1、富硒金针菇菌株的选育毕业论文I毕业论文富硒金针菇菌种的选育摘 要目的：食用菌以其独特的营养价值、药理作用和简易高效的生 产工艺等优势备受青睐。金 针菇（Flammnlina velutipes）作为食用菌中的一 朵奇葩，更有美味可口、营养丰富、抗癌治溃疡等作用。目前对金针菇的营养成分报道较多，本文对金针菇菌丝体及其紫外 诱变体的最佳富硒能力的培养基硒含量、菌丝生长特性、平板富硒培养与液体富硒培养、菌丝体硒含量等做了探讨。方法：本实验配置马铃薯综合培养基、紫外菌丝体诱变、富硒CM 培养基培养金 针菇201和白色金 针菇；针对固体平板培养，采用十字交叉法测量菌落半径，使用乳酸石炭酸棉蓝染色液将菌丝
2、染色，测其菌丝直径；针对液体发酵，使用游标卡尺测量菌丝球直径，收集菌丝 球于称量瓶，在 电热恒温干燥箱中烘干至恒重，用电子分析天平称其干重；使用紫外分光光度法测定菌丝含硒量；对实验数据的处理采用EXCEL制图、SPSS统计分析处理。结果：白色金针菇、金针菇201及其诱变 菌种均能在含硒量 为2035g/L的培养基上生长速度达到最快，富硒能力最强的状态。结论：相对于固体平板培养，液体 发酵培养菌 丝体的生长速度及富硒能力达到新的高度。关键词：金针菇；硒；紫外诱变；固化富硒培养；液体摇床培养富硒金针菇菌株的选育毕业论文IIThe Breeding of Selenium-accumulating
3、Strain of Flammulina velutipessAbstractSubject: Edible fungi is extremely popular for its unique nutritional value, high-efficiency production process, and pharmacological effects. Flammulina velutipes, as a delicious and eutrophy fungi, also have the curative effect to anti-cancer and ulcers. At pr
4、esent, the nutrition constituent of Flammnlina velutipes is reported mostly, this research is about to discover the fittest one for mycelium of Flammulina velutipes and its UV-irradiation in selenium-accumulating media content, growth characteristics, differences between flat cultivation and cultiva
5、tion of liquid selenium of selenium- accumulating mycelia, and selenium content of mycelium. Methods: This research configure potato integrated medium, ultraviolet radiation mutagenesis on mycelium, and Se- accumulating CM medium for training Flammnlina velutipes 201 and white Flammnlina velutipes.
6、In the plate culture, I measure colony radius by cross cross method, lactic acid carbolic acid cotton blue dyeing liquid will be used in mycelium dyeing, measuring its mycelium diameter. In the liquid fermentation, calculate mycelium ball diameter by Vernier caliper. Mycelium ball in the bottle, dry
