1、食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光 PCR 法 第二部分 木薯淀粉 编制说明1 基本信息中文 食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光 PCR 法 第二部分 木薯淀粉1.1 标准草案名称英文 Identification of botanical origin in edible starches Real-time PCR method Part 2: cassava starch标准号 /英文名称 /1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况等同修改非等效中文名称 /1.3 任务来源批准立项的文件名称和文件号国家认监委关于下达 2017 年度检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知(国认科
2、201785号)计划编号 2017B1161.4 制（修）订情况 制订 修订 替代的标准编号 /1.5 起止时间 2017.08-2018.121.6 起草单位 中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院1.7 起草人1.8 专业类别1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、动物检疫；4、植物检疫；5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10、鉴定；11 包装及危险化学品1.9 标准体系表代码 /1.10 调整情况 /2 背景情况2.1 目的、意义木薯是一种适应各种贫瘠土地、易种植、投资少的热带作物，其淀粉含量高，素有“淀粉之王”的美称。
3、木薯淀粉是生产木薯的第二大用途。我国主要食用的薯类淀粉包括红薯淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉等，其中，红薯淀粉的价格最高，木薯淀粉的价格最低。由于不同种类淀粉颗粒的感官性状、物化指标等相近，消费者很难辨识，因此，不法商贩常用低价的木薯淀粉冒充红薯淀粉出售，牟取非法利润，给消费者的利益造成损害。近年来，国内外学者采用红外光谱、扫描电镜、肽指纹图谱等技术手段开展了淀粉种类鉴别方面的研究。如，采用红外光谱技术可将藕粉中掺杂的马铃薯、红薯、木薯以及玉米淀粉等有效鉴别；运用扫描电镜与稳定碳同位素比法分析马铃薯淀粉与木薯淀粉在颗粒超微形貌上的差异性，可准确鉴别马铃薯淀粉中掺假的木薯淀粉。通过分析不同淀粉间肽指
4、纹图谱区的差异，可区分红薯淀粉、木薯淀粉及马铃薯淀粉。但是，上述方法容易受到品种、产地、收获季节等因素的影响，另外，也容易受取样均匀性和代表性等问题的限制，而且依赖的仪器设备价格比较昂贵，很难在普通实验室推广。实时荧光 PCR 技术通过分析物种 DNA 水平上的差异来鉴定物种真实属性，结果准确、可靠，且不受环境因素等影响，仪器普及率高，目前在食品真实属性鉴别方面有着越来越广泛的应用。目前，国内外尚未见报道能够快速、简便、特异且灵敏地检测淀粉、粉丝、粉条、薯片、糕点等样品中木薯源性成分的方法。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的木薯源性成分的检测方法，进行淀粉、粉丝、粉条、薯片、糕点等
5、样品中木薯源性成分的检测。本标准是采用实时荧光 PCR 检测方法对木薯成分进行鉴定。该标准的制定及推广应用对保障食用淀粉的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供技术支持。所建立的方法还可以应用于农业系统、质量技术监督局、食品加工生产企业等单位，具有巨大的经济和社会效益，必将为我国检验技术的提高和社会进步做出积极的贡献。2.2 与国内外相关标准、文献的关系 无国内外检测标准。标准采用技术为本研究组科研成果。3 编制过程3.1 准备阶段（可选项） /3.2 分工情况 中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院 负 责 研 究 工 作 和 标 准 制 定 。3.3 标准草案编写情况
