1、第五章 细 胞 工 程 及其在食品工业中的应用,细胞工程 (cell engineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。 细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖目的：获得新性状、新个体、新物质,一 细胞工程的定义,第一节、细胞工程的概念与研究范畴,二 细胞工程的研究范畴,细胞融合 细胞拆分 动物细胞与组织培养 植物细胞与组织培养 细胞核移植 染色体工程 胚胎工程 干细胞与组织工程,三、细胞工程的发展,1 动物细胞工程的
2、发展,2 植物细胞工程的发展,细胞学说的建立胚胎学的发展分子生物学的发展,四、细胞工程的理论基础,五、细胞工程的基本技术,植物细胞工程,植物细胞工程的基本技术和理论基础,植物细胞工程的理论基础是：植物细胞的全能性,概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。 原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。,细胞的全能性,当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。,在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形
3、成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。,从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠，升汞和酒精等对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。严格控制无菌条件，这是获得培养成功的重要一步。外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株。,1）植物细胞和组织培养技术,植物组织培养的过程,离体的植物器官、组织或细胞,脱分化（又叫去分化）,愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）,再分化,根或芽等器官,植物体,二
4、、植物组织培养,植物组织培养过程,相关问题,1、在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？ 2、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？,植物体细胞杂交的概念,将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 （不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的）,相关问题,（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？ （2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？ （3）为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？ （4）如果两个来源不同的原生质体发生融合形
5、成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种处理？ （5）如何将杂种细胞培育成杂种植株？,植物体细胞杂交过程,杂合的原生质体,杂种细胞,愈伤组织,杂种植株,植物体细胞杂交过程,原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体融合（人工诱导） 杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织）杂种植株的再生与鉴定,物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇等试剂,纤维素酶、果胶酶等,问题,为什么“番茄马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？ 主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到
6、相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。,问题,自然界中有一种含有叶绿体的原生动物眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。,异想天开,植物细胞工程的实际应用,繁殖植物的新途径 微型育种 作物脱毒 人工种子 育种新方法 单倍体育种 诱导突变体 细胞产物的工厂化生产,概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术） 原理：植物细胞的全能性 优点：繁殖率高，可大批量生产取材少培养周期短保持优良性状,微型繁殖,作物脱毒,病毒在作
7、物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差 分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有 采用茎尖进行组织培养,人工种子,结构： 人工薄膜+胚状体（不定芽、顶芽、腋芽） 优点： 不受气候、季节、地域的限制 保留优良性状 时间短，占地少 技术： 组织培养 原理： 细胞全能性,养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌 生长调节剂,单倍体育种,方法： 花药离体培养 技术： 组织培养获得单倍体 秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍 优点： 明显缩短了育种年限 后代稳定遗传,突变体的利用,利用组织培养时，分裂状态的细胞易受培养条件和外界压力（如射线，化学物质等）的影响而产生突变的原理，诱导并筛选出
8、对人类有用的突变体。,细胞产物的工厂化生产,红豆杉与紫杉醇,人参皂甘的生产,植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。,植物细胞和组织培养技术(PCTC),目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。,植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素和有机添加剂等。无机盐类 包括： 无机盐浓度一般为多少？微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。碳源和能
9、源 维生素 植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。,1、植物细胞培养基的组成,植物生长激素 大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。有机氮源 通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。有机酸 加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度接种的细胞和原生质体的
10、生长。复合物质 在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。,类型和方法:悬浮培养和固定培养 悬浮培养方法要求:材料(疏松易碎的愈伤组织,经过破碎的颈部组织)条件:水平震荡,合适的气体组成/pH特点 :对剪切力敏感 结团 生长速度慢 多泡沫 光照 无菌培养,图12-2大规模植物细胞固定化装置,含CaCl2的培养基,盖子,空气出口,海藻酸钠+细胞悬浮液,喷嘴,无菌空气入口,大规模固定化植物细胞的大规模固定化原则上可根据上述方法进行，但是不能再用塑料注射器，而需要采用如图12-2所示的大规模细胞固定化装置进行细胞的固定化。,动物细胞工程 应用,
11、动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,人耳鼠,“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。,在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。,人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？,1.发展历史:20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围
12、的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。,动物细胞培养,2、动物细胞培养的应用和概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官 和组织,
13、剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,剪碎组织的目的？,胰蛋白酶处理的目的？,3、动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,有关概念,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养） 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,有关概念,细胞株：传代
14、培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,动物组织细胞培养要求,一 体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。,二 培养工具:,培养瓶、
15、培养皿、培养管、多孔培养板等。,细胞培养以玻璃器皿为主。 器皿应选择透明度好、无毒、 中性硬度玻璃制品。,根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。,三、培养条件 细胞在体外培养中所需的条件 与体内细胞基本相同。,【讨论】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。,1）恒定的温度:37 ，,维持培
