1、免疫组织化学考题2004 级考题1.简述原位杂交组织化学的基本原理。P842.简述免疫组化染色 ABC 法的基本原理。P523.组织块进行固定的原理是什么?常用的固定方法和固定剂有哪些?P104.何为细胞培养术?举例说明其在生物学医学研究中的应用.5.细胞凋亡的形态学检测方法有哪些?6.何为色温?在显微摄影中常用日光型胶片在灯光下拍照,您将用何种方法调节色温?P1847.何为像素？在数码摄影中常考虑的参数是什么？P136;P1988.酶标抗体免疫细胞化学间接法的基本原理是什么？此法的优缺点是什么？按此方法选择抗体时应注意什么问题？P519.结合本专业的研究方向，自行设计一个双重免疫荧光细胞化学
2、染色的实验，并写出实验流程，简述免疫荧光细胞化学染色中的注意事项。10.学过此门课程后有何感想？为使此课程开设的更好，请留下您宝贵的意见和建议。2007 级考题1.简述形态学研究有哪些主要常用技术？这些技术能解决哪些问题？2.试述石蜡切片和 HE 染色的基本制备过程，并指出制备免疫组化的石蜡切片和用于 HE 染色的石蜡切片有何不同。P11;P207;P2083.上课留的作业4.何谓免疫荧光染色，用何种方法消除非特异荧光？P44;P745.ANN VASSAY 检测细胞凋亡的原理、试验流程和结果分析。答：原理：主要是根据细胞凋亡过程中的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡
3、细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V 是一种 35-36KD 的钙离子依赖的磷脂结合蛋白，它对 PS 具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的 PS 结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的 PS 也外翻，因而也会阳性。因此，还会加一种 DNA 染料，常用的有 P1。由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和 DNA 结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。试验流程：1）细胞收集：悬浮细胞直接收集 10ml 的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻吹打。凋亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到 10ml 的离心管中，没脱壁的细胞用 0.0
4、2%的 EDTA 消化使之脱壁，每样本细胞数为（ 1-5）106，5001000r/min 离心5min 弃去培养液。2）用孵育缓冲液洗 1 次，5001000r/min 离心 5min。3）用 100l 的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育 1015min。4）5001000r/min 离心 5min 沉淀细胞，孵育缓冲液洗 1 次。5）加入荧光溶液 4下孵育 20min，避光并不时振动，上机检测。 6）流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用 488nm，用一波长为 515nm 透带滤器检测FTTC 荧光，另一波长大于 560nm 的滤器检测 P1。 结果分析：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的
5、染料如 P1 有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的 DNA 可被 P1着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期 P1 不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。6.何谓像素？简述数码相机摄影的基本原理。P1987.影响曝光的因素有哪些？什么情况下使用光圈优先？什么情况下使用快门优先？什么情况下考虑胶片的感光度或相当感光度？P1808.谈谈你学习这门课的感想和体会？并提出对这门课的建议。作业：设计一个自己研究领域的小实验（方法要有免疫组化技术）要求：1.要解决的问题2.技术必须有免疫组化技术3.预实验结果1.简述广义的组织化学均包含那些
6、主要采用技术？这些技术能解决科研中的哪些问题？广义的组织化学包括传统的组织化学，免疫组织化学、电镜组织化学、免疫电镜组织化学和原位杂交组织化学。组织化学用于检测细胞内核酸脂类糖类和酶类等应用很广。免疫组织化学由于特异性强敏感度高所以应用广泛，凡是组织或细胞中能作为抗原或半抗原的物质，如蛋白质，多肽氨基酸多糖磷脂受体酶急速核酸记病原体都课用相应的特异性抗体进行检测，因此成为生物医学各学科领域的重要研究手段。电镜组织化学主要用于检测一些酶的活性及其在超微结构的定位虽然目前已知酶的种类超过 2200 余种蛋电镜只能观察 100 种，其原理是酶组织化学反应过程，酶底物反应的特异性，捕捉反映（金属盐城点
7、发嗜锇性物质生成法。免疫电镜是根据抗原与抗体特异性结合的原理，利用电子密度标记抗体或经免疫化学反应能产生高电子产物的标记抗体在超微结构水平对抗体进行定性定位。原位杂交是将分子杂交技术与组织化学相结合而在核酸原有的位置上进行细胞内核酸定性定位的一种技术。更多用于定位细胞内 mrna 它可为研究单一细胞中编码各种蛋白质和多肽（前体）的相应 MRNA 定位以及研究细胞内基因表达有关因素的调控提供有效地手段另外像遗传学病毒学神经内分泌学病理学免疫学及发育生物学等个领域2.试述石蜡切片和 HE 染色基本制备过程？并指出制备免疫组织石蜡切片和 HE 染色的石蜡切片有何不同？石蜡切片基本制备：取材，固定，脱
