1、鞘内注射甘珀酸对佐剂性关节炎大鼠的抗伤害作用研究苏州大学附属第一医院麻醉科 215006侯永恒，杨建平，张慧娟，成浩，邹丽，王丽娜【摘要】 目的 研究鞘内注射缝隙连接阻滞剂甘珀酸（CBX）对佐剂性关节炎大鼠的抗伤害作用。方法 对所有大鼠 L4-5 鞘内置管，57 后保留无障碍者。 行为学研究：成年雄性大鼠 40 只随机平分为五组，在大鼠左后肢踝关节外侧皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）50l 建立佐剂性关节炎模型，分别以 CBX 0（NS 对照） 、25、50 和 100g 的剂量在致炎后 0.5h、1d 、3d、5d、7d、10d、14d鞘内注射，每次给药后 2h 测定双侧 PWTL。 形态学研
2、究：15 只雄性大鼠随机分为 3 组，每组 5 只。NS 对照组大鼠左后肢踝关节外侧皮下注射 NS 50l，其它组注射 CFA50l，3d 后 NS 对照组和CFA 模型组鞘内注射 NS 20l；CBX 处理组鞘内注射注射CBX100g（20l） 。鞘内给药后 2h，取脊髓腰膨大行 c-fos 免疫组织化学染色分析并 FLIN 计数。结果 1、单侧踝关节外侧皮下注射CFA 可以在致炎后 2h7d 诱导出双侧的热痛觉过敏，呈现明显的域外痛和镜像痛现象。鞘内注射 CBX 可以在炎性痛的不同阶段逆转这种痛阈改变（P0.05 或 0.01） 。2、单侧踝关节外侧皮下 CFA 致炎后的第 3 天腰段脊髓
3、双侧背角 c-fos 蛋白表达显著增加，表现为致炎后 FLI 神经元数量增加和体积增大。而这种改变可以被鞘内注射甘珀酸逆转，与 CFA 组比较差异具有显著统计学意义（P0.01） 。结论 结果证实甘珀酸，作为一种缝隙连接阻滞剂，对大鼠佐剂性关节炎诱导的病理性疼痛（包括域外痛和镜像痛）具有显著的抗伤害作用，提示缝隙连接可能参与炎性疼痛的中枢敏感化过程。【关键词】 佐剂性关节炎; 炎性痛；缝隙连接; 甘珀酸；脊髓背角；c-fos 蛋白Antinociceptive Effects of Intrathecal Carbenoxolone on Adjuvant Arthritis RatsObje
4、ctive To investigate the antinociceptive effects of intrathecal carbenoxolone (CBX), a gap junction blocker, on adjuvant arthritis rats. Methods Chronic lumbar intrathecal catheters were implanted and then confirmed in all rats. 1) Animal behavior research：40 rats were randomly divided into 4 groups
5、. Adjuvant arthritis model was produced by inoculation of complete Freuds adjuvant (CFA) at outer side of left ankle joint. Four doses of CBX (0, 25, 50, 100g) were respectively administered in 4 groups at 0.5h, 1d, 3d, 5d, 7d, 10d, 14d post-CFA. Bilateral PWTL was measured at 2h after each drug del
6、ivery. 2) Morphological study: 15 male rats were randomly divided into 3 groups (n=5). NS control group rats were given hypodermic injection of NS 50l at outer side of left ankle joint, whereas others were given CFA 50 l inoculation. 3d later, NS control group and CFA group rats were given intrathec
7、al injection of NS 20 l, and CBX group CBX 100g (20 l). 2 h after every drug delivery, spinal intumescentia lumbalis were taken to conduct c-fos immunohistochemistry staining analysis and FLIN counting. Results 1) CBX could reverse periphery CFA-induced thermal hyperpalgesia dose-dependently in all
8、phrases of inflammatory pain (P0.05 or 0.01). 2) Expression of c-fos protein in lumbar spinal bilateral dorsal horn increased significantly at the 3rd day after CFA injection，with an increase in FLI neurons numbers and size. Intrathecal carbenoxolone could reverse such change. Compared with CFA grou