7、ing to constant heavy in the electric thermostat dry box, calculate its dry heavy with Precision electronic balance. Using ultraviolet Spectrophotometric method determinates of selenium content of mycelium. The excel mapping and SPSS statistical analysis will be used in the processing of experimenta
8、l data. Results: When selenium concentration of culture is 2035 g/l, the fastest growth rate and selenium status of the most powerful of Flammnlina velutipes 201 and white Flammnlina velutipes and mutation strain will be achieved in the culture. Conclusions: Comparing with the plate culture, myceliu
9、m growth rate and capacity of Se-accumulating reaches new standard in the liquid fermentation.Key words: Flammnlina velutipes；Selenium；ultraviolet radiation mutagenesis ；Se- accumulating plate culture；Se- accumulating Liquid training富硒金针菇菌株的选育毕业论文III目 录1 引言 .11.1 金针菇的特性 .11.2 硒的生理生化功能 .11.3 人体所适宜的膳食
10、硒浓度 .12 材料和方法 .22.1 材料 .22.1.1 菌种 .22.1.2 药品 .22.1.3 培养基 .32.1.4 仪器及设备 .32.1.5 耗材 .32.2 方法 .32.2.1 一级菌种培养基的配置方法 .32.2.2 菌丝体转管 .52.2.3 紫外诱变 .52.2.4 菌丝体的活化与复壮 .62.2.5 菌种保藏 .62.2.6 固化富硒培养 .62.2.7 液体富硒培养 .72.2.8 固化金针菇菌丝的形态学检测 .72.2.9 液体培养金针菇菌丝球的形态学检测 .82.2.11 标准曲线的制作 .93 结果与分析（讨论） .103.1 紫外诱变对金针菇形态学特征的影
11、响 .103.2 金针菇在液体富硒培养中的特性 .103.2.1 金针菇在液体富硒培养基中的生长特性 .113.2.2 金针菇在液体富硒培养基中的富硒特性 .133.3 对白色金针菇和金针菇 201 及其诱变菌种的相关参数的统计分析 .293.3.1 紫外诱变对白色金针菇和金针菇 201 的生长速率以及富硒能力的影响 .293.3.2 白色金针菇和金针菇 201 的生长速率以及富硒能力的独立样本 t 检验 .303.3.3 固体、液体培养对金针菇生长速率和富硒能力的独立样本 t 检验 .304 结论与展望 .314.1 结论 .314.2 展望 .31参考文献 .32附录 .33培养基配置的原