8、水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏。取材：材料的好坏直接影响到切片的质量，取材时给定位麻醉药量适中，去组织是尽可能不损伤所需部位取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过 2mm，大小不超过55mm2。固定：常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。
9、简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有：Bouin 液（ 70 份苦味酸饱和水溶液+25 份 4甲醛+5 份冰醋酸） 、Zenker液（升汞 5g重铬酸钾 2.5g硫酸钠 1.0g5ml 冰醋酸 100ml 蒸镏水） 、Carnoy 改良液（3 份无水乙醇+1 份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。固定时，须注意以下几点：（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的 1015 倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。（3）材料
10、固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出。（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从 1 小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。（5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。（6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。3脱水生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。脱水剂必须能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡
11、溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从 30乙醇开始，经过50、70、80、95、100至完全脱水；对于一些柔软的组织应从 15开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置 45min 到 1h，如果中间须停顿，应使材料停留在 70乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分
12、导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至 70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须小心。正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。4透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲
13、苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定，般各级停留时间在 30min 至 2h，在纯二甲苯中应更换 2 次，总时间则以不超过 3h 为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。 20甲苯的一般性质与
14、二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低，透明较慢，但不会使组织变脆。苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿适于大块组织的透明。5透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在 5060之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为 5256，植物材料的用 5458的；切片薄的用 5860的，切片厚的则用 5254的；室温 1019时选用 5254的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点 4648的石蜡，夏季可选 5658的。石蜡的优劣与切片的成败密切相关。鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，3035放置 24h
15、且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点） ，使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点 3 度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理 23 次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需 1530min。透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。包埋是使浸透蜡的组织块
16、包裹在石蜡中。具体做法是；先准备好纸盒（具体折法见图 1-3及说明） ，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min 后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。6切片（1）石蜡块的固着与整修在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固
