1、1怀化医专微生物学检验教案 编号：2010 年上学期 授课教师 桂 芳 教 研 室 主 任 审 核 签 名 李争鸣课时 月 日 月 日 月 日 月 日 月 日 月 日教学课题 螺旋体及检验2授课时间 星期 星期 星期 星期 星期 星期授课对象 检验专业 班级目的要求【掌握】钩端螺旋体，梅毒螺旋体的生物学特性和微生物学检验。【熟悉】1、回归热螺旋体和伯氏疏螺旋体的特性。2、各类螺旋体的致病与免疫性。【了解】 防治原则和其他螺施体。教学重点及难点重点：1、螺旋体的概念与特征2、钩端螺旋体的主要生物学性状及微生物学检验3、梅毒螺旋体的主要生物学性状及微生物学检验难点： 钩端螺旋体、梅毒螺旋体的微生物
2、学检验。教法与学法 讲授法课型 理论课 教学手段 多媒体教学内容与时间分配1、概述：主要特点及分类。 （10min）2、钩端螺旋体：形态染色、培养、抗原构造与分类。致病性与免疫性，微生物学检查及防治原则。 （35min）3、梅毒螺旋体：形态染色、培养特性、抗原构造。致病性与免疫性，微生物学检查及防治原则。 （35min）4、其他螺旋体。(10min)小 结 （10min）复习思考题1、什么叫螺旋体？有哪些特征？2、梅毒螺旋体的血清学检测包括哪些试验？其原理如何？参考资料1、张卓然主编 临床微生物学与微生物检验人卫出版社 第 3 版 2006.112、倪语星主编 临床微生物学与检验 人卫出版社
3、第 4 版， 2007 年3、李凡主编 医学微生物学 人卫出版社 第 7 版 2008.1自评本次课首先应重点讲授螺旋体的概念与基本特征，尤其是与其他微生物的区别。其次是钩端螺旋体、梅毒螺旋体的微生物学检查及致病性，螺旋体常用的染色法是镀银染色法，该法的操作方法及结果观察可以放在实验课介绍。2第二十七章 螺旋体及检验(spirochete)螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。生物学地位介于细菌与原虫之间。有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感等。其中致病性螺旋体主要有钩端螺旋体属、疏螺旋体属、密螺旋体属等 3 个属。第一节 钩端螺旋体（Leptospir
4、a）有 2 种：问号钩端螺旋体人畜共患病；双曲钩端螺旋体不致病。一、生物学性状1. 形态染色 螺旋细密、规则，形似细小珍珠排列的细链。一端或两端呈钩状，故名钩端螺旋体。运动活泼，常使菌体呈 C、S 或 8 字型。G-，但不易着色。常用 Fontana 镀银染色法，被染成棕褐色。暗视野显微镜下可见活泼运动、折光性强而成白色的钩端螺旋体。2.培养特性需氧或微需氧，营养要求高，常用 Korthof 培养基，其中含 10%新鲜灭活兔血清或牛血清，蛋白胨和磷酸盐缓冲液（血清除促进钩体生长外，还可中和其产生的毒性） 。 适宜生长温度为 28-30，若 11-13能生长的为非致病的双曲钩端螺旋体。最适 pH
5、7.2-7.6，pH 6.5 死亡，最高能耐 pH8.4。在人工培养基中生长缓慢：液体培养基：28培养 1-2 周，液体培养基呈半透明云雾状生长。1%琼脂固体：281-3 周，可形成透明、不规则，d 2mm 的扁平小菌落 。生化反应不活泼，不分解糖类和蛋白质，有过氧化氢酶，有的菌株可溶血。3.抵抗力对热和酸抵抗力弱，601min 即死亡。0.2%来苏、1:2000 升汞、1%石炭酸3经 1030 min 被杀灭。对青霉素敏感。在夏秋季酸硷度中性的湿土或水中可存活 20 天以上，甚至数月之久，这在本菌的传播上有重要意义。4. 抗原构造与分类 1）属特异性抗原（菌体抗原）：脂多糖复合物，用于分群。
