1、天然药物的提取分离,从实验室研究到工业化生产,专题,基本内容,一、调查研究 二、选择提取方法 三、常用溶剂 四、工业常用的提取方法 五、工业常用的精制方法 六、柱分离过程 七、重结晶 八、纯度和结构鉴定九、小试中试应注意的其它问题,调查研究,市场价位 提取原料（种类、分布、储量、价格等） 原料各部位目标化合物的含量 原料中的其它有价值化合物及其含量 简单经济核算，确定目标化合物提取分离的预期附加值,例1 紫杉醇（红豆杉）,是近年来研究和开发的一种具有独特作用机理的新型抗肿瘤药物，美国1972年首次分离，1992年上市，我国1995年上市； 紫杉醇paclitaxel，商品名Taxol，泰素；
2、是从红豆杉属(Taxus)分离得到的； 存在于树皮和树叶中，树皮中含量0.030.06，树叶中含量0.010.03； 国内市场含量99的紫杉醇原料药价格1600元人民币/克，90以上出口美国； 我国生产临床制剂仅海口制药厂和中国医学科学院药物研究所两家； 红豆杉属于国家一类保护植物，目前开发和生产受到限制。,红豆杉世界23种1变种，我国4种1变种：东北红豆杉Taxus cuspidata Sieb et Zucc.云南红豆杉T. yunnanensis Cheng et L.K.Fu南方红豆杉T.chinenisis var mairei Cheng et L.K.Fu中国红豆杉T. chin
3、enisis Rehd西藏红豆杉T.wallichiana Zucc. 基本形态为常绿乔木，人工栽培有灌木。曼地亚红豆杉、是二十世纪末引种我国的杂交品种。其母本是东北红豆杉（T.CUSPIDATA）.父本是欧洲红豆杉（.T.BACCDFA）. 曼地亚红豆杉多为灌木型，紫杉醇含量较高. 从全球范围看，虽然红豆杉在美国、加拿大、法国、印度、缅甸及中国都有分布，但亚洲的红豆杉储量最多。其中中国的红豆杉储量是全球储量的一半以上.,资源： 东北红豆杉：长白山、黑龙江张广才岭、老爷岭，小兴安岭南部。 云南红豆杉：滇西北，高黎贡山西坡，怒江、澜沧江、金沙江上游。 南方红豆杉和中国红豆杉：滇东北、滇东南，四川
4、大雪山、大巴山、邛崃山、秦岭、甘肃南部，黔西，鄂西，湖南、广西，河南等。 西藏红豆杉：滇西北，西藏南部，喜马拉雅山东段，喜马拉雅大峡谷。,野 生 红 豆 杉,东北红豆杉（苇河栽培）,简单核算,原料Taxol含量以0.03计，提取收率按50计： 1吨原料含Taxol300g，可分离得到150g； 150g2000元/g30万元 1吨原料成本20元/kg1000kg2万元 有机溶剂预期4万元 30万元2万元4万元24万元 利润空间大 设计提取工艺的关键在于如何达到目标含量（99） 能否工业化的关键在于资源占有量,例2 茶多酚,1、茶多酚（EGCG50）,目标化合物茶多酚（EGCG含量50）市场价格
5、300元/kg 资源丰富。产地成熟茶树叶2元/kg 其它潜在利用化合物咖啡因、茶多糖、叶绿素等 叶片中EGCG含量约7% 1吨茶叶原料含EGCG70kg，折算成50EGCG产品140kg，提取收率以80计 140kg80300元/kg33600元 1吨茶叶原料2000元 33600元2000元31600元 如果有机溶剂按预期4万元，亏损！ 利润空间小，使用有机溶剂要注意成本,2、98EGCG,98EGCG市场价格240元/g 1吨茶叶原料含EGCG70kg，提取分离收率按50计 70kg50240元/g840万元 预期有机溶剂4万元 840万元0.2万元4万元835.8万元 利润空间巨大 设计
6、提取工艺的关键在于如何达到目标含量（98） 能否工业化的关键也在于能否达到含量要求。,例3 白藜芦醇,白藜芦醇的存在,目前至少已经在21个科、31个属的72种植物中发现其存在。 如虎杖、决明、桑子、葡萄、花生、藜芦、酸模、松科等。 其中虎杖中的含量最为丰富，约为0.2。 有文献报道花生根、茎中存在白藜芦醇，有人测定新疆产花生根茎含0.05。,虎 杖,又名斑根紫金龙，活血龙、阴阳莲、土大黄、土黄芪、土黄连、蛇总管等。 拉丁名： Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc. 英文名：Giant Knotweed Rhizome 日文名：,虎杖生境分布,生于湿润而深厚的土壤，
