水产品中孔雀石绿及其代谢物残留快速测定-胶体金免疫层析法.doc

1、ICs 67.050B 50 DB61陕 西 省 地 方 标 准水产品中孔雀石绿及其代谢物残留快速测定-胶体金免疫层析法Determination of Malachite green and the corresponding metabolites in aquatic products-colloidal gold immunochromatography（征求意见稿）发 布I前 言本标准由陕西省水产研究所提出。本标准由陕西省农业农村厅归口。本标准起草单位：陕西省水产研究所、农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（西安）、无锡中德伯尔生物技术有限公司、国家水产品质量监督检验中心、

2、西安市食品药品监督检验所。本标准起草人：杨元昊，李毅，杨娟宁，周丽，李峰钢。本标准由陕西省水产研究所解释。1水产品中孔雀石绿及其代谢物残留快速测定-胶体金免疫层析法1 范围本方法规定了水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿残留量的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于鱼肉和虾肉中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。GB/T 30891 水产品抽样规范3 原理样品中孔

3、雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，隐色孔雀石绿经氧化剂将氧化成为孔雀石绿。孔雀石绿能与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测卡检测线（T 线）上抗原的结合，导致 T 线显色变浅。通过对比检测线与质控线（C 线）的颜色深浅，可对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量进行定性判定。当 T 线比 C 线浅或者 T 线显色呈绿色，结果为阳性；而 T 线显色与质控线C 线相当或者比 C 线深，结果为阴性。4 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。4.1 试剂4.1.1 正己烷。4.1.2 乙腈。24.1.3 冰乙酸。4.1.4 盐酸。4.1.5 氯化钠

4、。4.1.6 对-甲苯磺酸。4.1.7 无水乙酸钠。4.1.8 盐酸羟胺。4.1.9 中性氧化铝：层析用，100 目200 目。4.1.10 二氯二氰基苯醌。4.1.11 氯化钾。4.1.12 磷酸二氢钾。4.1.13 十二水合磷酸氢二钠。盐酸羟胺溶液（0.25 g/mL）：称取 2.5 g 盐酸羟胺（4.1.8），用水溶解并稀释至 10 mL，混匀。4.1.14 乙酸盐缓冲液：称取 4.95 g 无水乙酸钠（4.1.7）及 0.95 g 对-甲苯磺酸（4.1.6）溶解于 950 mL 水中，用冰乙酸（4.1.3）调节溶液 pH 为 4.5，用水稀释至 1 L，混匀。4.1.15 二氯二氰基苯

5、醌溶液：称取 0.1 g 二氯二氰基苯醌（4.1.10）置于 100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈（4.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。4避光保存。4.1.16 样品复溶液：称取 8.00 g 氯化钠（4.1.5），0.20 g 氯化钾（4.1.11），0.20 g 磷酸二氢钾（4.1.12）及 2.90 g 十二水合磷酸氢二钠（4.1.13）溶解于 900 mL 水中，混匀，用盐酸（4.1.4）调节 pH 为 7.4，用水稀释至 1 L，混匀。4.2 标准物质孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）标准物质的中文名称、英文名称、 CAS 登录号、分子式、相对分子量见表 1，纯度95%。表 1

6、孔雀石绿（MG） 、隐色孔雀石绿（LMG）标准物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量中文名称 英文名称 CAS 登录号 分子式 相对分子量孔雀石绿（MG） Malachite green 569-64-2 C23H25ClN2 364.923隐色孔雀石绿（LMG）Leucomalachite green 129-73-7 C23H26N2 330.47注：或等同可溯源物质。4.3 标准溶液配制4.3.1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准储备液（1 mg/mL）：精密称取适量孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准品（4.2），分别置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1.2）溶解并稀释至刻

7、度，摇匀，分别制成浓度为 1 mg/mL的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准储备液。-20避光保存，有效期 1 个月。4.3.2 孔雀石绿标准中间液 A（1 g/mL）：精密量取孔雀石绿标准储备液（1 mg/mL ）（4.3.1）0.1 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1 g/mL 的孔雀石绿标准中间液A。临用新制。4.3.3 孔雀石绿标准中间液 B（100 ng/mL ）：精密量取孔雀石绿标准中间液 A（1 g/mL）（4.3.2）1mL，置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 100 ng/mL 的孔雀石绿