9、ps, the difference is of statistic significance (P0.01). Conclusion These findings proved that carbonexolone, as a kind of GJ blocker, has significant antinociceptive effects on adjuvant arthritis-induced pain（including extraterritorial and mirror-image pain）, which suggests gap junction may play an
10、 important role in central sensitization of inflammatory pain .Key words Adjuvant induced arthritis rats, Inflammatory pain, Gap junctions, Carbenoxclone，spinal dorsal horn，c-fos protein病理性疼痛是指由组织损伤和炎症、神经系统损害或神经系统功能改变引起的疼痛现象。其重要特征之一就是痛觉感受野的扩大，表现为原发损伤组织或神经的周围甚至对侧相应部位出现的自发性疼痛或疼痛过敏状态，分别被称为域外痛（extraterr
11、itorial pain）和镜像痛（mirror-image pain） 。我们对这些疼痛的作用机制几乎是毫不知道，一般认为与脊髓的中枢敏感化有关。近年来研究表明脊髓胶质细胞及其缝隙连接可能在病理性疼痛发生发展过程中起着重要作用 1。缝隙连接（Gap junction，GJ）是细胞间一种能够直接进行物质和信息交换的通道，允许离子、代谢物质及第二信使（cAMP、Ca 2+、IP 3）的通过，从而构成细胞间缝隙连接通讯，对细胞的生长、分化和信号转导等生理过程具有重要意义。缝隙连接在脊髓胶质细胞表达丰富，星形胶质细胞主要表达连接蛋白 Cx43。研究表明中枢神经系统的神经胶质细胞可以通过缝隙连接广泛偶
12、联，形成一种网络或合胞体结构，通过一种 Ca2+波或振荡的形式参与信号的扩布或易化，在病理性疼痛的信号传布以至中枢敏感化过程中起着重要作用 23。甘珀酸（Carbenoxolone，CBX）是一种公认的 GJ 阻滞剂，被广泛应用于国内外 GJ 的研究中。有实验证明 鞘内注射甘珀酸可以提高正常大鼠痛阈 4，但有关其对炎性痛中的作用未见报道。我们采用大鼠佐剂性关节炎性痛模型（Adjuvant arthritis，AA） ，通过观察热缩足反射潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)和脊髓双侧背角 c-fos 表达的变化，来研究甘珀酸的抗伤害性效应及其可能机制。
13、材料与方法1、动物选择 成年雄性SD大鼠，体重180220 g，清洁级，由苏州大学医学院实验动物研究中心提供。大鼠在戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下行脊髓蛛网膜下腔置管 5，置管4 5d后进行行为学测试，肢瘫或导管脱出者予以剔除。2、实验药物 完全弗氏佐剂（CFA，sigma） ，大鼠在异氟烷（2% 4% ）吸入麻醉下，于左后肢踝关节外侧皮下注射 CFA50l制作大鼠炎性痛动物模型，对照组注射生理盐水（NS）50l。甘珀酸（CBX，Sigma）为白色固体粉末，实验当天以生理盐水溶解稀释至2.5、5、10g/l，调节PH至7.2。进行鞘内注射时，每只大鼠用 25l微量注射器吸取10lCBX 溶液及9l生
14、理盐水，中间以 1l空气相隔，缓慢注入蛛网膜下腔。NS对照组（0g）注射等体积的生理盐水。3、实验分组 行为学研究：成年雄性大鼠40只随机平分为五组，在大鼠左后肢踝关节外侧皮下注射CFA 50l建立佐剂性关节炎模型，分别以CBX 0（ NS对照） 、25、50和100g的剂量在致炎后0.5h、1d、3d、5d、7d、10d、14d鞘内注射，每次给药后 2h测定双侧PWTL。 形态学研究：15只雄性大鼠随机分为 3组，每组5只。NS对照组大鼠左后肢踝关节外侧皮下注射NS 50l，其它组注射CFA50l， 3d后NS对照组和CFA模型组鞘内注射 NS 20l；CBX处理组鞘内注射注射CBX100g
15、（20l） 。鞘内给药后2h，取脊髓腰膨大行c-fos免疫组织化学染色分析并 FLIN计数。4、热缩足反射潜伏期测定 将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，把大鼠放入适应30min 后，用BME-410 型热辐射刺激仪（10V，30W ，光斑直径0.5cm ）照射大鼠足底皮肤。照射开始至大鼠出现抬腿回避的时间为热缩足反射潜伏期。切断时间为30s，以防止组织损伤。每只动物测定3次，每次间隔6-8min，取其平均值。所有大鼠在致炎前一天测定其痛阈基础值（Baseline，BL） 。5、免疫组织化学 鼠腹腔注射1戊巴比妥钠60mg/kg深麻醉后，经主动脉灌注生理盐水100 ml，4多聚甲醛400ml