17、着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽 23mm 的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。（2）切片机和切片刀切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。切片刀与切片的质
18、量直接相关。切片前必须磨刀，方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨，使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。（3）切片方法切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈 15左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方
19、法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。7贴片切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。贴片一般有捞片法和烫板法。捞片法比较简单，首先将切片分割开，投入到 48的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，然后
20、用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中，去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状泡沫，然后用双层纱布过滤至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存几个月到一年。 ）或 5明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。烫板法，是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干。要注意，不管是使用捞片法还是烫板法，所用的载玻片必须洁净，不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴
21、蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等物在上面） ；切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。8.染色石蜡切片苏木素一伊红染色法的基本步骤：（1）二甲苯 I-15 分钟， （2）二甲苯 II- 10 分钟， （3）无水酒精 I- 2 分钟，（4）无水酒精 II-2 分钟， （5）95% 酒精-2 分钟 ， （6）80% 酒精-2 分钟， （7）自来水洗片刻， （8）蒸馏水片刻， （9）苏木素液染核-5 分钟， （10）自来水洗片刻， （11）1%盐酸酒精分化-0.5 分钟， （12）流水冲洗片刻， （13）弱氨水水溶液反蓝-1 分钟， （14）流水冲洗-15
22、 分钟 ， （15）复染 05伊红水溶液（对比染色）-7 分钟， （16 ）自来水洗（分化伊红）片刻， （17）95酒精 I-2 分钟， （18）95%酒精 II-2 分钟， （I9）无水酒精 I-2 分钟， （20）无水酒精 II-2 分钟， （21）二甲苯 I -5 分钟（22）二甲苯 II-5 分钟， （23）盖玻片下封固。免疫组化的石蜡切块所需的石蜡必须是滴熔点的石蜡防止破坏组织的抗原性。免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后 HRP 等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过 DAB 显色反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。2、HE 染色是用苏木素和伊红分
23、别染上胞核和胞浆，可以区分出一般细胞的形态，在实际应用中可以鉴定组织细胞坏死、水肿、变性和炎性细胞浸润等异常病理学改变，在临床上是诊断恶性肿瘤和肿瘤的很好的方法。3、免疫组化染色和 HE 染色的不同之处可能是 HE 染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量） 、也可检测细胞内细胞因子的转位（如 active-caspase3 和 cleaved-caspase3 的胞核和胞浆分布状态） 、组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析） 。3.何谓免疫荧光染色常用的免疫荧光素有哪些？请列出两种能与
24、DNA 结合的荧光素？三种与蛋白质结合的荧光素，并分别说明他们的吸收波长和发射波长以及荧光颜色？荧光是指某些物质被一定波长的光（如紫外线）照射后能发出一种比激光更长的光，荧光物质也称荧光素，荧光色素或荧光探针是指能够吸收光并能在较短时间内发射荧光，而且能作为染料的化学物，荧光素提出都具有芳香环结构。荧光色素的荧光光谱和量子产率受荧光素染液的 PH 影响 PH 在 8.5-9-5 是银光强度较强。PH 低于 6。4 不发光。温度，荧光素的乙醇溶液在 0 度以下没降低 10 度荧光量子产率增加 3%降至-80 度荧光量子率接近 100%反之则弱。30 度开始荧光强度降低， 37 度对异硫氰酸荧光素
25、无影响。溶剂性质对荧光也有影响浓度也对荧光有影响。常用的荧光素有：最常用的染料有 FITC 和藻红蛋白类（ PE）及罗丹明等。 FITC（异硫氰酸荧光素） （fluorescein isothiocyante)：呈黄绿色，最大激发激光长 490NM 最大发射光波长 525nm； 与蛋白质结合四甲基异硫氰酸罗丹明（teramethyl rhodamine isothiocyanate )TRITC 也是与蛋白质结合比FITC 性能好生理条件下对 PH 不敏感最大激发光波长 550NM 最大发射光波长 620NM 呈橙红色荧光与 FITC 发出的黄绿色荧光形成鲜明对比常用与免疫荧光组织化学双重染色