6、 2017.8-9 完成标准草案的编写。3.4 征求意见情况（适用于送审稿） 2017.12，完成意见征求。3.5 审定情况（适用于报批稿）3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）4 主要技术内容的确定一、国内外相关的标准要求无。二、测定步骤1 材料1.1 供试材料（1）原料：木薯、红薯、芋头、山药、马铃薯、莲藕、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大米、荞麦、高粱、薏米、小米、绿豆、赤小豆、豇豆、豌豆、扁豆、菜豆、蚕豆、黄豆、枣、杏、百合、橄榄等 28 种种子样品。（2）绝对灵敏度分析样品：将木薯 DNA 从 10 ng/L 进行 10 倍梯度稀释，稀释后的浓度分别
7、为 1 ng/L、0.1 ng/L、0.01 ng/L 、0.001 ng/L 以及 0.0001 ng/L（3）相对灵敏度分析样品：将自制的木薯淀粉与玉米淀粉两两混合，使木薯淀粉的质量比分别为50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%。（4）市场样品：8 种木薯淀粉、14 种红薯淀粉、10 种马铃薯淀粉、7 种小麦淀粉、14 种藕粉、12种玉米淀粉、葛根粉 6 份、山药粉 6 份、1 种绿豆淀粉、1 种豌豆淀粉等 79 种食用淀粉样品。1.2 主要试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器
8、分装。1.2.1 内参照检测用引物（对）序列正向引物：5- TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA -3反向引物：5- AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT -3探针：5-FAM- CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC -TAMRA -31.2.2 木薯成分检测用引物（对）序列正向引物：5- TGGTTCTTGATCTGCGTGAG -3反向引物：5- TGGGAGAACCTTTCCAACAG -3探针：5-FAM- TGCTGTTGCAACTGCTTAGG -TAMRA-31.2.3 CTAB 裂解液（20 g/L CTAB，1.4 m
9、ol/L NaCl，0.1 mol/L Tris、0.02 mmol/L Na2-EDTA） 。1.2.4 CTAB 沉淀液（5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl） 、NaCl 溶液（1.2 mol/L） 。1.2.5 核酸裂解液：2%CTAB，100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA (pH8.0)。1.2.6 实时荧光 PCR 反应混合液： 12.5 L 反应体系包括： 1 U2 U（Unit，酶学单位) 的 Taq 酶、1PCR buffer、2.5 mmolL4.0 mmolL 的 Mg2+、0.2 U
10、1 U 的 UNG 酶、0.2 mmolL 的 d (A，C，G) TPs、0.2 mmolL 0.4 mmolL dUTP、400 nmolL ROX 染料 (某些荧光 PCR 仪不需要 ROX 校正) 。1.3 仪器和设备1.3.1 实时荧光 PCR 仪。1.3.2 离心机：最大离心力12000g。1.3.3 微量移液器：10L、100L、200L、1000L。1.3.4 冰箱：2-8，-20。1.3.5 高压灭菌器。1.3.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。1.3.7 pH 计。1.3.8 天平：感量 0.01g。2 DNA 提取2.1 CTAB提取方法将种子等原料样品研磨至粉末（淀粉