7、常见于山沟、河旁溪边、灌丛边、林下阴湿处及田野路旁，成片生长。 主产：江苏、浙江、安徽、四川，贵州、广东、广西。 其它产地：河南、河北、山东、福建、台湾、湖南、湖北、云南等地。,以虎杖为主要提取原料的理由,价格便宜。虎杖属滞销中药材，产地价格为每公斤0.81.5元，货源充足； 含量高。为葡萄皮的20倍以上； 尚含有可转变为白藜芦醇的白藜芦醇苷，含量更高，为1.5左右。,虎杖中的可利用的成分,虎杖提取白藜芦醇的简单成本核算,哈尔滨三棵树中药材市场批发价格35004000元/吨，产地价格为8001500元/吨。原料价格按2000元/吨计。 国际市场白藜芦醇价格40004500美元/公斤。 国内市场
8、白藜芦醇价格2500030000元人民币/公斤。 白藜芦醇价格按25000元/kg计。 虎杖白藜芦醇平均含量约0.2。 提取收率按50计 1吨原料可提取白藜芦醇：1000kg0.2501kg 1kg25000元/kg2000元23000元 白藜芦醇苷含量2，可水解转化成白藜芦醇，转化率90，1吨虎杖中白藜芦醇苷可转换白藜芦醇：1000kg290509kg25000元/kg=22.5万元,文献检索,国内相关杂志文献 国内相关专利文献 国外相关专利文献 国外相关杂志文献怀疑的态度看文献 钻空的想法读专利,根据目标化合物理化性质 选择提取方法,1、挥发性成分水蒸气蒸馏法（迷迭香油） 2、酸性成分碱水
9、提取法（酚类、黄酮） 3、碱性成分酸水提取法 4、极性成分水提取法 5、弱极性成分80以上乙醇提取低极性有机溶剂提取（石油醚、环己烷等） 6、中等极性成分水提取法各种浓度的乙醇提取法,提取条件选择,1、固液比（料液比、液比）定义：每克绝干原料：溶剂毫升*测定原料含水率一般而言：种子、根、木质部液比1：51：10；茎、叶、皮 1：81：15液比越大收率越高，但不主张无限增大液比，因溶剂回收负荷大。,2、温度对大多数物质而言，升温增加分子运动迁移速度，有助于目标化合物从原料中溶解出来，升温有利。*许多天然药物高温分解高温工业能耗高一般而言7080较好苷类和酯键连接化合物，注意植物体内酶的影响。“植
10、物体中存在什么样的苷，也存在降解这种苷的酶”提取苷类应先杀酶，再提取提取苷元3555 保温，酶解苷类,3、浓度对与水互溶的溶剂而言，应尽量避免使用85以上浓度（如无水乙醇、95乙醇）；对与水不互溶的溶剂而言，应尽量避免使用三元溶剂系统；二元溶剂系统反复使用时应重新确定溶剂比例；二元系统的比例确定：折光率测定法薄层层析法,4、提取次数,小试测定每次的提取收率和含量。 收率,一般计算结果在85左右的提取次数可确定为实际提取次数； 本例工业上可提取3次，合并前2次提取液进入下一工序，第3次提取液作为下一循环的第一次提取溶剂套用。 但要根据原料资源情况（如红豆杉，资源紧缺）计算数值在95左右较好。,5
11、、实验设计法,均匀设计法 正交设计法 单因素试验法,常用溶剂,非极性弱极性溶剂 石油醚：低碳烷烃混合物，市售3种类型（按沸程3060、6090、90120），无毒、易燃，反复使用后性质略有变化。 乙醚：弱极性，低沸点，易爆，一般不用作工业生产。 苯：非极性，致癌物质，谨慎使用。 正己烷：与石油醚性质似，工业价格贵，不用作工业生产。 环己烷：无毒，适用工业生产。,含氯溶剂 三氯甲烷（氯仿）：中等毒性，强麻醉性 ，许多国家限制使用，对生物碱类溶解度好，推荐使用其它溶剂替代。 二氯甲烷：低毒，麻醉性强 ，沸点低，使用成本高。 1，2二氯乙烷：低毒性、致癌，沸点83 1，1二氯乙烷：低毒、局部刺激性
12、，沸点57。 1，1，1-三氯乙烷 ：低毒类溶剂 ，沸点74。 四氯化碳 ：在含氯溶剂中毒性最强。不用。,中等极性溶剂 乙酸乙酯 ：低毒，麻醉性，对黄酮类及其它许多天然药物溶解度好。但对植物的渗透性差，一般不作提取用溶剂，作萃取或柱层析溶剂。 丙酮：低毒 。 丁酮 ：低毒，毒性强于丙酮 。,强极性溶剂 乙醇 甲醇 水,常用有机溶剂的极性,使用溶剂应关注的理化性质,沸点 互溶情况 介电常数 粘度 密度,相似相溶,亲水性成分易被亲水性溶剂溶出。 亲脂性成分易被亲脂性溶剂溶出。,植物成分及其较适用的提取溶剂,工业常用的提取方法,浸渍法 是将适当粉碎的植物，用适当的溶剂在常温或温热(60一80)的情况
