1、食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光 PCR 法 第五部分 葛根淀粉 编制说明1 基本信息中文 食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光 PCR 法 第五部分 葛根淀粉1.1 标准草案名称英文 Identification of botanical origin in edible starches Real-time PCR method Part 5: radix puerariae starch标准号 /英文名称 /1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况等同修改非等效中文名称 /1.3 任务来源批准立项的文件名称和文件号国家认监委关于下达 2017 年度检验检疫行业标准制（修）订计划项
2、目的通知(国认科201785号)计划编号 2017B1161.4 制（修）订情况 制订 修订 替代的标准编号 /1.5 起止时间 2017.08-2018.121.6 起草单位 中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院1.7 起草人1.8 专业类别1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、动物检疫；4、植物检疫；5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10、鉴定；11 包装及危险化学品1.9 标准体系表代码 /1.10 调整情况 /2 背景情况2.1 目的、意义葛根为豆科蝶形花科植物野葛或甘葛藤的干燥根，葛根的化学成分复杂，含有丰富的淀
3、粉、异黄酮类、葛根甙类、生物碱及人体必需的微量元素，具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、调节血脂代谢、改善胰岛功能等功效，已被广泛用于食品、药品、保健品等行业；葛根有悠长的栽培历史，分布范围广，我国各大省区及日本、泰国均有种植，目前，湖北省是野葛根的最大产区，占全国总产量的 30%左右，陕西省为野葛根第二大产区，占全国产量的 20%左右，年产量达 2000 吨。目前，葛根的加工主要以淀粉及淀粉产品为主，葛根淀粉也是葛根的主要食用成分，具有葛根的相关保健作用。近年来，人们对葛根粉的研究逐渐深入，其保健作用也日益受到重视，但是，葛根粉的生产成本要高于其他淀粉的 26 倍，因此部分厂家为牟取暴利，在葛根粉中
4、常常掺入玉米淀粉、马铃薯淀粉、藕粉、木薯淀粉等形态相似、价格低廉的淀粉，因此采用有效的方法对葛根粉的真伪优劣进行鉴别具有重要意义。目前葛根粉的真伪鉴别方法主要有显微镜法、扫描电镜法、红外光谱法、色谱法等。如采用光学显微镜法对掺入玉米淀粉和马铃薯淀粉的葛根粉进行了有效鉴别；以葛粉及葛粉中分别掺假红薯淀粉和马铃薯淀粉为对象，采用红外傅里叶变换光谱，结合主成分分析对样品的进行聚类划分。结果表明，葛粉中掺假红薯淀粉和葛粉中掺假马铃薯淀粉的自身验证准确率分别为 93.3%和 100%；交互验证准确率分别为 86.7%和 92.0%。此方法可作为葛粉中掺假红薯淀粉和马铃薯淀粉的一种快速鉴别方法。 基于 D
5、NA 的现代分子生物学技术克服了传统检测方法受环境、气候、加工方式等因素影响的局限性，已广泛应用食品真伪鉴别领域。特别是实时荧光 PCR 技术，目前已在肉制品、果汁、蜂产品、水产品等食品种类鉴定研究中得到大量推广，但在食用淀粉种类掺假鉴别应用较少，在葛根淀粉鉴伪中尚未见过报道。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的葛根源性成分的检测方法，进行淀粉、糕点等样品中葛根源性成分的检测。本标准是采用实时荧光 PCR 检测方法对葛根成分进行鉴定。该标准的制定及推广应用对保障食用淀粉的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供技术支持。所建立的方法还可以应用于农业系统、质量技术监督局