12、则 .33pH 值标准溶液配置说明 .33高压蒸汽灭菌的方法步骤 .34一级菌种转管的注意事项 .34致 谢 .35富硒金针菇菌株的选育毕业论文1富硒金针菇菌种的选育1 引言1.1 金针菇的特性金针菇含有丰富的营养，美味可口，对儿童的健康成长和智力发育有益。18 种氨基酸，其含量高于一般菇类,又称“增智菇” 。金针菇体内的“冬菇素”和多糖体朴菇素，是非常有效的抗癌活性物质，预防高血压降低胆固醇，治疗消化道炎、肝炎等疾病 1。1.2 硒的生理生化功能硒是人体必须的微量元素之一，能够提高免疫力、抗氧化、提高基础代谢等作用，在人体中扮演着非常重要的角色。硒的缺乏将容易导致大骨节病和克山病的产生 2，
13、以及与免疫功能的丧失、癌症的发生有着较大的关系 3，以及是体内红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分 4。硒浓度过高，也会对人体产生毒性 5。硒也能够减弱微量元素毒性 6。1.3 人体所适宜的膳食硒浓度硒元素是人体内不可缺少的必需元素，硒缺乏克山病、大骨节病。它在人体内扮演这重要的角色。但是摄入过多，对人体有害。因此补硒是有一定的标准。无机硒在金针菇体内高效的转化为有机硒，成为硒蛋白、硒多糖等 7。不同的硒浓度，其产生的生物学效应是不同的。1.3.1 补硒标准有关硒的摄入量的研究，WHO 等三个国际组织已经给出标准：以预防克山病等疾病发生为界限的最低需要量 17g/d，以 GPx 达到饱和为正
14、常生理功能指标的生理需要量 40g/d，膳食硒供给量 50250g/d ，膳食硒最高安全摄入量 400g/d，以指甲变形的界限中毒剂量的 800g/d 8。1.3.2 富硒食品的开发仅仅依靠膳食中低水平硒的摄入，这会对人体健康产生潜在的威胁。因此，研发富硒食品具有非常重要的意义。目前国内外的富硒食品的开发主要有以下几个途径。富硒地区土壤中富含硒的特点生产富硒食品；植物转化提高产品中的含硒量；通过动物富集获得富硒产品；利用微生物转化法生产富硒产品 9。富硒金针菇菌株的选育毕业论文22 材料和方法2.1 材料2.1.1 菌种田野金针菇 201，由合肥市田野菌业有限公司提供；诱变菌种 201.5 和
15、 201.10，系由菌种田野金针菇 201（合肥市田野菌业有限公司提供）分别经 5min 和 10min 紫外诱变、筛选获得，未经诱变的田野金针菇 201 记为 201.0；野树林白色金针菇，由芜湖野树林生物科技有限公司提供；诱变菌种白.5 和白.10，系由菌种野树林白色金针菇（芜湖野树林生物科技有限公司）分别经 5min 和 10min 紫外诱变、筛选获得，未经诱变的野树林白色金针菇记为白.0。2.1.2 药品 灭菌用试剂乙醇：75%乙醇主要用于接种操作时的工作台面、接种工具、菌种容器表面和操作员手的消毒。 培养基用试剂马铃薯、葡萄糖、KHPO、硫酸镁、琼脂、维生素 B、水、KHPO、蛋白胨
16、硒储备液（配合固化 CM 培养基和液体 CM 培养基，制备不同硒浓度富硒培养基）使用分析天平称取亚硒酸钠 0.219g，溶解于蒸馏水中，定容至 100ml，此溶液含硒 1g/L；稀释至含硒 1g/ml，获得硒储备液。 染色剂（用于菌丝体的镜检）乳酸石炭酸棉兰染色液 硒标准液（用于硒标准曲线的制作）使用分析天平称取亚硒酸钠 0.219g 溶解于蒸馏水中，定容至 100ml；摇匀后取 3.0ml，加蒸馏水定容至 100ml，制得硒标准液，含硒 30g/ml。 硒含量测定试剂硫酸高氯酸消解液：3V 浓硫酸与 4V 高氯酸的混合液；钼酸钠溶液：于少量蒸馏水中溶解 10g 钼酸钠，加蒸馏水定容至 150