16、继续灌注，取L3L5脊髓，在 4多聚甲醛中后固定4 h，然后移入30蔗糖中，至组织沉底。将脊髓制成40m切片，将切片收集在0.01 mol/L PBS中，3% 过氧化氢及5正常羊血清室温孵育后，滴加兔抗大鼠c-fos(1：1:800 )(Sigma，美国)，4孵育48h后，PBS冲洗，滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37孵育2 h后PBS 冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37孵育2 h后PBS冲洗，DAB 显色，贴片，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，凉干。阴性对照实验中，用PBS代替一抗或二抗。切片用奥林巴斯照相机（Olympus，C7070wz）于倒置显微镜（Olympus，CKX41
17、)下照相，采用Image-Pro Plus4.5软件，按照 Molander等 6对脊髓灰质的分层，对照片进行c-fos神经元(c-fos-like immunoreactivity，FLI)计数，计算平均值。6、统计方法 所有数据均以均数标准差 ( s)表示，用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD法方差分析。P 0.05为差异有显著意义。结 果1注射 CFA 后大鼠双侧后爪 PWTL 的时程变化。实验发现单侧踝关节外侧皮下注射 CFA 可以诱导出双侧的热痛觉过敏，虽然以致炎同侧较为显著（P0.01） ，但是仍呈现明显的镜像痛现象（P0.0
18、1） ，双侧具有部位对称性和时程平行性。在镜像侧，PWTL 的下降与 NS 组对应侧相比，在致炎后 2h 已很明显（P0.01） ，在 1d 达到高峰（P 0.01） ，然后逐渐恢复，7d 基本恢复到基础水平（图 1） 。此外，值得注意的是，大鼠注射 CFA 后，致炎侧产生了显著的炎症表现（水肿和红斑） ，而对侧无明显变化。2、鞘内注射甘珀酸对佐剂性关节炎大鼠双侧 PWTL 的影响 CBX 在炎性痛的不同阶段都可以逆转外周 CFA 诱导的辐射热痛过敏，包括继发性痛觉过敏和镜像痛。结果显示：在致炎后2h14d，鞘内注射三个不同剂量的 CBX（25、50 和 100g）均显著提高了大鼠炎症侧的 P
19、WTL 痛阈（P0.01） ，呈剂量依赖性，其中 25g 组痛阈则大致保持于基础值水平，而 50 和 100g 组则在超过基础值后继续提高（图 1） 。3、鞘内注射甘珀酸对 CFA 致炎后第 3 天大鼠脊髓背角 c-fos 表达的影响：脊 髓 灰 质 有 较 清 晰 蝶 形 轮 廓 ， 在 背 角 相 当 于 、 层 处 着 色较 深 ， 呈 扁 圆 形 。 FLI 神 经 元 在 低 倍 (40)及 高 倍 镜 (200)下 ，显 示 为 在 清 晰 背 底 下 的 棕 色 或 棕 深 色 的 小 圆 点 (细 胞 核 )， 主 要 分布 在 脊 髓 背 角 相 当 于 、 层 部 位 （
20、图 2） 。 一侧大鼠肢踝关节外侧皮下 CFA 致炎后第 3 天引起的腰段脊髓双侧背角 c-fos 蛋白表达显著增加，表现为致炎后 FLI 神经元数量增加和体积增大（图 2-C、 2-D） 。而给予甘珀酸处理，可以逆转这种改变，与 CBX 组比较差异具有显著统计学意义（图 2-E、2-F，表 1） 。表 1 CFA 致炎后第 3 天各组脊髓双侧背角 c-fos 蛋白阳性神经元的数值变化Number of FLI neurons GroupL RNS 75.512.18 73.3313.94CFA 178.1727.49 * 13128.06 *CBX 62.3321.25 # 60.8314.
21、27 #（n5；与 NS 组比，* P0.05 * P0.01；与 CFA 组比，# P0.05 # P0.01）讨 论炎性痛是一种常见的病理性疼痛，严重影响着患者的日常生活。本实验通过大鼠踝关节外侧皮下注射 CFA，形成一种较为局限的病灶，其炎症强度相对较轻，分期明显，易于观察和评估。其一般分期为急性期（2h-4h），亚急性期（4h-4d），慢性期（4d-14d） 7。本实验所采用的时间点，基本反映了不同阶段的疼痛变化规律。由于实验采用的注射部位避开足底，通过测定大鼠双侧 PWTL 或PWMT 变化，可以更客观地观察域外痛和镜像痛现象。实验结果表明大鼠一侧踝关节外侧皮下注入 CFA，可以在致
22、炎后 2h7d 诱导出双侧的热痛觉过敏，呈现明显的域外痛和镜像痛现象。目前炎性痛的治疗多采用非甾体类抗炎药和阿片类药物，其临床治疗效果并不理想。最近有学者提出，星形胶质细胞和小胶质细胞活化是病理性疼痛的发生器，而胶质细胞 GJ 网络能够通过钙振荡或钙波通讯向外周传播伤害性信号，导致远处新突触生成，形成新的神经元联系，从而使得痛觉得以维持并扩布 3。如果这一理论成立的话，那么胶质细胞及其相关的缝隙连接通讯就有可能成为炎性痛治疗的新靶点。甘珀酸，全称为氢琥珀酸甘草次酸，国内商品名为生胃酮，是从中药甘草的提取的 18- 甘草次酸的琥珀酰酯，曾用于消化性溃疡的治疗。CBX 是一种非特异性的缝隙连接阻滞
23、剂。其机制主要是通过分裂连接子之间的组合，涉及缝隙连接蛋白的去磷酸化；另一方面也可能通过改变缝隙连接蛋白的表达而实现的 8 。已有研究发现在坐骨神经结扎模型中，大鼠脊髓背角星形胶质细胞 Cx43 表达增加 9。鞘内给予 CBX 能够逆转神经病理诱导的镜象疼痛和鞘内注射 HIV1 包膜蛋白 gp120 所诱导的异常痛，能够减少 gp120 诱导的促炎细胞因子的产生 10。但是有关 GJ 在炎性痛中的作用还没有被研究。本实验证明鞘内注射 CBX（25、50、100g）在不同阶段都能够显著逆转外周 CFA 诱导的痛觉过敏，呈剂量依赖性，尤其CBX25g 就足以逆转 CFA 导致的炎性痛，而不引起痛觉