11、样品直接称取），称取 100-200 mg 于 2 mL 离心管中，加入 1.5 mL CTAB 裂解液和 10 L 蛋白酶 K 溶液。65 振荡 2 h，13000 g 离心 10 min，转移上清液至一洁净 2 mL 离心管中。加入 750 L 氯仿后用力振荡，13000 g 离心 5 min，将上清转移到新的离心管中。加入 2倍体积的 CTAB 沉淀溶液，室温静置 1 h，13000 g 离心 15 min，弃去上清。加入 350 L 1.2 mol/LNaCl溶液将沉淀溶解，加入 350 L 氯仿，涡旋振荡混匀，13000 g 离心 10 min。转移上清后加入 0.8 倍体积的异丙醇
12、，混匀-20 放置 1 h，13000 g 离心 10 min，弃去上清。加入 500 L 70乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 100 L 无菌水中，-20 保存。2.2 其他方法也可用等效的商业化 DNA 提取试剂盒提取模板 DNA。2. 3 DNA 浓度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和 280 nm处的吸光值A 260和A 280。DNA的浓度按照公式（1）计算：c=A N 50/1 000 公式（1）c= DNA浓度，单位为微克每微升（g/L）；A= 260 nm处的吸光值；N=核酸稀释倍数。当A 260/ A 280比值在 1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。
13、2.4 实时荧光 PCR 扩增反应体系的体积为 25 L：实时荧光 PCR 混合液 12.5 L、正反向引物（10 mol/L）各 1.0 L、探针（10 mol/L）1.0 L、模板 DNA 5 L，无菌水补足至 25 L。实时荧光 PCR 反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50 2 min；95 10 min；95 15 s，60 1 min，40 个循环。每个样品设置 3 个重复。检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含木薯成分的样品作阳性对照，用已知不含木薯成分的样品作阴性对照，用等体积的 ddH2O 代替模板 DNA 作空白对照。3 结果判定3.1 PCR 有效性
14、判定空白对照：无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值=40.0 。阴性对照：无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值=40.0 。阳性对照：有 FAM 荧光信号，且 FAM 通道出现明显的扩增曲线，Ct 值35.0。否则判定为 PCR 无效。3.2 DNA 提取有效性判定在同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常的情况下，使用内参照引物和探针对被检样品进行检测，有 FAM 荧光信号检出，且 FAM 通道出现明显的扩增曲线，Ct 值40.0。否则 DNA 提取无效，应重新提取 DNA，直至 Ct 值 40.0。3.3 检测结果判定在符合 3.1 和 3.2 的情况下，使用木薯特异性引物和探针对被检样
15、品进行检测：如有 FAM 荧光检出，且 Ct 值35.0，则判定样品含有木薯源性成分，表述为“检出木薯成分” ；如 Ct 值 =40.0，则判定为不含木薯源性成分，表述为“未检出木薯成分 ”；如 35.0Ct40.0，则需重复实验，若再次扩增后的 Ct 值仍40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则判定该样品含有木薯源性成分；若再次扩增后 Ct 值=40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则判定该样品不含木薯源性成分。4 检测结果4.1 样品 DNA 提取质量分析结果利用内参照引物探针对木薯、红薯、芋头、山药、马铃薯、莲藕、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大米、荞麦、高粱、薏