16、养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细胞代谢与温度成正比； 人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复； 在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复； 41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能； 当温度在43以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低,2）PH：7.2-7.,当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。用来检测PH的变化：红色-pH7.4， 橙
17、色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8。,3) 气体：,有调节PH的作用。 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。,4）营养培养基：,在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此
18、外细胞培养还需要一些常用的溶液。,合成培养基,1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。 人工合成培养基，如109培养液、DMEM、199、 RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。,天然培养基,直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。血清是天然培养基中最有效和最常用的
19、培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。,常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。,氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮
20、生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成05溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。,无血清培养基,动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。,5) 细胞培
21、养溶液,平衡盐水（BSS）：Hanks 液和Earle液是常用的BSS基础溶液。 PH调整液：NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸） 细胞消化液:胰蛋白酶溶液EDTA溶液胶原酶溶液,抗生素溶液： 1)青、链霉素:每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素. 2)卡那霉素：终浓度为50ug/ml培养液。 3）制霉菌素：浓度25U/ml，小瓶分装，每瓶一次用完。,6)、无污染环境,培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境
22、无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。,四 细胞培养设施,1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。 细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。,细胞培养实验室,1.准备室2.缓冲室,准备室,风淋,3.培养室,培养室,专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。 内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。 操作
23、间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。 缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等,风淋室：风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,超净工作台,也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。,CO2培养箱,哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般
24、不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一定量的CO2,一般5%即可维持培养液PH值稳定。,冰箱,细胞培养的冰箱应特别注意清洁， 防止污染。,水纯化装置 细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。,过滤装置,各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。,细胞冷冻贮存器 细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。,培养器皿 培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。,洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及
25、酸缸等。 分析间：显微镜、计算机及打印机等。,无菌操作的要领,由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。 超净工作台消毒 打开紫外线杀菌灯照射消毒2030分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。 洗手 操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。,火焰消毒,所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。 注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧
26、灼,否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带入培养液。,合理布局 右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。 酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立,易增加落菌机会）。 吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。,3.动物细胞培养 的条件,1.无菌无毒的环境 2.营养 3.温度和pH 4.气体环境,应该加入哪些物质？这些物质如何调配？,在使用合成培养基时通常需加入血清、血浆等天然成分，目的是什么？,4.动物细胞培养技术的应用,蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植 细胞的生理、药理、病理研究 用
27、于筛选抗癌药物,动物细胞培养技术条件要求: 工艺方式:分批 流加式 半连续式 连续式培养技术: 悬浮培养技术贴壁培养技术微载体培养技术多孔载体培养技术微囊化培养技术中空纤维细胞培养技术,植物组织培养和动物细胞培养的比较,细胞的全能性,细胞增殖,固体培养基,液体培养基,蔗糖 植物激素,葡萄糖 动物血清,植物体,细胞株、细胞系,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培
28、养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,3）细胞融合技术（体细胞杂交技术）,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,动物细胞融合,动物细胞融合,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法 化学法,仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,细胞融合与融合诱导细胞融合物质,诱导剂：仙台病毒聚乙二醇 电融合诱导
29、细胞融合的仙台病毒必须灭活。,细胞融合概述,细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。,细胞融合的定义,Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。2
30、0世纪80年代出现了电融合技术。,细胞融合研究进展,几种细胞融合成功的例子,植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,动物细胞融合实验使用的小白鼠,动植物细胞的融合过程,植物细胞融合过程,人造小鼠培育过程示意图,细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 的核
31、外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,细胞融合的基本原理,显微镜下细胞融合过程,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,细胞融合的常用方法,一、仙台病毒法,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段： 两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚； 在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； 细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； 融合成巨大细胞，仍需ATP 。,病毒促使细胞融合的主要步骤如下：,两个原生质体或细胞
32、在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,优点是易得，用法简单，融合效果稳定。 聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。 PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml培养液为1g重)，即成50PEG溶液。 PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。 通常用分子量低于1000的
33、PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。,二、聚乙二醇（PEG）法,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,聚乙二醇（PEG）法