13、下浸渍，以溶出其中成分。 本法适用于有效成分遇热易破坏以及含多量淀粉、树胶、果胶、粘液质的植物的提取。 浸出率较差，特别是用水为溶剂，提取液易发霉变质，可加入适当的防腐剂。,渗漉法： 是向植物粗粉中，不断添加浸出溶剂使其渗过植物粉末，从渗漉筒下端出口流出浸出液的一种浸出方法。 当溶剂渗进植物，溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效率较高，浸出液较澄清。 但溶剂消耗量大、费时长、操作麻烦。,煎煮法： 是将植物粗粉加水加热煮沸，将有效成分提取出来的方法。 方法简便，植物中大部分成分可被不同程度地提出。 含挥发性成分及有效成分遇热
14、易破坏的植物不宜用此法。 对含有多糖类植物，煎煮后，药液比较粘稠，过滤比较困难。,回流提取法： 如用易挥发的有机溶剂加热提取有效成分时，需采用回流提取法以减少溶剂消耗，提高浸出效率。 受热易破坏的成分不宜用此法。 且溶剂消耗量仍大，操作亦麻烦。 是植物药提取行业最常用的方法。,连续回流提取法： 为了弥补回流提取法中需要溶剂量大，操作较烦的不足，可采用连续提取法。 实验室常用索氏提取器或称脂肪提取器。 连续提取法提取液受热时间长，因此对受热易分解的成分不宜用此法。,索氏提取器,水蒸气蒸馏法,水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。
15、此类成分的沸点多在100 以上，并在100左右有一定的蒸气压。植物的挥发油、某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱以及某些小分子的酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏。,实验室装置：,工业上，将植物粗粉在蒸馏器中加水浸泡后，直接加热煮沸，产生水蒸气与可被水蒸气蒸馏成分的混合蒸汽，经冷凝后静止分层，成分得以分离。,工业常用的精制方法,1、两相溶剂萃取法,是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 混合物中各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。 如果在水提液中的有效成分是亲脂性物质，一般多采用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行萃取； 如果有效成分
16、是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用与水不相混溶而具有一定程度亲水性的有机溶剂，如乙酸乙酯、丁醇等萃取。 例如提取黄酮类成分，多用乙酸乙酯与水作两相萃取，提取皂甙则多选用正丁醇、异戊醇与水作两相萃取。,2、沉淀法,最常用的是铅盐法，可以用于除去杂质，也可以用于沉淀有效成分。铅盐法是利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀，而用于分离植物成分。 中性醋酸铅可以沉淀有机酸、蛋白质、氨基酸、粘液质、 鞣质、酸性皂甙、树脂、部分黄酮甙和花色甙等。 碱式醋酸铅沉淀范围更广，除了上述能被中性醋酸铅沉淀的物质外，还可沉淀某些中性皂甙、异黄酮甙、糖类和一些
17、碱性较弱的生物碱等。 通常将铅盐沉淀滤出，然后将沉淀悬于水或稀醇中，通硫化氢气体或加硫酸钠等试剂进行脱铅，即可回收提取物。,3、盐析法,盐析法是在植物水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使某些成分在水中溶解度降低，从而与水溶性大的杂质分离。 常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。,4、分馏法,对于完全能够互溶的液体系统，可利用各成分沸点的不同而采用分馏法。 植物化学成分的研究工作中，挥发油及一些液体生物碱的分离即常用分馏法。 一般说来，液体混合物沸点相差在100以上，可将溶液重复蒸馏多次即可达到分离的目的，如沸点相差在25以下，则需采用分馏柱，沸点相差越小，则需要的分
18、馏装置越精细。,5、结晶法,结晶法是分离和精制固体成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同来达到分离的方法。具体操作是选用合适的溶剂，将混合物加热溶解，形成有效成分的饱和溶液，乘热滤去不溶的杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出结晶，由于初析出的结晶总会带一些杂质，因此需要通过反复结晶即所谓重结晶的方法，才能得到高纯度的晶体。结晶法所用的样品必须是已经用其他方法提得比较纯的时候才能采用此法精制。,6、层析分离法,层析是一种现代的物理化学分离、分析技术，它尤其对植物化学中结构相类似的成分，一般结晶、沉淀、液液萃取等方法难以得到较好的分离，采用层析法