16、米、小米、绿豆、赤小豆、豇豆、豌豆、扁豆、菜豆、蚕豆、黄豆、枣、杏、百合、橄榄等样品进行实时荧光 PCR 扩增，验证样品 DNA 的有效性。结果表明，所有样品均可见典型 S型荧光扩增曲线，说明上述样品都提取到有效的 DNA，可用于后续的特异性检测。图 1 内参照引物探针实时荧光 PCR 扩增结果4.2 木薯成分实时荧光 PCR 方法特异性检测结果利用红薯引物探针扩增所有样品，验证所设计引物探针的特异性。扩增结果表明，仅有红薯样品产生显著的荧光扩增曲线，Ct 值为 26.120.01；而其它样品以及空白对照 (无菌水)均无荧光扩增信号（图2） ，说明所设计的引物探针具有较好的特异性，可特异性的扩
17、增木薯成分。图 2 木薯引物探针实时荧光 PCR 特异性扩增结果4.3 方法绝对灵敏度检测结果对浓度分别为 10 ng/L、 1 ng/L、0.1 ng/L、0.01 ng/L、0.001 ng/L 以及 0.0001 ng/L 的木薯DNA 进行实时荧光 PCR 扩增。如图 3 所示，当木薯 DNA 浓度在 0.001 ng/L 及以上时，基线以上出现荧光扩增曲线，当其 DNA 浓度低于 0.001 ng/L 时，扩增曲线在基线位置，说明木薯引物探针检测绝对灵敏度为 0.001 ng/L。图 3 木薯引物探针实时荧光 PCR 绝对灵敏度检测结果基线以上荧光曲线从左至右依次为 10 ng/L、
18、1 ng/L、0.1 ng/L、0.01 ng/L、0.001 ng/L，基线位置为 0.001 ng/L 以及空白对照（无菌水） 。4.4 方法相对灵敏度检测结果分别对含 50%、10%、5%、1% 、0.1%、0.01%(W/W) 木薯淀粉的红薯淀粉样品进行实时荧光 PCR扩增。结果表明：当木薯淀粉含量在 0.1%(W/W)及以上时，荧光扩增曲线在基线以上，而低于0.1%(W/W)时，荧光扩增曲线在基线位置，由此说明木薯引物探针的检测相对灵敏度为 0.1%(W/W)，即：能够检出掺假的木薯淀粉含量为 0.1 g/100 g。图 4 木薯引物探针实时荧光 PCR 相对灵敏度检测结果基线以上荧
19、光曲线从左至右依次为 100%、50% 、10%、5%、1% 、0.1% (W/W)，基线位置荧光曲线分别为 0.01% (W/W)与空白对照（无菌水） 。4.5 市售淀粉样品检测为进一步验证方法的实用性，对来自北京超市的 8 种木薯淀粉、14 种红薯淀粉、10 种马铃薯淀粉、7 种小麦淀粉、14 种藕粉、12 种玉米淀粉、葛根粉 6 份、山药粉 6 份、1 种绿豆淀粉、1 种豌豆淀粉等79 种食用淀粉样品进行了木薯成分的检测。检测发现，8 份木薯淀粉均检出木薯成分，而 5 份红薯淀粉、2 份马铃薯淀粉、6 份藕粉以及 1 份葛根粉中也检出木薯成分，说明本方法适用于市售淀粉中木薯源性成分的检测
20、。表 1 市售淀粉样品中木薯成分检测结果序号 样品 18S rRNA 木薯1 木薯淀粉-1# + +2 嫩肉粉（木薯）-2# + +3 木薯粉-3# + +4 木薯粉-4# + +5 木薯淀粉-5# + +6 木薯淀粉-6# + +7 木薯淀粉-7# + +8 木薯淀粉-8# + +9 红薯淀粉-1# + +10 红薯淀粉-2# + +11 红薯淀粉-3# + +12 红薯淀粉-4# + +13 红薯淀粉-5# + +14 红薯淀粉-6# + 15 红薯淀粉-7# + 16 红薯淀粉-8# + 17 红薯淀粉-9# + 18 红苕淀粉-10# + 19 甘薯淀粉-11# + 20 红薯粉-12
21、# + 21 红薯淀粉-13# + 22 地瓜粉-14# + 23 马铃薯淀粉-1# + +24 马铃薯淀粉-2# + +25 马铃薯淀粉-3# + 26 马铃薯淀粉-4# + 27 马铃薯淀粉-5# + 28 马铃薯淀粉-6# + 29 马铃薯淀粉-7# + 30 马铃薯淀粉-8# + 31 马铃薯淀粉-9# + 32 土豆淀粉-10# + 33 小麦淀粉-1# + 34 小麦淀粉-2# + 35 小麦淀粉-3# + 36 小麦淀粉-4# + 37 小麦淀粉-5# + 38 小麦淀粉-6# + 39 小麦淀粉-7# + 40 绿豆淀粉-1# + 41 豌豆淀粉-1# + 42 藕粉-1# +