17、ml；40%盐酸羟胺溶液:称取 40g 盐酸羟胺溶于蒸馏水中，定容至 100ml；0.2mol/LEDTA：称 37gEDTA 二钠盐，加蒸馏水搅拌溶解，稀释至500ml；1:1（V/V）磷酸溶液：取 50ml 磷酸，加 50ml 蒸馏水；富硒金针菇菌株的选育毕业论文30.2%邻苯二胺溶液（现配现用）：取 0.2g 邻苯二胺，溶解于少量蒸馏水，并定容至 100ml。甲苯。（以上试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司）2.1.3 培养基马铃薯综合培养基（菌丝活化和菌种保持用）马铃薯：200g；葡萄糖：20g；KHPO: 3g；硫酸镁：1.5g；琼脂：120g；维生素 B1：10mg；水
18、：1000ml。固化 CM 培养基（配合各个硒浓度梯度，进行固体平板菌丝富硒培养）蛋白胨：2g；葡萄糖：20g；KHPO: 0.46g；硫酸镁：0.5g；KHPO: 1g；琼脂：18g；水：1000ml液体 CM 培养基（配合各个硒浓度梯度，进行液体摇床菌丝球富硒培养）蛋白胨：2g；葡萄糖：20g；KHPO: 0.46g；硫酸镁：0.5g；KHPO: 1g；水：1000mL（以上试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司）2.1.4 仪器及设备显微镜 CX21FS1 南京江南永新光学有限公司电子天平 YP2002 上海越平科学仪器有限公司美菱冰箱 BCD-221CHC 合肥美菱股份有限公
19、司电热恒温水浴锅 DK-S24 上海精宏实验设备有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9246A 上海精宏实验设备有限公司电热恒温干燥箱 DHG-9147A 上海精宏实验设备有限公司游标卡尺 GB/T1214.2-1996 上海量具刃具厂电热恒温培养箱 DNP-9272 上海精宏实验设备有限公司数字式 pH 计 pHS-25 上海理达仪器厂立式压力蒸汽灭菌器 LDZX-50KBS 上海申安医疗器械厂全温培养摇床 QYC-200 上海新苗医疗器械制造有限公司电子分析天平 BN 0313 上海民桥精密科学仪器有限公司紫外可见分光光度计 UV-1100 上海美谱达仪器有限公司2.1.5 耗材镜台测微尺
20、、石英比色皿、玻璃比色皿、双层铁皮电炉2.2 方法富硒金针菇菌株的选育毕业论文42.2.1 一级菌种培养基的配置方法 材料准备 10 马铃薯、葡萄糖、KHPO、硫酸镁、琼脂条、维生素 B1、水、1%盐酸、75%乙醇、1%氢氧化钠溶液。 仪器准备 电子秤、电炉、搪瓷缸、脱脂棉 、称量纸、玻璃棒、石棉网、烧杯、大试管、pH 计、漏斗、铁架台、乳胶管、小木条、锥形瓶、橡胶塞、棉线、纱布。 热浸提 选取新鲜、洁净、没有发芽、变青的马铃薯 200g，洗净、去皮、挖眼，切成 1cm 的小块。将切好的马铃薯小块放入 1000ml 水中，电炉加热煮沸后用文火保持 30min，此间应注意用玻璃棒搅拌，防止溶液上
21、层漫出。煮至搅拌基本没有阻力即可。 过滤 煮好后，用 4 层纱布过滤取马铃薯汁液。并加水至 1000ml。 琼脂融化 称取琼脂 20g，洗净剪碎，加入马铃薯煮出液中，用文火加热，边煮边搅拌，直至全部琼脂融化，再用 4 层纱布过滤取滤液。 定容 准确称取 10mg 维生素 B1、20g 葡萄糖、3g KHPO、1.5g 硫酸镁，逐一加入液体中，并用热水补足至 1000ml。 调节 pH 加水定容后，用 pH 计测定培养基中的 pH，使用盐酸或者氢氧化钠溶液将酸碱度调至 6.26.8。pH 计的 pH 值校准与使用参见附录。 分装试管 先在玻璃漏斗嘴上套一段乳胶管，卡上止流夹，将培养基倒入漏斗中。
22、左手握住大试管，让乳胶管伸入大试管中部，右手拇指和食指按下止流夹，逐一注入培养基，装入量以试管容积的为宜。分装时不要让培养基沾在大试管口上，若以沾上，要用干净纱布擦干净。剩余的综合马铃薯培养基倒入锥形瓶。 塞棉塞 两层纱布将脱脂棉包裹起来，棉线将其系紧。塞进试管。 灭菌 将试管捆成束，并用牛皮纸将试管口、棉塞部分扎好，装进灭菌锅内进行灭菌。对于锥形瓶，直接将橡胶塞塞上，包上牛皮纸。灭菌的方法步骤见附录。 超净工作台的灭菌 在超净工作台下放一根长 50cm的小木条，厚度为1cm左右。使用75%乙醇将超净台的工作台面和小木条消毒。开启紫外灯，30min后关闭。 斜面摆放 一般试管斜面培养基灭菌后需