19、往往可获得满意的结果。 层析法的基本原理是利用混合物中各成分对固定相和移动相亲和作用的差别而达到相互分离的。 利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力差别进行分离的称为吸附层析； 利用混合物中各成分在固定相（液体）和运动相中分配系数差别而进行分离的称为分配层析； 利用离子交换剂作为固定相的称为离子交换层析； 利用化合物与固定相形成氢键吸附的聚酰胺层析； 起分子筛作用的为凝胶层析。 层析在柱上、薄层上、纸上进行的则分别称为柱层析、薄层层析、纸层析。此外，移动相为气体的称为气相层析；移动相为液体的称为液相层析。,柱分离过程,柱层析设备,柱层析工艺流程,各种层析柱,柱分离过程常用的填料,硅胶 大孔树脂 聚
20、酰胺 氧化铝 葡聚糖凝胶 烷基键合硅胶 活性炭 纤维素 离子交换树脂,其它吸附柱层析填料,经典吸附柱层析最常用的吸附剂是氧化铝和硅胶，其次是活性炭、氧化镁、硅酸镁、碳酸钙和硅藻土等。除活性炭为非极性吸附剂外，其余均为极性吸附剂，它们的吸附能力一般按下列顺序逐渐减小:氧化铝 氧化镁 活性炭 硅酸镁 硅胶 碳酸钙 硅藻土吸附力逐渐减小 吸附剂的吸附作用主要是借氢键，络合作用，静电引力，范德华力等而产生的。其吸附强度除了与吸附剂本身的吸附能力有关，还与被吸附成分的性质和溶剂的性质有关。例如极性大的吸附剂对极性大的成分吸附强度就大，因而难以洗脱。又如活性炭对芳香族化合物的吸附强度大于脂肪族化合物，而在
21、水溶液中的吸附作用最强，在有机溶剂中吸附作用则较弱，故水的洗脱能力弱，而有机溶剂的洗脱能力则较强。,物质的纯化（重结晶）,对于含量要求98以上的天然药物，仅仅依靠柱层析方法一般难以达到要求，需要采用多次反复重结晶的方法纯化。,纯度和结构鉴定,上述过程得到的产物一般还要经过纯度和结构确认。纯度一般可采用高压液相色谱、气相 色谱、薄层扫描、紫外光谱等方法测定。结构确认一般可采用熔沸点测定、红外光谱、核磁共振、质谱等鉴定。,我室目前分离的几种天然药物,实验室小试中试应注意的 其它问题,小试阶段的研究重点应紧紧绕影响工业生产的关键性问题。如缩短分离路线，提高产率，简化操作，降低成本和安全生产等。,小试
22、阶段的研究重点,用工业级原料代替化学试剂,实验室小量分离时，常用试剂规格的原料和溶剂，不仅价格昂贵，也不可能有大量供应。大规模生产应尽量采用化工原料和工业级溶剂。小试阶段应探明，用工业级原料和溶剂对反应有无干扰，对产品的产率和质量有无影响。通过小试研究找出适合于用工业级原料生产的最佳工艺条件和处理方法，达到价廉、优质和高产。,原料和溶剂的回收套用,提取分离一般要用大量溶剂，多数情况下溶剂没有明显变化，可直接回收套用。有时溶剂中可能含有挥发性杂质，或溶剂的浓度改变，应通过小试研究找出回收处理的办法，并以数据说明，用回收的原料和溶剂不影响产品的质量。原料和溶剂的回收套用，不仅能降低成本，而且有利于
23、三废处理和环境卫生。,安全生产和环境卫生,安全对工业生产至关重要，应通过小试研究尽量去掉有毒物质和有害溶剂的分离过程；避免采用易燃、易爆的危险操作。如一时不能解决，应找出相应的防护措施。尽量不用毒性大的有机溶剂，寻找性质相似而毒性小的溶剂代替。,中试生产阶段,中试生产是从实验室过渡到工业生产必有可少的重要环节，是二者之间的桥粱。中试生产是小试的扩大，是工业生产的缩影，应在工厂或专门的中试车间进行。中试生产的主要任务是： .考核小试提供的提取分离工艺路线，在工艺条件、设备、原材料等方面是否有特殊要求，是否适合于工业生产。 .验证小试提供的工艺路线，是否成熟、合理，主要经济技术指标是否接近生产要求。 .在放大中试研究过程中，进一步考核和完善工艺路线，对每一步骤和单元操作，均应取得基本稳定的数据。 .根据中试研究的结果制订或修订中间体和成品的质量标准，以及分析鉴定方法。 .制备中间体及成品的批次一般不少于 批，以便积累数据，完善中试生产资料。 .根据原材料、动力消耗和工时等，初步进行经济技术指标的核算，提出生产成本。 .对各步物料进行分步规划，提出回收套用和三废处理的措施。 .提出整个工艺路线的流程，各个单元操作的工艺规程，安全操作要求及制度。,The End,
