1、1第二章 克隆技术第一节什么是克隆1.克隆技术指从众多的基因或细胞群体中通过 和选择获得目的基因或 的技术操作。2.克隆技术的发展历程克隆技术从分子到细胞、个体的发展过程为 、 、 。3.克隆的条件克隆需要以下基本条件：（1）具有包含物种完整基因组的 的活细胞（如乳腺上皮细胞） ；（2）能有效调控细胞核发育的 物质（如去核卵的细胞质） ；（3）完成 的必要的环境条件（如诱导核 质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境） 。4.个体克隆成功的根本原因：5.克隆产生的子代个体与亲代个体基因相同，但不是完全相同原因：第二节植物克隆1 过程：2 植物克隆的技术基础：植物组织培养3 植物组织培
2、养的理论基础（原理）：细胞的全能性植物细胞全能性：植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而具有发育成完整植株的潜能。为什么植物细胞具有全能性？细胞具有发育成完整个体所需要的全套基因细胞全能性的比较：受精卵生殖细胞体细胞植物细胞动物细胞分化程度低的细胞分化程度高的细胞4 脱分化与再分化的比较：2植物组织培养程序 、配置半固体培养基、获取植物组织、获得愈伤组织、培育新植株植物克隆成功的条件：1、深入探讨特定植物细胞全能性的表达条件2、尽量选择性状优良、细胞全能性表达充分的 基因型植物体细胞杂交 植 物 细 胞 杂 交、意 义 ： 克 服 远 缘 杂交 不 亲 和 的 障 碍 ，培 育 出 作
3、 物 新 品种 。、植 物 组 织 培 养杂 种 植 株 是 几倍 体 ？ 融 合 方法 ？该过程中去掉细胞壁的方法是使用 纤维素酶和果胶酶 ；诱导融合的方法有物理法（离心、振动、电激） 、化学法（聚乙二醇） ；终点应该是 杂种植株；该育种方法的最大优点是 克服远缘杂交不亲和障碍 （与基因工程育种优点相同，一定记准了） 。该技术培育过程中注意的问题若两个不同品种的植物细胞 A、B 进行融合，A 含有 2X 条染色体，2 个染色体组，基因型为 Aabb，B 含有 2Y 条染色体，2 个染色体组，其基因型为 ccDd，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体为 2X+2Y，基因型为 AabbccDd，
4、从中不难看出，体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管染色体、基因组还是染色体组都采用直接相加的方法。3、3. 如 图 为 植 物 体 细 胞 杂 交 过 程 示 意 图 。 据 图 回 答 ： （ 1） 步 骤 是 ， 最 常 用的 方 法 是 。 （ 2） 步 骤 一 般 常 用 的 化 学 试 剂 是 ，目 的 是 。（ 3） 在 利 用 杂 种 细 胞 培 育 成 为 杂 种 植 株 的 过 程 中 ， 运 用 的 技术 手 段 是 ， 其 中 步 骤 相 当 于 ，步 骤 相 当 于 。对 应 训 练 去 掉 细 胞 壁 ,分 离 出 原 生 质 体用 纤 维 素 酶 和 果 胶 酶
5、 聚 乙 二 醇 （ PEG）诱 导 原 生 质 体 融 合植 物 组 织 培 养 脱 分 化再 分 化（ 4） 植 物 体 细 胞 杂 交 的 目 的 是 获 得 新 的 杂 种 植 株 。 使 能 够 在 新的 植 物 体 上 有 所 表 现 ， 其 根 本 原 因 是 。（ 5） 若 远 缘 杂 交 亲 本 A和 B都 是 二 倍 体 ， 则 杂 种 植 株 为 倍 体 。 （ 6） 从 理 论 上 讲 ， 杂 种 植 株 的 育 性 为 。 若 运 用 传 统 有 性 杂 交 方 法 能 否 实验 ？ ， 说 明 理 由 。 因 此 ， 这 项 研 究 对 于 培养 新 作 物 品 种
6、 方 面 的 重 大 意 义 在 于 。（ 7） 利 用 植 物 体 细 胞 杂 交 的 方 法 培 育 作 物 新 品 种 过 程 中 ， 遗 传 物 质 的 传 递 是 否遵 循 孟 德 尔 的 遗 传 规 律 ？ 为 什 么 ？ 。只 有 有 性 生 殖 进 行 减 数 分 裂 产 生 配 子 时 才 符 合 孟 德 尔 遗 传 定 律 ， 而 植 物 体 细 胞杂 交 过 程 没 有 该 过 程 两 亲 本 的 遗 传 特 征杂 种 植 株 获 取 了 双 亲 的 遗 传 物 质四可 育不 能 不 同 种 生 物 之 间 存 在 生 殖 隔 离克 服 远 缘 杂 交 不 亲 和 障 碍
7、不 符 合4第三节 动物克隆1 动物细胞培养：（1）过程：（2）原理：（3）.培养条件a 无菌、无毒的环境：培养液应进行 无菌 处理。b 营养：合成培养基成分有糖、 氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素，通常需加入 血清、血浆等。c 温度：适宜温度为 36.50.5;pH 为 7.27.4 。d 气体环境：空气 95%，CO25%。e 动物细胞培养的最主要应用是制备单克隆抗体；检测有毒物质毒性大小的原理是 根据发生畸变的细胞与培养液中总细胞数的比例，比例越大毒性越大。拓展1.为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养？提示 幼龄动物组织或胚胎的细胞分化程度低，增殖能力很强，更易于培养。2.动物细