6、2）型特异性抗原（表面抗原）：多糖蛋白复合物，用于分型。问号状钩端螺旋体至少可分为 25 个血清群、273 个血清型。我国已发现的致病性钩端螺旋体至少有 19 个血清群、74 个血清型，是发现血清型最多的国家。二、致病性与免疫性1、致病物质（1） 内毒素样物质(ELS)或称脂多糖样物质(LLS)（2） 溶血素：溶解红细胞，引起贫血、出血、肝肿大、黄疸、血尿。（3） 细胞毒性因子(CTF)：引起小鼠肌肉痉挛、呼吸困难而死亡。（4）细胞致病作用(CPE)物质：56经 30 分钟被破坏。注射入家兔，可形成红斑和水肿。 2、所致疾病、所致疾病 钩端螺旋体病钩端螺旋体病（一种人畜共患传染病） 。储存宿主
7、：鼠和猪，其他：50 多种动物（蛇、鸡、鸭、鹅等）传播途径：人与污染水或土壤接触,经粘膜或破损皮肤进入;经胎盘垂直传播.临床表现：大多隐性感染，随尿排出。轻重程度与感染钩体型别、毒力、免疫性有关。轻者似感冒，重者引起内脏器官和神经系统的损害。先形成钩体血症,进入损伤全身毛细血管内皮细胞及肝、肾、肺心及中枢神经。疾病特点：起病急、高热、乏力、全身酸痛、眼结膜充血、腓肠肌压痛、表浅淋巴结肿大。免疫性：疾病后可获得抗同型钩体的持久免疫力。细胞免疫为主。三、微生物学检查法（一）标本采集钩端螺旋体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。标本包括血液、尿和脑脊液，发病早期(10 天内)血液的阳性率高，
8、2 周后尿和脑脊液等的阳性率高。感染 610 天取血可检出抗体，在病程第 3 或 4 周达最高水平，此后抗体水平逐渐下降，血清学诊断则需在病程早期及恢复期分4别采集血清，作双份血清试验。 （二）检验方法 1、标本直接检查（1）镜检：取急性期病人血先以 1000rpm 离心 510min，再取血浆以 4000rpm离心 4560min，取 1 滴沉淀物置玻片上，加盖玻片后作暗视野检查。也可用Fontana 镀银染色法染色后观察。 （2）核酸检测：采用同位素或生物素、地高辛标记的特异 DNA 探针法，检出标本中钩端螺旋体的核酸，较培养法快速、敏感。若先用 PCR 技术先行扩增，再用探针确定，则敏感
9、度更加提高。2、分离培养取钩端螺旋体血症期的病人血液 2ml 或发病后第 2 周的无菌弱碱性尿沉渣接种于 Korthof 培养基中，28孵育，因系需氧生长，故靠近培养液面呈半透明雾状混浊。取培养物作暗视野检查，观察有无螺旋体生长，一般 714 天生长。连续观察 30d，如无生长方判为阴性。3、血清学检测（1）显微镜凝集试验（MAT） 是常用的方法。1)抗原制备：取标准菌株 47 天的培养物，每视野 5060 条活钩端螺旋体。2)方法与结果：取病人血清以 56，30min 灭活后稀释，每个稀释度 0.1ml 血清中加入等量活菌抗原，302h 后，取 1 滴覆盖玻片，暗视野显微镜下若有抗体存在，则
10、钩体凝集成团，数减少，当抗体效价高时，凝集的菌体溶解。结果判定：50以上菌体凝集或溶解为“2+” 为血清效价。1：300才有诊断意义，或效价增高 4 倍以上，则可确诊本病。 （2）酶联免疫吸附试验用 ELISA 法和 IgM 斑点-ELISA 法等间接检测钩体病人血清中特异性抗体，用于该病的快速诊断。包被抗原用钩端螺旋体培养物经超声波破碎，15000rmin 离心20min，用于包被的抗原浓度以 20gml 为好。被检血清 OD 值为阴性对照的2 倍，即为阳性。4、动物试验动物是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用于有杂菌污染的标本。5方法是将标本接种于 幼龄豚鼠 或 金地鼠腹腔 。接种 35d