6、、食品加工生产企业等单位，具有巨大的经济和社会效益，必将为我国检验技术的提高和社会进步做出积极的贡献。2.2 与国内外相关标准、文献的关系 无国内外检测标准。标准采用技术为本研究组科研成果。3 编制过程3.1 准备阶段（可选项） /3.2 分工情况 中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院 负 责 研 究 工 作 和 标 准 制 定 。3.3 标准草案编写情况 2017.8-9 完成标准草案的编写。3.4 征求意见情况（适用于送审稿） 2017.12 完成意见征求。3.5 审定情况（适用于报批稿）3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）4 主要技术内容的确定一
7、、国内外相关的标准要求无。二、测定步骤1 材料1.1 供试材料（1）原料：葛根、木薯、红薯、芋头、山药、马铃薯、莲藕、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大米、荞麦、高粱、薏米、小米、绿豆、赤小豆、豇豆、豌豆、扁豆、菜豆、蚕豆、黄豆、枣、杏、百合、橄榄等 28 种种子样品。（2）绝对灵敏度分析样品：将葛根 DNA 从 10 ng/L 进行 10 倍梯度稀释，稀释后的浓度分别为 1 ng/L、0.1 ng/L、0.01 ng/L 、0.001 ng/L 以及 0.0001 ng/L（3）相对灵敏度分析样品：将自制的玉米淀粉与葛根淀粉两两混合，使葛根淀粉含量分别为50%、10%、5%、1%、0.1%、0
8、.01%。（4）市场样品：8 种木薯淀粉、14 种红薯淀粉、10 种马铃薯淀粉、7 种小麦淀粉、14 种藕粉、12种玉米淀粉、葛根粉 6 份、山药粉 6 份、1 种绿豆淀粉、1 种豌豆淀粉等 79 种食用淀粉样品。1.2 主要试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。1.2.1 内参照检测用引物（对）序列正向引物：5- TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA -3反向引物：5- AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT -3探针：5-FAM- CCGTTTCTCAGGC
9、TCCCTCTCCGGAATCGAACC -TAMRA -31.2.2 葛根成分检测用引物（对）序列正向引物：5- TTGGGACTTACGGTGATGCT -3反向引物：5- GTAGAAAACAGTGGCACCGG -3探针：5-FAM- GAAGCCGCAGCCATTGAAAA -TAMRA-31.2.3 CTAB 裂解液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris、0.02 mmol/L Na2-EDTA） 。1.2.4 CTAB 沉淀液（5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl） 、NaCl 溶液（1.2 mol/L） 。1.2.5
10、 核酸裂解液：2%CTAB，100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA (pH8.0)。1.2.6 实时荧光 PCR 反应混合液： 12.5 L 反应体系包括： 1 U2 U（Unit，酶学单位) 的 Taq 酶、1PCR buffer、2.5 mmolL4.0 mmolL 的 Mg2+、0.2 U1 U 的 UNG 酶、0.2 mmolL 的 d (A，C，G) TPs、0.2 mmolL 0.4 mmolL dUTP、400 nmolL ROX 染料 (某些荧光 PCR 仪不需要 ROX 校正) 。1.3 仪器和设备1.3.
11、1 实时荧光 PCR 仪。1.3.2 离心机：最大离心力16000g。1.3.3 微量移液器：10L、100L、200L、1000L。1.3.4 冰箱：2-8，-20。1.3.5 高压灭菌器。1.3.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。1.3.7 pH 计。1.3.8 天平：感量 0.01g。2 DNA 提取2.1 CTAB提取方法将种子等原料样品研磨至粉末（淀粉样品直接称取），称取100-200 mg于2 mL离心管中，加入1.5 mL CTAB裂解液和 10 L蛋白酶K溶液。65 振荡2 h，13000 g离心10 min，转移上清液至一洁净2 mL离心管中。加入750 L氯仿后用力振荡，