23、要在室内取出摆成斜面，这有两个缺点：一是摆放斜面时没有足够的热量将棉塞中的水分烘干，从而易沾上杂菌；二是培养基从灭菌锅内取出后，高温水蒸汽在培养基凝固过程中遇外界低温形成冷凝水。二者均不宜金针菇的生长。缓慢降温可以避免湿棉塞和冷凝水的出现。在高温季节，培养基灭菌后，待锅内温度降至50时，取出大试管，富硒金针菇菌株的选育毕业论文5将大试管头部枕在小木条上，使管内培养基自然倾斜，斜面长度为试管长度的，覆盖保温物让其自然缓慢冷却，凝固后即成斜面培养基。 斜面无菌检验 将灭菌后的斜面放置 28恒温箱内培养 3d，剔除被污染的斜面。2.2.2 菌丝体转管 材料准备 接种钩、棉球、镊子、 75%酒精棉球、
24、75%酒精、金针菇母种培养基、酒精灯 超净工作台的灭菌 在接种前，取 75%酒精棉球蘸上 75%酒精将超净工作台表面消毒，将待接种的斜面培养基放入超净台内，并开启紫外线灯灭菌30min。 取 75%酒精棉球蘸上 75%酒精擦拭双手、超净台的工作台面、接种工具、金针菇母种试管的表面。 菌丝体的转管 点燃酒精灯开始接种操作。接种操作需靠近火焰，但注意不要灼伤菌种。将所要母种和斜面培养基用大拇指和其他四指并排握住，斜面向上，并使试管位于水平位置。右手轻轻松动棉塞，以利于接种时能较容易的拔出。右手拿接种钩，在装有酒精的瓶子中蘸一下，然后在火焰上烧红，进行灼烧灭菌。用右手小指和无名指拔掉棉塞。在火焰上灼
25、烧试管口，灼烧时应转动试管，将其沾上的少量杂均烧死。将灼烧过的接种钩伸入母种试管内，放在试管内壁停留片刻使之冷却以免烫伤菌种。在菌丝浓密处，取出 1.0cm大小的菌种块，迅速抽出，不要碰到管壁。迅速通过酒精灯火焰无菌区，把菌种块送入斜面培养基的中央。灼烧试管口，并将棉塞在火焰上迅速过一下，塞上。将接种钩在火焰上灼烧至红，放回超净台。将接好的试管贴上标签，注明菌种名称和接种时间，放在 25培养 9d 长满斜面。2.2.3 紫外诱变 材料准备 报纸、棉球、75%酒精、75%酒精棉球 仪器准备 培养皿、酒精灯、电热恒温鼓风干燥箱、电炉 培养皿干热灭菌 取培养皿 12 套，洗净后晾干。取 6 套培养皿
26、，使用报纸包扎起来。另外 6 套的处理方法与此相同。将上述 12 套培养皿放入电热恒温鼓风干燥箱灭菌，将其温度设置为 130，时间设置为 4h。 超净台的灭菌 取 75%酒精棉球蘸上 75%酒精将超净工作台表面消毒，并开启紫外线灯灭菌 30min。 融化培养基 将装满水的锅放置电炉上，插上电源，加热。内部装有综合马铃薯培养基的锥形瓶放置在锅内，水浴加热。培养基完全融化后取出，放置在超净台上。富硒金针菇菌株的选育毕业论文6 倒平板 取酒精棉球，蘸上酒精后，擦拭锥形瓶表面。趁热倒平板，培养皿的握法如下：将已灭菌的培养皿放置在超净台上。点燃酒精灯。右手小拇指和无名指拖住培养皿的底部，大拇指和中指卡在
27、培养皿的侧面，食指扣在培养皿的上部。在酒精灯火焰的无菌区，将锥形瓶中的培养基倒在培养皿中，厚度以培养基能覆盖培养皿底部即可。 平板无菌检验 将平板放置 28恒温箱内培养 3d，剔除被污染的平板。 超净台的灭菌 接种 点燃酒精灯，将复壮后的白色金针菇和金针菇 201，使用接种钩，在菌丝浓白粗壮处取出 0.5cm大小的菌种块。在火焰无菌区，左手拿培养皿，将菌种块转接至平板上。 菌丝体紫外诱变 将超净台面清理干净，使用酒精棉球蘸上酒精，擦拭超净台面。揭开培养皿的盖子，开启紫外灯，直接照射菌种块上的菌丝体，进行紫外诱变，一批照射 5min，一批照射 10min。 恒温箱培养 紫外诱变后，将平板放置电热