11、 后，可用暗视野显微镜检查腹腔液；亦可在接种后 36d 取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。第二节 梅毒螺旋体（Treponema pallidum, TP）（苍白密螺旋体苍白亚种） ，STD 中危害最大的一种。一、生物学性状1.形态与染色 8-14 个致密而规则的小螺旋，两端尖直，运动活泼。革兰染色阴性，不易着染 Fontana 镀银染色法染成棕褐色。 电镜下观察，有细胞壁和细胞膜。细胞壁外有包膜，细胞膜内为含细胞质和核质的螺旋形原生质圆柱体。绕着 34 根周浆鞭毛或内鞭毛 ，与运动有关。作移行、曲伸、滚动式运动。2、培
12、养特性不能在无活细胞的人工培养基中生长繁殖。Nichols 株能在家兔睾丸和眼前房内繁殖并保持毒力，在细胞中能有限生长，繁殖慢，约 30h 才分裂一次 。含 3%-4%氧时生长最宜 。Nichols 株：有毒力Reiter 株：毒力弱3.抵抗力 极弱。对温度和干燥特别敏感。41.5经 1h 死亡，在 50时 5min 死亡；在血液中，4置 3d 后可死亡。离体后 1-2h 将死亡。对常用化学消毒剂亦敏感，1%2%石炭酸内数分钟就死亡。对青霉素、四环素、红霉素或砷剂均敏感。二、致病性与免疫性1、致病物质 外膜蛋白-与宿主细胞粘附。透明质酸酶-利于扩散。宿主细胞纤维粘连蛋白覆于表面-免受宿主免疫细
13、胞攻击。2、所致疾病-梅毒 6人是梅毒的唯一传染源，有先天性和获得性两种 。 获得性性接触传播先天性母体胎盘胎儿 获得性梅毒期（初期）梅毒：感染性极强，破坏性小。感染后 3 周左右局部出现无痛性硬下疳，多见于外生殖器，一般 48 周后，常自愈。渗出液中有大量苍白亚种螺旋体。期梅毒：感染性强，破坏性小。发生于硬下疳出现后 28 周。苍白亚种螺旋体血症，全身皮肤、粘膜常有梅毒疹（扁平湿疣） ，全身淋巴结肿大，有时亦累及骨、关节、眼及其他脏器。在梅毒疹和淋巴结中，存在有大量苍白亚种螺旋体。期(晚期)梅毒：感染性小，破坏性大。发生于感染 2 年以后，亦可长达1015 年。病变可波及全身组织和器官。基本
14、损害为慢性肉芽肿，局部因动脉内膜炎所引起的缺血而使组织坏死。皮肤、肝、脾和骨骼常被累及。若侵害中枢神经系统和心血管，可危及生命。先天性梅毒（胎传梅毒）多发生于妊娠 4 个月之后。苍白亚种螺旋体经胎盘进入胎儿血流，并扩散至肝、脾、肾上腺等大量繁殖，引起胎儿的全身性感染，导致流产、早产或死胎；出生梅毒儿，呈现马鞍鼻、锯齿形牙、间质性角膜炎、先天性耳聋等特殊体征。免疫性：抗体梅毒特异性抗体（IgG 和 IgM） ，有制动作用，对机体再感染有保护作用；抗脂质抗体反应素（IgM 和 IgG 混合物） ，对机体无保护作用，用于血清学诊断。三、微生物学检查法标本 ：期梅毒-硬下疳渗出液；期梅毒-梅毒疹渗出液
15、或局部淋巴结抽出液1.直接显微镜检查 将上述检材置于玻片上用暗视野显微镜检查，如见有呈现运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等的螺旋体即有诊断意义。也可做镀银染色、荧光抗体染色或 Giemsa 染色。72.核酸检测用 PCR 技术直接检测临床标本中梅毒螺旋体的特异性 DNA 片段，用于检测的引物和探针是编码外膜蛋白 47kD 的基因，其扩增产物经斑点印迹，或电泳Southern 印迹法鉴定。3.抗体检测(1)非密螺旋体抗原试验多用牛心肌的心脂质作为抗原，测定病人血清中的反应素。将抗原包被到载体颗粒上，如：胆固醇（VDRL、USR） 、活性炭（RPR） 、甲苯胺红（TRUST） 。均为初