12、 13000 g离心5 min，将上清转移到新的离心管中。加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置1 h，13000 g离心15 min，弃去上清。加入350 L 1.2 mol/LNaCl溶液将沉淀溶解，加入350 L氯仿，涡旋振荡混匀， 13000 g离心10 min。转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇，混匀-20 放置1 h，13000 g离心 10 min，弃去上清。加入500 L 70乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 L 无菌水中，-20 保存。2.2 其他方法也可用等效的商业化 DNA 提取试剂盒提取模板 DNA。2. 3 DNA 浓度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测
13、260 nm和 280 nm处的吸光值A 260和A 280。DNA的浓度按照公式（1）计算：c=A N 50/1 000 公式（1）c= DNA浓度，单位为微克每微升（g/L）；A= 260 nm处的吸光值；N=核酸稀释倍数。当A 260/ A 280比值在 1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。2.4 实时荧光 PCR 扩增反应体系的体积为 25 L：实时荧光 PCR 混合液 12.5 L、正反向引物（10 mol/L）各 1.0 L、探针（10 mol/L）1.0 L、模板 DNA 5 L，无菌水补足至 25 L。实时荧光 PCR 反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50 2 min；9
14、5 10 min；95 15 s，60 1 min，40 个循环。每个样品设置 3 个重复。检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含葛根成分的样品作阳性对照，用已知不含葛根成分的样品作阴性对照，用等体积的 ddH2O 代替模板 DNA 作空白对照。3 结果判定3.1 PCR 有效性判定空白对照：无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值=40.0 。阴性对照：无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值=40.0 。阳性对照：有 FAM 荧光信号，且 FAM 通道出现明显的扩增曲线，Ct 值35.0。否则判定为 PCR 无效。3.2 DNA 提取有效性判定在同时进行的阴性、阳性、空白对照实
15、验结果正常的情况下，使用内参照引物和探针对被检样品进行检测，有 FAM 荧光信号检出，且 FAM 通道出现明显的扩增曲线，Ct 值40.0。否则 DNA 提取无效，应重新提取 DNA，直至 Ct 值 40.0。3.3 检测结果判定在符合 3.1 和 3.2 的情况下，使用葛根特异性引物和探针对被检样品进行检测：如有 FAM 荧光检出，且 Ct 值35.0，则判定样品含有葛根源性成分，表述为“检出葛根成分” ；如 Ct 值 =40.0，则判定为不含葛根源性成分，表述为“未检出葛根成分 ”；如 35.0Ct40.0，则需重复实验，若再次扩增后的 Ct 值仍40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结