24、迟钝。结果提示缝隙连接可能参与到急性炎症损伤到病理性疼痛的演变过程。脊髓背角 c-fos 蛋白表达已被广泛接受作为伤害性反应神经元的间接生物学标志，其表达的形式和密度同伤害性刺激的本质和强度或炎症反应程度直接相关 11。我们选择炎性疼痛充分发展的第 3 天，观察大鼠脊髓后角 c-fos 蛋白表达。结果发现：CFA 致炎可以引起c-fos 大量表达于双侧脊髓背角第 I-II 层，和文献报道类似 12。而在给予甘珀酸 100ug 处理后，c-fos 在脊髓背角第 I-II 层中的表达明显减少，和正常大鼠 c-fos 的表达几乎相当。这就从细胞水平表明甘珀酸的抗伤害作用。综上，本实验从行为和形态学证
25、实了鞘内注射甘珀酸无论在基础还是在炎性痛状态均具有显著的抗伤害作用。其机制可能是通过阻滞脊髓胶质细胞间缝隙连接，影响伤害性神经元的敏感性和可塑性改变。这提示我们缝隙连接可以成为病理性疼痛治疗的一个新靶点，并具有光明的前景。参 考 文 献1. Watkins LR，Milligan ED，Maier SF. Glial activation: a driving force for pathological pain. Trends Neurosci，2001，24(8):450-5.2. Rash JE, Yasumura T, Dudek FE, et al. Cell-specific e
26、xpression of connexins and evidence of restricted gap junctional coupling between glial cells and between neurons.J Neurosci, 2001,21:1983-2000.3. Hansson E. Could chronic pain and spread of pain sensation be induced and maintained by glial activation? Acta Physiol, 2006, 187:321-327.4. 张辉,段丽,张光运,等.
27、鞘内注射甘珀酸对大鼠热痛刺激反应的影响.中国神经科学杂志,2003,19:88-91.5. 杨建平,蒋豪,吴珏.大鼠蛛网膜下腔埋管并长期留置操作的改进.中华麻醉学杂志,1993,13:110-112.6. Molander C, Xu Q, Grant G. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the rat: I. The lower thoracic and lumbosacral cord. J Comp Neurol, 1984, 230:133-141.7. Raghavendra V, Tanga FY,
28、 DeLeo JA.Complete Freunds adjuvant-induced peripheral inflammation evokes glial activation and proinflammatory cytokine expression in the CNS. Eur J Neurosci, 2004, 20:467-473.8. Berthoud VM, Beyer EC, Seul KH. Peptide inhibitors of intercellular communication. Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 20
29、00, 279: 619-622.9. 许学兵，姚尚龙，余守章，等.慢性神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞缝隙连接蛋白 43 表达的变化.中华麻醉学杂志,2004,24:787-790.10. Spataro LE, Sloane EM, Milligan ED, et al. Spinal gap junctions: Potential involvement in pain facilitation. J Pain, 2004, 5:392-405.11. Harris JA. Using c-fos as a neural marker of pain. Brain ResBull, 19
30、98, 45: 1-8.12. Abbadie C,Besson JM.c-fos expression in rat lumbar spinal cord during the development of adjuvant-induced arthritis.Neurosci,1992,54:985.BL2h1d3d5d7d10d14d681012141618202242628 * *TimecoursePWTL(s) LBL2h1d3d5d7d10d14d681012141618202242628 *CBX10 5 2 NSTimecourse R图 1 鞘内注射甘珀酸对佐剂性关节炎大鼠双侧 PWTL 的影响与 NS 组比， * P0.05 * P0.01图 2. 鞘内注射甘珀酸对佐剂性关节炎大鼠腰段脊髓双侧背角 c-fos蛋白表达的影响（显微切片图）A, B: NS 组 (n=5)；C, D: CFA 组 (n=5)；E, F: CBX 组 (n=7)。A、C、E 左侧（致炎同侧） ；B、D、F，右侧（致炎对侧） 。 （标尺=50 m）