22、 43 莲藕粉-2# + +44 100%纯藕粉-3# + 45 原味藕粉羹-4# + 46 纯藕粉-5# + 47 纯藕粉-6# + +48 藕粉-7# + +49 藕粉-8# + +50 藕粉-9# + 51 无糖纯藕粉-10# + +52 藕粉-11# + +53 新莲藕粉-12# + 54 纯藕粉-13# + 55 纯藕粉-14# + 56 玉米淀粉-1# + 57 玉米淀粉-2# + 58 玉米淀粉-3# + 59 玉米淀粉-4# + 60 玉米淀粉-5# + 61 玉米淀粉-6# + 62 玉米淀粉-7# + 63 玉米淀粉-8# + 64 玉米淀粉-9# + 65 玉米淀粉-10
23、# + 66 玉米淀粉-11# + 67 食用玉米淀粉-12# + 68 野生葛根粉-1# + 69 野生葛根粉-2# + 70 葛根粉-3# + 71 野生葛根粉-4# + 72 葛根粉-5# + +73 葛根精粉-6# + 74 纯山药粉-1# + 75 山药粉-2# + 76 山药粉-3# + 77 熟山药粉-4# + 78 山药粉-5# + 79 山药粉-6# + 注：“+” 代表“ 检出”；“”代表“未检出” 。5 验证情况（适用于方法类标准）验证单位 验证人员 验证时间天津局 张宏伟 2018 年 10 月 30 日内蒙古局 王海艳 2018 年 10 月 30 日北京局 马丹 2
24、018 年 10 月 30 日河南局 苗丽 2018 年 10 月 30 日山东局 孙敏 2018 年 10 月 30 日5.1 验证单位情况中国肉类食品综合研究中心 李家鹏 2018 年 10 月 30 日5.2 验证过程采用中国检科院提供的引物探针、实验材料及实验方法，6 家单位分 3 部分开展验证工作：1、特异性验证红薯、木薯、马铃薯、山药、葛根、莲藕、玉米、小麦、大米、豌豆、绿豆、芋头 12 种淀粉类植物，提取 DNA，进行物种特异性检测。2、最低检测限分析将木薯淀粉样品加入到玉米淀粉中制成含有 1%、0.1% 和 0.01%木薯成分的模拟掺假淀粉样品，提取 DNA，进行灵敏度检测。3
25、、市售样品检测对 22 份市售淀粉样品开展木薯成分的检测，验证方法可行性。5.3 验证数据分析1、特异性验证结果经验证，12 种淀粉类植物样品中仅木薯出现特异性扩增曲线，Ct 值35.0，其他样品均未出现扩增曲线，Ct 值=40.0 ，说明该标准方法可特异检测木薯成分。表 1 木薯成分特异性验证结果注：“+” 代表 “检出”；“” 代表“未检出 ”。2、最低检测限分析结果对木薯淀粉含量为 1%、0.1%和 0.01%（w/w）的模拟掺假淀粉样品开展检测，结果表明，木薯淀粉含量为 0.1%和 1%的样品出现荧光扩增， Ct 值35.0，而含量为0.01%木薯淀粉未出现荧光扩增，Ct 值=40.0
26、，表明本方法的最低检测限为0.1%（ w/w） 。表 2 方法最低检测限验证结果注：“+” 代表 “检出”；“” 代表“未检出 ”。3、市售样品检测结果采用本方法对市售 22 份淀粉样品进行木薯成分检测，发现 3 份木薯淀粉均检出木薯成分，其它样品未检出木薯成分，说明本方法适用于市售淀粉中木薯成分的检测。表 3 市售样品检测结果注：“+” 代表 “检出”；“” 代表“未检出 ”。5.4 验证评价经验证，中国检验检疫科学研究院建立的木薯淀粉实时荧光 PCR 检测方法，特异性强，灵敏度高，能准确检测出淀粉中的木薯源性成分，为市场中淀粉成分检测方法标准化提供了技术依据。5.5 其他应说明的情况 无6 附加说明（可选项）6.1 宣贯标准的建议6.2 修订和废除现行有关标准的建议6.3 作为强制性标准或推荐性的建议6.4 其他需要说明的情况6.5 参考文献联系人 韩建勋 联系电话 13810248147 电子邮箱 注 1：本模版表的共性部分为第 1 章、第 2 章、第 4 章和第 6 章。注 2：3.4 适用于标准草案送审稿，3.5 适用于标准草案报批稿，3.6 中预期的管理目标适用于规程类标准，3.6 中技术指标适用于方法类标准，第 5 章适用于方法类标准编制说明的编写。注 3：3.1 和第 6 章为可选项，其余为必填项。编写日期：2018 年 10 月 21 日
