过 Msm 发现并阐明作用机制的 12。本研究进一步阐明了Msm 作为模式菌筛选抗结核化合物的可行性 与 局限 性 ， 研究结果显示靶向于分枝杆菌的细胞壁 、蛋白质合成 、能量代谢以及核酸合成的药物 ， Msm 可以替代 MTB 开展海量样品的筛选研究 。除此之外 ， 应用全菌筛选模型得到的抑菌化合物的作用机制也可能作用于两种菌共有的全新药物靶标 。这对于慢速生长 、致病性强的 MTB 来说尤为重要 。总之 ， 本研究应用模式菌表型筛选到了一系列的抗结核化
33、合物 ， 对该类化合物作用机制的研究 ， 将有可能发现新的抗结核药物靶标 。其中抗结核活性好 、细胞毒性较低的化合物 IMBYH2232 为开发新型的抗结核药物提供了先导化合物 。 参 考 文 献 1 KIM PS， MAKHENE M， SIZEMOE C， et al Viewpoint:Challenges and opportunities in tuberculosis research J J In-fect Dis， 2012， 205( Suppl 2): S347 S352 2 SHAMA SKMOHAN A Tuberculosis: from an incurable s
34、courgeto a curable disease-journey over a millennium J Indian J Medes， 2013， 137( 3): 455 493( 下转 第 1187 页 )Chi nese Journal of New Drugs 2014,23(10)1187中国 新 药杂志 2014 年第 23 卷第 10 期of synaptic vesicle endocytosis in central neurons J Neuron，2011， 70( 5): 847 854 10 THOME J， PESOLD B， BAADE M， et al S
35、tress differentiallyregulates synaptophysin and synaptotagmin expression in hippo-campus J Biol Psychiat， 2001， 50( 10): 809 812 11 APP S， BAADE M， HU M， et al Differential regulation ofsynaptic vesicle proteins by antidepressant drugs J Pharma-cogenomics J， 2004， 4( 2): 110 113 12 KIM JJ， DIAMOND D
36、M The stressed hippocampus， synapticplasticity and lost memories J Nat ev Neurosci， 2002， 3( 6):453 462 13 VAN PAAG H， SCHINDE AF， CHISTIE B， et al Func-tional neurogenesis in the adult hippocampus J Nature， 2002，415( 6875): 1030 1034 14 VAEA E， CASTILLO-GOMEZ E， GOMEZ-CLIMENT MA， etal Chronic antid
37、epressant treatment induces contrasting patternsof synaptophysin and PSA-NCAM expression in different regionsof the adult rat telencephalon J Eur Neuropsychopharmacol，2007， 17( 8): 546 557 15 SCANNEVIN H， HUGANI L Postsynaptic organization andregulation of excitatory synapses J Nat ev Neurosci， 2000
38、， 1( 2): 133 141 16 TING JT， PEA J， FENG G Functional consequences of muta-tions in postsynaptic scaffolding proteins and relevance to psychi-atric disorders J Annu ev Neurosci， 2012， 35: 49 71 17 WEGENE G， HAVEY BH， BONEFELD B， et al Increasedstress-evoked nitric oxide signalling in the Flinders se
39、nsitive line( FSL) rat: a genetic animal model of depression J Int J Neu-ropsychopharmacol， 2010， 13( 4): 461 473 18 HAWLEY DF， MOCH K， CHISTIE B， et al Differentialresponse of hippocampal subregions to stress and learning J PLoS One， 2012， 7( 12): e53126 19 SEESE ， CHEN LY， COX CD， et al Synaptic a
40、bnormalitiesin the infralimbic cortex of a model of congenital depression J J Neurosci， 2013， 33( 33): 13441 13448 20 EINS A， CEESETO M， FEEO A， et al Maintenancetreatment with fluoxetine is necessary to sustain normal levels ofsynaptic markers in an experimental model of depression: correla-tion wi
41、th behavioral response J Neuropsychopharmacology，2008， 33( 8): 1896 908 21 龚金炎 ， 吴 晓琴 ， 毛建卫 ， 等 黄酮类化合物抗抑郁作用的研究进展 J 中草药 ， 2011， 42( 1): 195 200 22 SPENCE JP Flavonoids and brain health: multiple effects un-derpinned by common mechanisms J Genes Nutr， 2009， 4( 4): 243 250编辑 : 郭超 伟 /接受日期 :櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃
42、櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃2014 03 14( 上接 第 1179 页 ) 3 AMAAL LMOLNA J Potential therapy of multidrug-resistantand extremely drug-resistant tuberculosis with thioridazine J InVivo， 2012， 26( 2): 231 236 4 VILLEMAGNE B， CAUSTE C， FLIPO M， et al Tuberculosis:the drug development pipeline at a gla
43、nce J Eur J Med Chem，2012， 51: 1 16 5 EGGET US The why and how of phenotypic small-moleculescreens J Nat Chem Biol， 2013， 9( 4): 206 209 6 SWINNEY DC Phenotypic vs target-based drug discovery forfirst-in-class medicines J Clin Pharmacol Ther， 2013， 93( 4): 299 301 7 STANLEY SA， GANT SS， KAWATE T， et
44、 al Identification ofnovel inhibitors of M tuberculosis growth using whole cell basedhigh-throughput screening J ACS Chem Biol， 2012， 7( 8):1377 1384 8 ALTAF M， MILLE CH， BELLOWS DS， et al Evaluation ofthe Mycobacterium smegmatis and BCG models for the discoveryof Mycobacterium tuberculosis inhibito
45、rs J Tuberculosis ( Ed-inb)， 2010， 90( 6): 333 337 9 BEG DAMAKISHNAN L Insights into tuberculosis fromthe zebra fish model J Trends Mol Med， 2012， 18 ( 12):689 690 10 GUPTA ABHAKTA S An integrated surrogate model for screen-ing of drugs against Mycobacterium tuberculosis J J AntimicrobChemother， 201
46、2， 67( 6): 1380 1391 11 KOUL A， DENDOUGA N， VEGAUWEN K， et al Diarylquin-olines target subunit c of mycobacterial ATP synthase J NatChem Biol， 2007， 3( 6): 323 324 12 ANDIES K， VEHASSELT P， GUILLEMONT J， et al A dia-rylquinoline drug active on the ATP synthase of Mycobacterium tu-berculosis J Scienc
47、e， 2005， 307( 5707): 223 227 13 ASTOGI N， LABOUSSE VGOH KS In vitro activities of four-teen antimicrobial agents against drug susceptible and resistantclinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and comparativeintracellular activities against the virulent H37v strain in humanmacrophages J Curr Microbiol， 1996， 33( 3): 167 175 14 ZHANG JH CT， OLDENBUG K A simple statistical parame-ter for use in evaluation and validation of high throughput screen-ing assays J J Biomol Screen， 1999， 4