34、细胞融合步骤（1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。 （6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。,三、电融合法,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤
35、害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。,电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。,电融合诱导法原理示意图,杂种细胞的筛选,杂种细胞的筛选,原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 1）亲本 2）同核体：同源原生质体的
36、融合体 3）异核体：非同源的原生质体的融合体 4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体 5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。 6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选,常用的杂种细胞筛选方法,植物细胞筛选方式,1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长,2）抗性互补筛选法
37、：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。 如： 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡,3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体亲本2：叶肉细胞原生质体在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分,4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质
38、体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。,动物细胞的筛选方式：,1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长,2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。,3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞
39、能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。,杂种细胞在植物育种中的应用,杂种细胞是一条新的育种途径，可以产生新经济性状的良种。 科学家已经在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了杂种再生植株。 一些近亲植物、有性不亲和的组合，如马铃薯番茄等都得到了再生植株。 目标：地上和地下部兼用种、固氮禾等具有两种不同优势性状的新品种。,3、细胞融合技术 在食品工业中的应用,（1）酵母菌的育种 （2）氨基酸生产菌的
40、育种 （3）酶制剂生产菌株的育种,细胞杂交瘤技术与单克隆抗体,一、何谓单克隆抗体？,什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。,B淋巴细胞与抗体,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点：特异性强、灵敏度高,只针对某一抗原决定簇,单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(my
41、eloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology ）。,Niels K. Jerne,G. Kohler,C. Milstein,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量
42、培养杂交瘤细胞,二、杂交瘤技术的基本原理,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,三、杂交瘤细胞的制备,（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,HAT培养基,次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基喋呤（aminopterin， A） 胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T）,次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,HAT培养基通过抑制瘤细胞的核苷酸合成，达到去除未融合瘤细胞的目的。
43、细胞有两条基本途径合成嘌呤核苷酸，一条是从磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物开始，叶酸是重要的辅酶，而氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞通过这一途径合成核苷酸。另一条途径是利用已存在的碱基，经特异的磷酸核糖转移酶催化合成核苷酸，如次黄嘌呤经过次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）转变为嘌呤核苷酸。融合所用的瘤细胞是选择出来的HGPRT缺陷细胞株，因此不能在HAT培养基中生长，而且不合成或不分泌免疫球蛋白。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖并分泌抗体。,（二）免疫小鼠,免疫程序是取68周龄BalbC雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于融合。
44、免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。,（三）脾细胞的制备,(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表； (2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次； (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗， 令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，
45、反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中 置5分钟； (6)离心(800一1000转分)计数、备用。,（四）细胞准备,（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37)，计数活力细胞(不少于90)； （2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37)，并计细胞数和测定活力细胞； （3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤 纸吸净多余上清。,（五）细胞融合,(1)将1ml 40的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管； (2)
46、在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完； (3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感， (4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀； (5)取96孔板，每孔加50l； (6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1； (7)送入5CO2，温箱中37培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。,（六）融合后细胞培养,(1)融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔23天半量换液一次； (2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液； (3)23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且
47、透明； (4)待集落增殖生长至13孔时，应进行抗体检测。,思考：,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传
48、病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,4） 细胞核移植技术,277次乳腺细胞核移植实验； 获得29个发育为8细胞的“胚”； 13头代孕母亲； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。,预想的克隆人技术路线,动物的胚胎移植,解决某些妊娠时间长、每胎产子数量少的优良种畜的繁殖速度问题。,胚胎移植技术,试管动物（婴儿）培养过程,受精卵,一、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、动物细胞全能性的表现程度不同,受精卵,胚胎干细胞,多能干
49、细胞,单能干细胞,体细胞,核移植,胚胎细胞核移植,体细胞核移植（难度高）,2、动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。,3.培育过程,母体子宫,4、原理,动物体细胞核具有全能性,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,克隆羊的成功证明了什么？,1、动物体细胞核具有全能性；2、细胞质具有调控细胞核发育的作用。,动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。,动物细胞特点？ 分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。 细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性,