8、胞培养需要脱分化吗？为什么？提示 脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种、快速繁殖种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细
9、胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？提示 用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜 pH 约为 2，当 pH 大于 6 时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境 pH 为 7.28.4。多数动物细胞培养的适宜 pH 为 7.2 7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。4.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？提示 胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会
10、消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。55.细胞培养需满足哪些条件？提示 （1）充足的营养供给微量元素、无机盐、糖、氨基酸、促生长因子、血清等。（2）适宜的温度：36.50.5；适宜 pH：7.27.4。（3）气体环境O2有氧呼吸、细胞代谢（95%）CO2维持 pH（5%）（4）无菌、无毒环境培养液和培养用具杀菌消毒培养过程加抗生素杀菌定期更换培养液，清除代谢产物6.该技术在实践方面有何用途？提示（1）生产生物制品：疫苗、干扰素、抗体等。（2）作为基因工程中受体细胞。（3）检测有毒物质及毒性。（4）科研方面：筛选抗癌药物、治疗和预防疾病。提醒 理解一组概念：细胞贴
11、壁生长、接触抑制、原代培养、传代培养。细胞贴壁生长: 接触抑制制成细胞悬液的主要目的：使培养的细胞与培养液充分接触。原代培养和传代培养将动物的器官或组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散成单个细胞，然后制成细胞悬液，放入培养瓶内，放在适宜的条件下培养，一般细胞繁殖 110 代，就发生接触抑制，这种培养叫原代培养。原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，还要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理后，再分瓶培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。传代培养一般传至 10 代直至 50 代就不能再分裂了，这时细胞核内遗传物质未发生变化，形成的细胞群叫细胞株。传代培养过程中有个别细胞传至 50 代以后，由于遗传物质改变
12、，失去接触抑制，成为无限增殖的细胞。说明 分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。7 植物组织培养与动物细胞培养的主要区别：2。动物细胞的融合与单克隆抗体1.动物细胞融合（1）概念：指 或 动物细胞结合形成一个细胞的过程，也称细胞杂交。6（2）结果：形成 细胞。（3）过程：不同 的两个细胞 细胞。（4）意义：克服了 杂交的不亲和性，成为研究 、 、肿瘤和生物 培育的重要手段。2.单克隆抗体（1）抗体：由 B 淋巴细胞产生，成分为球蛋白，具有特异性。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：（ 2） 单 克 隆 抗 体 的 制 备
13、过 程 ： 灭 活 的 病 毒 杂 交DNA远 缘 细 胞 遗 传 细 胞 免 疫新 品 种特 异 性给 小 鼠 注 射 特 定 的 抗 原 蛋 白 从 中 分 离B淋 巴 细 胞脾 脏培 养 骨 髓 瘤 细 胞 骨 髓 瘤 细 胞 灭 活 病 毒 细 胞细 胞 细 胞融 合瘤 瘤BB杂 交 瘤 选 择 培 养 基细 胞杂 交 瘤 杂 交 瘤 细 胞 的 特 点 ： 既 能 大 量 ， 又 能 产 生 。 单 克 隆 抗 体 的 优 点 ： 强 、 高 、 产 量 大 。 克 隆检 测杂 交 瘤 细 胞小 鼠 体 内 培 养体 外 培 养抗 体单 克 隆单 克 隆 抗 体增 殖特 异 性 灵
14、敏 度归 纳 深 化【 深 化 】1 .为 什 么 不 用 两 个 而 要 用 多 个 细 胞 进 行 动 物 细 胞 间 的 融 合 ？ 提 示 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 1 0 0 %、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、2 .动 物
15、 细 胞 融 合 技 术 原 理 ， 最 有 价 值 的 应 用 是 什 么 ？ 细 胞 融 合 完 成 的 标 志是 什 么 ？ 提 示 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、杂交瘤细胞的特点：既能大量 ，又能产生 。单克隆抗体的优点： 强、 高、产量大。1.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？提示 就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是 100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一
