1、实验设计方案题目：超声波辅助双水相萃取石榴皮中原花青素1 材料与方法1.1 实验材料石榴皮（从滨河集团国风酒业下脚料中捡取并粉碎过目）1.2 实验方法1.2.1 试剂和仪器无水乙醇、香草醛、甲醇、浓盐酸、硫酸铵、蔗糖、食盐、抗坏血酸、柠檬酸均为分析纯；儿茶素、上海友思生物技术有限公司；紫外分光光度计、电子天平（PL203 ） 、FH3 型恒温磁力加热搅拌器、PHS-3C 酸度计、超声波。1.2.2 乙醇-硫酸铵双水相体系低级醇-盐双水相体系中水溶性有机溶剂选择乙醇，析盐相选择硫酸铵。乙醇-硫酸铵双水相体系参照文献（罗建平等 2011） ，在水溶性乙醇中加入硫酸铵，利用硫酸铵的盐析作用形成双水相
2、体系，通过改变乙醇与水的比例和盐的用量可以控制双水相体系的形成，水、硫酸铵、乙醇总的双水相反应体系为 10g。1.2.3 原花青素的超声提取与双水相分离称取一定量的硫酸铵固体于干净的试管中，在试管中加入一定量的蒸馏水，摇至硫酸铵固体完全溶解，再加入一定量的无水乙醇，然后按一定的料液比准确称取一定量的石榴皮粉末于乙醇-硫酸铵双水相体系中，充分混匀后，超声提取一定时间，静置 30min，待完全分层后，分别测定上相乙醇相和下相清液中原花青素的含量。计算石榴皮中原花青素的提取率和分配系数。提取率=（原花青素提取物质量/石榴皮粉末质量）100%K=c 上 /c 下1.2.4 香草醛-盐酸法测定原花青素的
3、含量1.2.4.1 标准曲线制作测定方法参照文献1，选儿茶素为标准，分别吸取不同浓度的儿茶素标准溶液 0.5ml，加 3ml4%香草醛甲醇溶液，再加入 1.5ml 浓盐酸，避光反应15min。以 0.5ml 蒸馏水， 3ml4%香草醛甲醇溶液，和 1.5ml 浓盐酸为空白对照，避光反应 15min。在 500nm 处测定吸光值。以反应体系所测吸光值为纵坐标，儿茶素含量为横坐标，做标准曲线，求得回归方程为 y=6.0271x + 0.0105 ，R 2=0.9986,y 代表吸光值，x 代表儿茶素含量（mg ） 。1.2.4.2 原花青素含量的测定吸取 4%香草醛甲醇溶液 3ml，浓盐酸 1.5
4、ml，加入萃取样品液 0.5ml(若浓度较大，可以进行适当倍数的稀释)，避光反应 15min，在 500nm 处测定吸光值。计算出原花青素的提取率和双水相体系的分配系数。1.3 实验设计1.3.1 Plackett-Burman(PB)实验设计Plackett-Burman(PB)实验设计法是一种 2 水平的试验设计方法，可以分清实验因素对指标影响的大小，找出主要因素，抓住主要矛盾，用此方法可以使试验次数减少，而影响因素的主要效果得到尽可能准确的估计，能从众多的考察因素中尽快而有效地筛选出最为重要的几个因素 (赵沁沁等 2011),以便后面进一步研究。本文在预实验的基础上设计了高低两个水平，并
5、通过 Design-expert 软件进行了 Plackett-Burman 试验设计。1.3.2 最陡爬坡实验（Steepest ascent design）根据 Plackett-Burman(PB)实验设计找出显著因素后，安排最陡爬坡试验，要先逼近最佳区域后再建立有效地响应面拟合方程（汪彬彬等 2011） 。最陡爬坡法试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速，经济地逼近最佳区域(赵沁沁等 2011)。可以了解实验因素岁试验指标影响的规律性，即每个因素的水平改变时，指标是怎样变化的。1.3.3Box-Benhnken Design(BBD)实验设计Box-
6、Benhnken Design(BBD)法是利用合理的实验设计并通过实验得到一定数据，采用多元二次方程来拟合因素和响应面值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优提取条件，解决多变量问题的一种统计学方法（汪彬彬等 2011） ，与其他方法相比，Box-Benhnken Design 试验减少了试验次数，周期短，得到的回归方程精确度高，又能研究好几个因素之间的交互作用，是解决生产过程中实际问题的一种有效办法。1.4 石榴皮原花青素的分离纯化1.4.1 静态吸附和静态吸附动力学实验在三角瓶中加入 1.5g 经处理的树脂，再加入 20ml 石榴皮原花青素原液，用保鲜膜封口，放入 25恒温振荡器
7、中振荡。静态吸附实验时，将树脂与吸附后的石榴皮原花青素样液分离，测定样液的原花青素浓度（mg/ml）;静态吸附动力学研究时，定时取样，测定样液中石榴皮原花青素浓度（mg/ml） ，按下式计算吸附率（%）和吸附量（mg/g） 。 %10原 液 浓 度样 液 浓 度原 液 浓 度吸 附 率 树 脂 干 重 体 积样 液 浓 度 ）（ 原 液 浓 度吸 附 量1.4.2 大孔吸附树脂静态解吸试验选择不同浓度的乙醇溶液对吸附原花青素的树脂进行解吸试验，测定解吸后溶液（解吸液）的体积（ml）和石榴皮原花青素浓度（mg/ml） ，按下式计算解吸率（% ） 。%10体 积样 液 浓 度 ）（ 原 液 浓 度
8、 解 吸 液 体 积解 吸 液 浓 度解 吸 率1.5 石榴皮原花青素稳定性的研究1.5.1 光照对石榴皮原花青素稳定性的影响用蒸馏水配置一定浓度的石榴皮原花青素样品溶液，取等量的两份该样品溶液分别置于两支小试管中，并用保鲜膜封口，将一份置于避光条件下保存，另一份至于日光直射条件下保存，每隔 2 小时测定样品溶液中石榴皮原花青素含量。1.5.2 温度对石榴皮原花青素稳定性的影响用蒸馏水配置一定浓度的石榴皮原花青素样品溶液，取等量的 4 份该样品溶液分别置于 4 支小试管中，并用保鲜膜封口，分别将加有样液的这 4 支试管置于 20、40、60、80的条件下避光保存，每隔 2 小时测定样品溶液中石
9、榴皮原花青素含量。1.5.3 pH 值对石榴皮原花青素稳定性的影响取一定量的已配好的石榴皮原花青素溶液 4 份，调节使其 pH 分别为2、4、6、8 的溶液待用，分别取等量的 4 份上述样品溶液置于 4 支干净的小试管中，并用保鲜膜封口，摇匀后，避光保存，每隔 2 小时测定样品溶液中石榴皮原花青素含量。1.5.4 食品添加剂对石榴皮原花青素稳定性的影响配制浓度 10%蔗糖溶液，10%食盐溶液，0.2%Vc 溶液，1%的柠檬酸溶液，分别取等量的 3 份石榴皮原花青素样品溶液置于 3 支干净的小试管中，然后加入等量不同种类的食品添加剂溶液，并用保鲜膜封口，避光保存，每隔 2 小时测定样品溶液中石榴皮原花青素含量。2 结果与分析