8、标准中间液 B。临用新制。4.3.4 隐色孔雀石绿标准中间液 A（1 g/mL）：精密量取隐色孔雀石绿标准储备液（1 mg/mL ）（4.3.1）0.1 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1 g/mL 的隐色孔雀石绿标准中间液 A。临用新制。4.3.5 隐色孔雀石绿标准中间液 B（100 ng/mL ）：精密量取隐色孔雀石绿标准中间液 A（1 g/mL）（4.3.4）1 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 100 ng/mL 的隐色孔雀石绿标准中间液 B。临用现配。4.4 材料免疫胶体金试剂盒，

9、适用基质为水产品。4.4.1 金标微孔。4.4.2 检测卡。5 仪器和设备5.1 移液器：200 L、1 mL 和 5 mL。5.2 涡旋混合器。45.3 离心机：转速4000 r/min 。5.4 电子天平：感量为 0.01 g 和 0.0001 g。5.5 氮吹浓缩仪。6 分析步骤6.1 试样制备按照GB/T 30891水产品抽样规范进行制备，制备好的试样装入干净容器，标明记号。样品置于 -20冰箱保存。6.2 试样的提取与净化准确称取试样2 g（精确至0.01 g）置于50 mL带盖离心管中，用红色油性笔标记，依次加入0.5 mL盐酸羟胺溶液（4.1.14），2 mL乙酸盐缓冲液（4.1

10、.15）及5 mL乙腈（4.1.2），涡旋提取2 min。加入5 g 氯化钠（4.1.5 ），2 g中性氧化铝（ 4.1.9），涡旋混合1 min，以4000 r/min离心5 min。准确移取2 mL上清液于10 mL离心管中，加入100 L二氯二氰基苯醌溶液（4.1.16），涡旋混匀，于65水浴中氮气或空气吹干。加入1 mL正己烷后，涡旋混匀，用移液器准确加入0.3 mL样品复溶液（4.1.17），轻轻混匀，切勿振荡。取下层液体1 00 L检测，立即测定。6.3 测定步骤吸取全部样品待测液于金标微孔（4.4.1.1）中，抽吸5-10次使混合均匀，室温温育5 min，将金标微孔中全部溶液滴加

11、到检测卡（4.4.1.2）上的加样孔中，反应5-10 min，进行结果判定。6.4 质控试验6.4.1 质控样制备与检测每一批次试验时，选取已知未含孔雀石绿及隐色孔雀石绿的均质水产品组织样品作为质控样，称取两份平行样，其中一份作为阴性质控样，另一份添加标准溶液，使其样品含量为 1g/kg，作为阳性质控样。按照上述同样步骤进行实验。6.4.2 质控结果要求阴性质控样结果应为阴性，阳性质控样结果应为阳性，否则试验无效。57 结果判定和表述要求通过对比质控线（C线）和检测线（ T线）的颜色深浅进行结果判定。判定示意图见图1。7.1阴性：检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或者检测线（T 线）颜色

12、与质控线（C线）颜色相当，表明样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量低于方法检测限，判定为阴性。7.2阳性：检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比质控线（C 线）颜色浅，表明样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量高于方法检测限，判定为阳性。7.3无效：质控线（C线）不显色，表明不正确操作或检测卡无效， 结果无效，需重新试验。图1 判定示意图8 结论孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量以孔雀石绿计，本方法使用试剂盒可能与结晶紫和隐色结晶紫存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。9 性能指标9.1 孔雀石绿及隐色孔雀石绿检出限：1.0 g/kg 。9.2 灵敏度：灵敏度应95%。9.3 特异性：特异性应9

13、5%。9.4 假阴性率：假阴性率应5%。9.5 假阳性率：假阳性率应5%。注：性能指标计算方法见附录 A。10 其他6本方法参比标准为GB/T 198572005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定和GB/T 203612006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。1附 录 A定性方法性能指标计算表表 A.1 性能指标计算方法检测结果 b样品情况 a阳性 阴性 总数阳性 N11 N12 N1.=

14、N11+N12阴性 N21 N22 N2.=N21+N22总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异(2) 2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1灵敏度(p+) p+=N11/N1.特异性(p-) p-=N22/N2.假阴性率(pf-) pf-=N12/N1.=1-灵敏度假阳性率(pf+) pf+=N21/N2.=1-特异性相对准确度 (N11+N22)/(N1.+N2.)注：N 指任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N2.表示所有的第二行；N12 表示第一行，第二列。a 由基准方法检验得到的结果；b 由本方法得到的检测结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。联系人信息： 18202989150 （李） 西安市未央区三桥南沣惠路2号（陕西省水产研究所）