16、定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。2.动物细胞融合技术原理，最有价值的应用是什么？细胞融合完成的标志是什么？提示 原理为细胞膜的流动性，最有价值的应用是制备单克隆抗体，细胞融合完成的标志是细胞核融合成一个核。提醒 若 A 和 B 两种细胞融合，则融合方式有三种：AA、BB、AB，满足要求的为 AB，所以融合后要筛选。动物细胞融合特有的诱导方式为灭活的病毒处理，其它物理、化学诱导融合的手段与植物体细胞杂交过程中原生质体融合方法相同。3.单克隆抗体的确切定义是什么？提示 单一抗体细胞的无性繁殖系。4.制备单克隆抗体时，为什么要选用 B 淋巴
17、细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？提示 乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的 B 淋巴细胞，B 淋巴细胞能分泌相 灭 活 的 病 毒7应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种 B 淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的 B 淋巴细胞大量增殖。B 淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外大量增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。5.制备单克隆抗
18、体过程中为什么要两次筛选？筛选的目的作用是什么？ 提示 第一次筛选是将未融合的 B 淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及 BB 融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰死亡，筛选出 B 瘤融合的细胞。第二次筛选是将产生特定抗体的 B 瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的 B 淋巴细胞时会取出很多种，形成杂交瘤细胞也会有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。6.获取单克隆抗体的场所有哪些？提示 在培养液中进行杂交瘤细胞的培养，则从培养液中提取；若在小鼠或其它动物腹腔中进行培养，则从腹水中提取。提醒 从小鼠或其它动物体中取 B 淋巴细胞前必须先注射抗原，体内发生免疫反应，
19、而且参与融合的细胞应是浆细胞（只有浆细胞能产生抗体）或已免疫过的 B 淋巴细胞，不能简单说 B淋巴细胞。融合过程中一共有五种类型细胞，未融合的两种，已融合的有三种：BB、瘤瘤、B 瘤，需要的只有 B 瘤细胞。诱导融合的方法有物理方面的离心、振动、电激三种；化学方面的聚乙二醇（PEG） ；生物方面的灭活的病毒（动物细胞融合特有的方法） 。做题时一定按题目的要求选择用什么方法。3 动物细胞核移植技术1.动物细胞核移植将动物的一个细胞的细胞核移入一个去核的 细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终成为动物个体。2.种类（1） 细胞核移植 易（2） 细胞核移植 难3.过程8卵母细胞必须选用
20、减中期细胞，原因是该时期卵母细胞核位置靠近第一极体，便于一并吸出拓展1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？提示 为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。2.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了 100%的复制吗？为什么？提示 克隆动物绝大部分 DNA 来自于供体细胞核，但其核外还有少量的 DNA，即线粒体中的 DNA 是来自于受体卵细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。 此外，即便动物
21、的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，供核动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和供核体动物完全相同。 另外，在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供体动物没有的性状。 基于上述三个方面的原因，克隆动物不会是供体动物 100%的复制。提醒 细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。受体细胞为减数第二次分裂中期的次级卵母细胞，此时在透明带内包含着第一极体，在去核的同时连同第一极体一并去掉。该技术形成重组细胞发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。用卵母细胞做受体细胞原因：a.卵母细胞体积大，便于操作；b.卵黄多，营养物质丰富；c.易激发细胞核全能性的表达。克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。