28、恒温培养箱中培养 9d。2.2.4 菌丝体的活化与复壮 将 2.3.2 中获得的金针菇 201 和白色金针菇菌丝体，继续转管 2 次，每次培养 9d。 将 2.3.3 中获得的诱变体 201.5、201.10、白.5、白.10 转管 2 次，每次培养 9d，使其活化。 每次转管都应在菌丝浓白粗壮处挑取菌种块。2.2.5 菌种保藏菌种保藏的目的就是使菌种在较长期的保藏之后，不被杂菌污染，仍能保持原有的生活力和生产性能，其形态特征、理化特性和遗传性状不会发生改变。稳定的保藏保证了优良菌株的高产优质，也可以作为分离菌株的对照和验证研究结果。菌种保藏的原理就是通过降低营养、缺氧、干燥、低温等手段，降低
29、菌株的新陈代谢，使菌种暂时处于休眠状态，抑制菌丝的生长和繁殖，从而降低其变异率。菌种保藏的方法有多种，斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、半固体穿刺保藏法、沙土管保藏法、加入保护剂冻存保藏法、冷冻真空干燥保藏法等 11。我们采用斜面低温保藏法，具体方法是将金针菇菌种接种于马铃薯综合培养基中，25条件下培养。培养过程中要勤检查,当菌丝体长满斜面，及时挑选无污染、菌丝浓白粗壮的固化菌种,放在 4冰箱中保藏,每隔 3 个月时间移植转管一次。保藏时棉塞部分需用灭过菌的牛皮纸包扎棉塞,以防培养基干燥，也可降富硒金针菇菌株的选育毕业论文7低污染的机会。2.2.6 固化富硒培养本次实验，我将培养基富硒浓度梯度设
30、置为0、5、10、15、20、25、30、35、40(g/L) 12。 配置固化 CM 培养基 取 9 个锥形瓶编号。向 9 个锥形瓶中各加入硒储备液0、1、2、3、4、5、6、7、8mL。配置固化 CM 培养基，分装至锥形瓶中，200mL/个，摇匀，获得各个硒浓度梯度的固化富硒 CM 培养基母液。 灭菌 锥形瓶用 8 层纱布、牛皮纸包扎后，放入灭菌锅中灭菌。温度设置为115，时间为 30min。打开超净台上的紫外灯，灭菌 30min。 倒平板 在超净台灭菌后，取已灭菌的培养皿 54 套。取出锥形瓶，将200mL 富硒 CM 培养基母液分装至 6 套培养皿。将培养皿贴上标签。白.5.0 中的“
31、0”代表培养基含硒量为“0” ，其他以此类推。 平板无菌检验 将已灭菌的斜面置于 25恒温箱内培养 3d，只有培养基表面及基质内无任何杂菌菌落出现，说明已达到灭菌目的，才可使用。 接种 将金针菇母种接种至富硒培养基，其中母种设置为田野金针菇 201、野树林白色金针菇，诱变梯度设置为 5、10min，硒浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40（g/L ） 。设置一不接种的、不含硒的空白对照。 富硒培养 将平板置于电热恒温培养箱 25，培养 9d。2.2.7 液体富硒培养我们将培养基富硒浓度梯度设置为 0、5、10、15、20、25、30、40（g/L） 。 配置液体富硒 CM
32、培养基 取 8 个锥形瓶编号。向 8 个大烧杯中各加入硒储备液 0、3、6、9、12、15、18、24mL。配置液体 CM 培养基，向各个烧杯中加入液体 CM 培养基 600mL，摇匀，获得各个硒浓度梯度的液体富硒 CM 培养基母液。 分装 取干净的锥形瓶 48 套。将每个 600mL 富硒 CM 培养基母液分装至 6 个锥形瓶中，贴上标签。 pH 测定 使用数字式 pH 计测定锥形瓶中的 pH，pH 自然即可。 培养基、超净台的灭菌 液体富硒培养基的无菌检验 与斜面无菌检验方法一致，在 25恒温箱内培养 3d 后，只有当发酵液依然保持原来的清澈程度，才可使用。 接种 将金针菇母种接种至富硒培养基，其中母种设置为田野金针菇 201、野树林白色金针菇，诱变梯度设置为 5、10min，硒浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40（g/L ） 。设置一不接种的、不含硒的空白