26、。四乙基罗丹明(RB200）能与细胞内蛋白质结合易溶于乙醇丙酮性质稳定，应用于双标记示踪染色，最大发光波 570nm 最大发射波长 595600nm 呈橙红色染色。花青类染料常用的有 CY3，CY5 与蛋白质结合 CY3 最大激发光波长 570nm 最大发射光波长 650nm。CY5 最大激发光波长 649nm 最大发射光波长 680nm 呈红色荧光。PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm； 蛋白质结合PerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm； PI（碘化丙啶）：橙红色 620nm； 488nm 波长的氩离子激光激发； APC（别藻青蛋白）：红色 660nm； 630nm 波长的氦
27、氖激光或红色二极管激光激发。吖啶橙染色（acridine orange)AOyu DNA 或 RNA 结合最大发射光波长 525nm 或 650nm 产生绿色荧光hoechst33258 染色和 hoechst33342 均为非嵌入性荧光染料他们在活细胞中 DNA 聚 AT 序列富集区域的小沟处与 DNA 结合,活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料，使细胞核染色，故把此染料叫 DNA 探针 hoechst33342 和 hoechst33258 均溶于水保持稳定，hoechst-DNA 的激发和发射波长分别为 350nm 和 460nm。DAPI 染色也是与 DNA 结合。溴化乙啶染色
28、。4.免疫荧光组织化学的基本原理方法？免疫荧光组织技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方法。根据抗原抗体反应原理，先将已知抗体或抗原标记荧光素制成标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针与组织细胞内的相应抗原或抗体反应，在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗原抗体复合物，这种复合物上的荧光素受激发光发射照射而发出各种颜色，荧光利用荧光显微镜观察，即可对组织细胞中的抗原进行定性定位乃至定量研究。蛋白质多肽核酸酶激素磷脂多糖受体记病原体等，凡能作为抗原或半抗原的物质均可用免疫荧光技术检出。5滤片的种类和用途？激发光滤光片位于光源和显微镜之间的光路内其作用是吸收可见光，允许一定波长的
29、紫外光和蓝紫光通过。根据观察需要，可将抹一些激发滤片至于光路使一定的光通过，作为荧光激发样品中的荧光物质。阻断滤片又称吸收滤片在目镜和武警之间的光路中吸收视野内未被标本内荧光物质吸收的激发光，已获得清楚地荧光影像和保护观察者的眼睛反光镜上有一层铝铝对紫外线和可见光的蓝紫光吸收少反射率大 90%以上，课折射激发光改变光路是激发光赵汝样品中。隔热滤片吸收热量保护其他光学元件。中性滤片课不同程度的吸收可见光，减弱光强度。.6激光共聚焦显微镜的原理？激光扫描共聚焦显微镜的原理： 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Sca
30、nning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图7免疫组织化学染色常见的脱片原因？及防
31、脱片的处理步骤？脱片原因组织固定脱水透明不充分，组织切片过厚，组织切片有折叠，过度的热抗原修复（高压微波水煮）处理或抗原修复液的 PH 偏离炒作观察中冲洗方法不正确。防脱片用重鉻酸浓硫酸清洁液浸泡载玻片或则培养用的小盖片，然后用清水充分再用蒸馏水冲洗 3 遍以上后置 95%乙醇 12 小时去除擦干或烤干清洁液浸泡只需 2 小时。检查玻片是否上胶。把玻片放入用配好的多聚左旋赖氨酸 0.01%溶液中数十秒沥干于室温下 12-24小时时候后的多聚 L-懒氨酸放在 4 度的冰箱保存反复使用一个月。8sp 法（链霉素抗生素蛋白- 过氧化物酶）与直接免疫荧光法的区别？链霉亲和素替代 ABC 法中的亲和素-
32、 生物素复合物，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法，SP 法链霉亲和素是从链霉菌中分离出的一种蛋白，含有四个亚基，链霉亲和素的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合，故又称链霉菌抗生物素蛋白；由于该放大系统不含生物素，可以免除由内源性生物素所造成的背景染色；等电点为 5.56.7，接近中性，所带的负电荷少，不容易与组织中的正电荷发生相互吸引，因而降低背景着色。链霉亲和素不含糖基，不存在与组织中含糖基类物质其反应的现象。9免疫组织化学染色样品制备特点 取材：组织标本取材：基本原则: 取材速度要快，尽量保持组织新鲜，以充分保存组织的抗原性。细胞标本取材贴壁生长细胞: 取材时，用预热的 PBS 轻轻冲
33、洗小盖片，而后，即可加入固定液。悬浮生长细胞：制备 210 5-6 细胞/ml 悬液，取 50-100l，加入涂片机内，1000r/min. 2min. 细胞即可均匀分布在载玻片上3）涂片法：临床穿刺获取含有细胞的液体（腹水，胸水和心包液）或气管、宫颈等分泌物可直接涂片。固定：组织常用固定剂：10%中性缓冲福尔马林（浓甲醛 10ml, 0.01M, pH 7.4, PBS 90ml) 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 (pH7.4)sp 法注意事项：甲醛固定可引起组织抗原决定簇交联和封闭（可以通过抗原修复方法来修正组织大小应该小于 2cml.5cm 0.3cm，尤其厚度必须小于 0.3cm；固定液的量，