16、果正常，则判定该样品含有葛根源性成分；若再次扩增后 Ct 值=40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则判定该样品不含葛根源性成分。4 检测结果4.1 样品 DNA 提取质量分析结果利用内参照引物探针对木薯、红薯、芋头、山药、马铃薯、莲藕、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大米、荞麦、高粱、薏米、小米、绿豆、赤小豆、豇豆、豌豆、扁豆、菜豆、蚕豆、黄豆、枣、杏、百合、橄榄等样品进行实时荧光 PCR 扩增，验证样品 DNA 的有效性。结果表明，所有样品均可见典型 S型荧光扩增曲线，说明上述样品都提取到有效的 DNA，可用于后续的特异性检测。图 1 内参照引物探针实时荧光 PCR 扩增结果4.
17、2 葛根成分实时荧光 PCR 方法特异性检测结果利用葛根引物探针扩增所有样品，验证所设计引物探针的特异性。扩增结果表明，仅有葛根样品产生显著的荧光扩增曲线，Ct 值为 26.470.01；而其它样品以及空白对照 (无菌水)均无荧光扩增信号（图2） ，说明所设计的引物探针具有较好的特异性，可特异性的扩增葛根成分。图 2 葛根引物探针实时荧光 PCR 特异性扩增结果4.3 方法绝对灵敏度检测结果对浓度分别为 10 ng/L、 1 ng/L、0.1 ng/L、0.01 ng/L、0.001 ng/L 以及 0.0001 ng/L 的葛根DNA 进行实时荧光 PCR 扩增。如图 3 所示，当葛根 DN
18、A 浓度在 0.001 ng/L 及以上时，基线以上出现荧光扩增曲线，当其 DNA 浓度低于 0.001 ng/L 时，扩增曲线在基线位置，说明葛根引物探针检测绝对灵敏度为 0.001 ng/L。图 3 葛根引物探针实时荧光 PCR 绝对灵敏度检测结果基线以上荧光曲线从左至右依次为 10 ng/L、1 ng/L、0.1 ng/L、0.01 ng/L、0.001 ng/L，基线位置为 0.0001 ng/L 以及空白对照（无菌水） 。4.4 方法相对灵敏度检测结果分别对含 50%、10%、5%、1% 、0.1%、0.01%(W/W) 葛根淀粉的木薯淀粉样品进行实时荧光 PCR扩增。结果表明：当葛
19、根淀粉含量在 0.1%(W/W)及以上时，荧光扩增曲线在基线以上，而低于0.1%(W/W)时，荧光扩增曲线在基线位置，由此说明葛根引物探针的检测相对灵敏度为 0.1%(W/W)，即：能够检出掺假的葛根淀粉含量为 0.1 g/100 g。图 4 葛根引物探针实时荧光 PCR 相对灵敏度检测结果基线以上荧光曲线从左至右依次为 100%、50% 、10%、5%、1% 、0.1% (W/W)，基线位置荧光曲线分别为 0.01% (W/W)与空白对照（无菌水） 。4.5 市售淀粉样品检测为进一步验证方法的实用性，对来自北京超市的 8 种木薯淀粉、14 种红薯淀粉、10 种马铃薯淀粉、7 种小麦淀粉、14
20、 种藕粉、12 种玉米淀粉、葛根淀粉 6 份、山药粉 6 份、1 种绿豆淀粉、1 种豌豆淀粉等 79 种食用淀粉样品进行了葛根成分的检测。检测发现，6 份葛根淀粉中 5 份检出了葛根成分，1 份未检出，其它种类淀粉均未检出葛根成分，说明本方法适用于市售淀粉中葛根源性成分的检测。表 1 市售淀粉样品中葛根成分检测结果序号 样品 18S rRNA 葛根1 木薯淀粉-1# + 2 嫩肉粉（木薯）-2# + 3 木薯粉-3# + 4 木薯粉-4# + 5 木薯淀粉-5# + 6 木薯淀粉-6# + 7 木薯淀粉-7# + 8 木薯淀粉-8# + 9 红薯淀粉-1# + 10 红薯淀粉-2# + 11
21、红薯淀粉-3# + 12 红薯淀粉-4# + 13 红薯淀粉-5# + 14 红薯淀粉-6# + 15 红薯淀粉-7# + 16 红薯淀粉-8# + 17 红薯淀粉-9# + 18 红苕淀粉-10# + 19 甘薯淀粉-11# + 20 红薯粉-12# + 21 红薯淀粉-13# + 22 地瓜粉-14# + 23 马铃薯淀粉-1# + 24 马铃薯淀粉-2# + 25 马铃薯淀粉-3# + 26 马铃薯淀粉-4# + 27 马铃薯淀粉-5# + 28 马铃薯淀粉-6# + 29 马铃薯淀粉-7# + 30 马铃薯淀粉-8# + 31 马铃薯淀粉-9# + 32 土豆淀粉-10# + 33 小