16、筛试验。初期梅毒病灶出现后 1-2 周时，阳性率为 5383，二期梅毒的阳性率可达 100，晚期梅毒的阳性率 58-85，胎传梅毒的阳性率为 80- 100。1)性病研究所实验室(VDRL)玻片试验所用抗原(0.03心拟脂、0.21卵磷脂、0.9 胆固醇 ，用无水乙醇配制)03ml 加入装有 0.3ml 缓冲盐水的小瓶内(1015ml 容积)，加塞混匀。再加2.4ml 缓冲盐水即为抗原悬液。待检血清经 5630min 灭活，滴加于玻片的漆圈内加等量抗原液，摇转玻片 5min 充分混匀反应后观察结果。有大片絮状凝聚物为(3+)，中等凝聚物为(2+)，细小凝聚物为(+)，液体混浊为()。2)快速血
17、浆反应素环状卡片试验(RPR)用活性炭颗粒吸附 VDRL 抗原。与反应素结合形成黑色凝集块，可肉眼观察结果。取待检血清加于环状卡圆圈内，加 VDRL 抗原致敏活性炭 1 滴，旋转摇匀8min，观察结果。在白色底板出现明显黑色凝集颗粒为阳性，试验结果用肉眼很容易判断，不需显微镜，也易于推广。3）不加热血清反应素试验（USR）注意：以上试验常有假阳性反应：结核、麻风、疟疾、类风湿性关节炎、老年人、妊娠、吸毒者等。(2)密螺旋体抗原试验 （确证试验）用密螺旋体抗原检测病人血清中特异性抗体，由于梅毒螺旋体、雅司螺旋体等抗原性相似，故血清学试验不能区别这些密螺旋体及其所致疾病。 1)荧光密螺旋体抗体吸收
18、试验(FTA-ABS) 8先用吸收剂去除病人血清非特异性抗原，提高特异性，稀释成不同稀释度，加于预先涂有 梅毒螺旋体抗原 的玻片上，置湿盒内，37孵育 30min，洗片后再用 荧光素标记的羊抗人丙球蛋白抗体 ，在荧光显微镜下观察。阳性者可见发荧光的梅毒螺旋体。FTA-ABS 试验具高度特异性和敏感性，在第一期梅毒的头几天就可测出特异性抗体。2)梅毒螺旋体血凝试验 (treponemal pallidum hemaggulation assay, TPHA) 用抗原致敏红细胞作间接血凝试验是检测抗体最简易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋体(Nichols 株)提取物去致敏经醛化处理的绵羊红细胞，病人
19、的血清先与非致病性 Reiter 细胞。血清若含有抗体则与这些细胞反应形成平铺孔底的凝集；用非致敏红细胞作对照，以除外非特异性凝集。梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）第三节 疏螺旋体属有 310 个稀疏而不规则的螺旋，运动活泼。对人致病的主要有伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体、奋森螺旋体等。一、伯氏疏螺旋体是莱姆病的主要病原体，1977 年在美国莱姆镇发现，从硬蜱及患者体内分离出伯氏疏螺旋休。1985 年我国在黑龙江省林区首次发现莱姆病，1988 年从病人血液中分离出病原体，迄今已有十多个省和自治区证实有莱姆病存在。传播媒介是硬蜱，伯氏疏螺旋体可在蜱的中肠生繁殖，叮咬时使宿主感染。经 330d 潜伏期，早期有乏力、头痛、发热、肌痛，在叮咬部位可出现慢性移行性红斑。经 2-3 周，皮损消退，留有斑痕与色素沉着。80未经治疗的可发展至慢性关节炎、慢性神经系统异常，严重者可同时出现皮肤、神经、关节、心等多脏器损害。二、回归热疏螺旋体是引起人类回归热的病原体。根据回归热传播媒介不同，分为两类：一为虱传回归热，或称流行性回归热，其病原体为回归热疏螺旋体。另一为蜱传回归热热，又称地方性回归热。我国流行的回归热主要是虱传型。