34、体积一般大于组织 20 倍以上；固定时间 8-24 小时，过度固定会使抗原表达假阴性；组织固定后应充分水洗。 10何为二次展片? 是指切片在展片过程中，先将组织切片漂浮在 30%的乙醇溶液中，进行第一次展片后将切片捞起，再次放入 45 一 50 的水浴锅中进行第二次展片，因为酒精溶液与水之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱折的组织切片。酒精的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低，自行调整。核酸分子杂交:两条互补 DNA 或 RNA 单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程.11.原位杂交组织化学技术进展？原位 PCR 技术 荧光原位杂交技术 胚胎原位杂交技术 双重和多重原位杂交技术 原位杂
35、交结合免疫组织化学技术 电镜原位杂交技术 肽核酸原位杂交 原位 PCR 技术原理 :将 PCR 技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。根据在扩增反应中所用的 dNTP 或引物是否标记，原位 PCR 可分为：直接法原位 PCR间接法原位 PCR12.影响杂交体稳定性的因素杂交双链的碱基组成.杂交双链的长度.碱基错配程度.离子强度.变性剂浓度l 类型核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交组织化学(ISH)：应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察
36、。可进行细胞内核酸定性、定位的一种技术。核酸分子探针 ：一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。探针的种类DNA 探针 cRNA 探针寡核苷酸探针原位杂交组织化学基本程序标本制备杂交前处理 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号。13.免疫组织化学染色步骤石蜡切片免疫组化染色步骤1.烤片：58 2-h；2.脱蜡和水化：在二甲苯、中浸泡 15min100 酒精、中分别浸泡5min95、90、80、70酒精各浸泡 2minPBS 洗 3 次3min,置蒸馏水中待用；3.抗原修复：先将 pH=6.0 和 0.1molL 柠檬酸缓冲液煮沸，将切片置于已沸缓冲液中进行高压修复 1.5min，室温
37、冷却，PBS 冲洗 3 次5min；4.用 0.1 0.3TritonX-100 浸泡，RT，25min，PBS 冲洗 3 次5min ；使抗体渗透进入细胞的方法 Triton X-100 ：使细胞膜脂类溶解 （2） Np-40：使细胞膜蛋白质破环 （3） Saponin：使细胞膜胆固醇溶解（4） Freezing：使细胞膜穿孔，速冻形成冰晶，溶解后形成小孔。SABC 法与免疫组织化学染色其它方法比较?SP 法或 SAP 法 （二）EnVision TM Systems 原理是将多个抗鼠和抗兔 IgG 分子与辣根过氧化物酶结合形成聚合物 , 以代替传统方法的二抗和三抗, 直接与特异性第一抗体结
38、合，从而放大了抗原抗体结合的信号，使检测变得简单而且敏感性增加。 （三）Maxvision 法 根据聚合物技术把过氧化物酶与抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚肽上形成多聚物分子，可以避免由于生物素引起的非特异性背景显免疫组织化学染色结果评价对照实验方法和结果分析对照种类 靶组织 实验试剂 阳性反应意义阳性组织对照 组织中含待测抗原 按常规操作流程 提示操作系统的试剂和操作方法无误一抗阴性对照 组织中待测抗原未定 用与第一抗体相同种属正常血清取代一抗或用PBS 取代一抗，其余步骤不变。 提示有非特异性反应存在二抗阴性对照 组织中待测抗原未定 用与第二抗体相同种属正常血清取代二抗或用PBS 取
39、代二抗，其余步骤不变。 提示一抗对组织有非特异性吸附或组织内未灭活内源性酶14.免疫组织化学技术应用的基本原则?免疫组织化学技术的局限性：组织细胞内的待测物质要有抗原性；有一定浓度方可检测出；检测出的阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白。确定细胞类型和形态2辨认细胞产物的来源3确定细胞的分化程度4追踪神经纤维束和它的投射区5. 在临床病理中的应用 如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后，辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。15.流式细胞术在组织化学与免疫组织化学中的应用 ?流式细胞术的常用样品制备方法 单层培养细胞单细胞悬
40、液的制备 实体组织单细胞悬液的制备机械法酶处理法 石蜡包埋组织的流式细胞样品制备 免疫荧光标记样品 直接免疫荧光标记法 间接免疫荧光标记法 16.荧光标记中的注意事项?细胞分选或检测细胞存活率时，要保持细胞新鲜标本的保存和固定：未染色培养细胞可常规冻存。不需排除死细胞可进行染色前固定。若要排除死细胞、染色后长时间存放、或标本具有传染性，需要染色后固定。阴性对照细胞非染色细胞：直接染色法时，用 PBS 代替荧光单克隆抗体。间接染色法时， PBS 代替第一抗体和荧光第二抗体。同型对照：非特异性抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg）代替特异性单克隆抗体。选择与实验用单克隆抗体亚类一致的 MsIg，即 MsIgG 或 MsIgM。直接染色法时，荧光结合 MsIg 代替荧光单克隆抗体。间接染色时，无荧光 MsIg 代替第一抗体。