22、麦淀粉-1# + 34 小麦淀粉-2# + 35 小麦淀粉-3# + 36 小麦淀粉-4# + 37 小麦淀粉-5# + 38 小麦淀粉-6# + 39 小麦淀粉-7# + 40 绿豆淀粉-1# + 41 豌豆淀粉-1# + 42 藕粉-1# + 43 莲藕粉-2# + 44 100%纯藕粉-3# + 45 原味藕粉羹-4# + 46 纯藕粉-5# + 47 纯藕粉-6# + 48 藕粉-7# + 49 藕粉-8# + 50 藕粉-9# + 51 无糖纯藕粉-10# + 52 藕粉-11# + 53 新莲藕粉-12# + 54 纯藕粉-13# + 55 纯藕粉-14# + 56 玉米淀粉-1#
23、 + 57 玉米淀粉-2# + 58 玉米淀粉-3# + 59 玉米淀粉-4# + 60 玉米淀粉-5# + 61 玉米淀粉-6# + 62 玉米淀粉-7# + 63 玉米淀粉-8# + 64 玉米淀粉-9# + 65 玉米淀粉-10# + 66 玉米淀粉-11# + 67 食用玉米淀粉-12# + 68 野生葛根粉-1# + +69 野生葛根粉-2# + +70 葛根粉-3# + +71 野生葛根粉-4# + +72 葛根粉-5# + 73 葛根精粉-6# + +74 纯山药粉-1# + 75 山药粉-2# + 76 山药粉-3# + 77 熟山药粉-4# + 78 山药粉-5# + 79
24、山药粉-6# + 注：“+” 代表“ 检出”；“”代表“未检出” 。5 验证情况（适用于方法类标准）验证单位 验证人员 验证时间天津局 张宏伟 2018 年 10 月 30 日内蒙古局 王海艳 2018 年 10 月 30 日北京局 马丹 2018 年 10 月 30 日河南局 苗丽 2018 年 10 月 30 日山东局 孙敏 2018 年 10 月 30 日5.1 验证单位情况中国肉类食品综合研究中心 李家鹏 2018 年 10 月 30 日5.2 验证过程采用中国检科院提供的引物探针、实验材料及实验方法，6 家单位分 3 部分开展验证工作：1、特异性验证红薯、木薯、马铃薯、山药、葛根、莲
25、藕、玉米、小麦、大米、豌豆、绿豆、芋头 12 种淀粉类植物，提取 DNA，进行物种特异性检测。2、最低检测限分析将葛根淀粉样品加入到玉米淀粉中制成含有 1%、0.1% 和 0.01%（w/w）葛根成分的模拟掺假淀粉样品，提取 DNA，进行灵敏度检测。3、市售样品检测对 22 份市售淀粉样品开展葛根成分的检测，验证方法可行性。5.3 验证数据分析1、特异性验证结果经验证，12 种淀粉类植物样品中仅葛根出现特异性扩增曲线，Ct 值35.0，其他样品均未出现扩增曲线，Ct 值=40.0 ，说明该标准方法可特异检测葛根成分。表 1 葛根成分特异性验证结果注：“+” 代表 “检出”；“” 代表“未检出
26、”。2、最低检测限分析结果对葛根淀粉含量为 1%、0.1%和 0.01%（w/w）的模拟掺假淀粉样品开展检测，结果表明，葛根淀粉含量为 0.1%和 1%的样品出现荧光扩增， Ct 值35.0，而含量为0.01%葛根淀粉未出现荧光扩增，Ct 值=40.0，表明方法的最低检测限为 0.1%（w/w） 。表 2 方法最低检测限验证结果注：“+” 代表 “检出”；“” 代表“未检出 ”。3、市售样品检测结果采用本方法对市售 22 份淀粉样品进行葛根成分检测，发现 3 份葛根淀粉均检出葛根成分，其它样品未检出，说明本方法适用于市售淀粉中葛根成分的检测。表 3 市售样品检测结果注：“+” 代表 “检出”；
27、“” 代表“未检出 ”。5.4 验证评价经验证，中国检验检疫科学研究院建立的葛根淀粉实时荧光 PCR 检测方法，特异性强，灵敏度高，能准确检测出淀粉中的葛根源性成分，为市场中淀粉成分检测方法标准化提供了技术依据。5.5 其他应说明的情况 无6 附加说明（可选项）6.1 宣贯标准的建议6.2 修订和废除现行有关标准的建议6.3 作为强制性标准或推荐性的建议6.4 其他需要说明的情况6.5 参考文献联系人 韩建勋 联系电话 13810248147 电子邮箱 注 1：本模版表的共性部分为第 1 章、第 2 章、第 4 章和第 6 章。注 2：3.4 适用于标准草案送审稿，3.5 适用于标准草案报批稿，3.6 中预期的管理目标适用于规程类标准，3.6 中技术指标适用于方法类标准，第 5 章适用于方法类标准编制说明的编写。注 3：3.1 和第 6 章为可选项，其余为必填项。编写日期：2018 年 10 月 21 日
