1、1,高等仪器分析,3、平面色谱,2,3.1 平面色谱类型,薄层色谱 纸色谱 薄层电泳,3,平面色谱操作过程,载体：滤纸（纤维素），可吸附22%水，其中 6%与纤维素上的羟基结合（通过氢键和分子 之间的偶极作用）形成固定相,纸色谱属于分配色谱 - 正相和反相分配纸色谱,纸色谱,薄层 分离机制 主要应用范围 氧化铝板 吸附 脂肪和芳香化合物、生物 硅胶板 吸附 碱、甾类、萜类 改性硅胶 C2,C8,C18RP 正相、反相 非极性物质、极性物质 CN板 正相、反相 农药、酚类、甾类 NH2板 正相、反相、 核苷酸、农药、酚类、甾类、 阴离子交换 维生素类、嘌呤衍生物 纤维素 分配 氨基酸、梭酸 乙酰
2、纤维素 正相、反相 蒽醌类、抗氧化剂 离子交换剂 阴、阳离子交换 氨基酸、梭酸、氨基糖、肽 聚酰胺 分配 黄酮类、酚类 葡聚糖凝胶 凝胶过滤 蛋白质、核苷酸,薄层色谱,7,带电荷的分离物质(蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等)在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等支持介质上，向与其相反的电极方向以不同速度泳动(或迁移)而实现分离，然后对组分进行定性和定量的方法。,薄层电泳,8,3.2 平面色谱参数,比移值,Rf= L/L0,9,相对比移值,组分与参考物质在同一条件下的Rf值(或移行距离)之比,Rr = Rf(a) / Rf(s) = La / Ls,可以消除系统误差，重现性和可比性都比Rf好
3、 Rr可以大于1，也可以小于1,10,分配系数K 和容量因子k,相平衡参数,11,定义：在相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0和Rf=1两种组分斑点之间能容纳的色谱斑点数。,分离参数,分离数(separation number; SN) 分离数是衡量平面色谱分离容量的主要参数，也是面效的评价参数。,分离度,计算公式:SN=L0/(b0+b1)-1 b0,b1: Rf=0和Rf=1的组分的半峰宽,理论塔板数，塔板高度,理论塔板数(number of theoretical plate;n) 反映组分在固定相和流动相中动力学特性的色谱技术参数，代表色谱分离效能的指标。,面效参数,n =16(L
4、/W)2,塔板高度(height of theoretical plate;H) 塔板高度是由理论塔板数及原点到展开剂前沿的距离(L0)算出的单位理论塔板的长度。,计算公式：H= L0/n H与n成反比，n值越大，H值越小。,1)薄层板,(1)载体：硅胶：表面带有硅醇基，pH = 4.5，经150活化脱水 后，46个硅醇基/nm2,(2)薄层参数：厚度： 普通薄层 高效薄层 制备薄层 0.25mm 0.2mm 0.52mm 活度：吸附剂的吸附能力可用活度表示,它随含水量的增加而减弱,3.3 平面色谱固定相,硅胶、氧化铝活度、含水量与吸附力的关系,(3)粘合剂与添加剂,粘合剂a.煅石膏（CaSO
5、42H2O)：120140烘烤24h,过200目筛，密闭备用。b.梭甲基纤维素钠（-a)：0.21.0%,添加剂a.荧光指示剂 ZnSO4:Mn 254nmZnSCdS:Ag 366nmb.酸、碱或缓冲液c.硝酸银溶液：饱合化合物 炔烃 反式烯烃 顺式烯烃,(4)薄层的制备方法 手工制板a.软板b.硬板(含粘合剂),匀浆,涂布,凉干,活化,预制板：玻璃板、塑料板、铝箔板a.普通薄层预制板-硅胶、氧化铝、纤维素、硅藻土、聚酰胺、离子交换纤维素、烷基键合硅胶反相板b.高效薄层预制板-氨基、氰基键合硅胶板、手性预制板、聚酰胺、混合预制板（如：氧化铝-纤维素、纤维素-硅胶、硅藻土-硅胶等）,(5)薄层
6、板的活化 吸附剂的表面及其孔隙的表面存在许多活性点，活性点的强度和数目较大时，吸附剂的活度就高，吸附剂的保留能力也较高，被保留物质R值就小。 活化：105120干燥 0.51h 级活度的标定：a.氧化铝薄层活度的标定染料溶液的配制：称取偶氮苯30mg和对-甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、对-氨基偶氮苯各20mg溶于四氯化碳50ml中，摇匀备用。标定方法：取上述溶液20l点于待测板上，用四氯化碳展开，测量五种染料的R ，由下表中确定薄板的活度级别。,氧化铝薄层的活度级别,b.薄层活度的标定染料溶液的配制：称取对-二甲氨基偶氮苯、靛酚蓝、苏丹红（苏丹 ）各20mg溶于1ml氯仿中，摇匀备用。标定方法
7、：取上述溶液点于待测板上，用正己烷-乙酸乙酯（9：1）展开，三种染料能分开，对-二甲氨基偶氮苯在前缘，靛酚蓝在其次、苏丹红走在最后，这样的硅胶活度与前述级氧化铝的活度相当。,（6）薄层板的预处理 常用方法：用氯仿-甲醇(1:1)或所用展开剂先展开一次空白薄层板（展距要大一些），在110干燥0.51h，干燥器中保存备用。除有特殊规定外，预制板在使用时不需任何预处理。,（7）烧结薄层板和棒状薄层机械强度高、热稳定性好、耐酸并可反复使用,硅胶等固定相与玻璃粉混匀加溶剂溶解成浆，涂敷后高温炉烧结,（1）样品溶液的制备纯品的溶解样品的提取与净化a.溶剂提取法 b.液液萃取法 c.液固萃取法-亲脂型和亲水
8、型固体萃取剂,溶剂的选择a.溶剂对溶质的溶解度相对较小，否则会出现点样环形色谱效应；b.溶剂的粘度不宜太高，以便于点样；c.溶剂的沸点要适中。,3.4 点样,(2)点样样品浓度 0.011.00% 点样体积 经典薄层 15 l 高效薄层 0.10.5 l 点样过多会造成原点“超载”，展开剂产生“绕行”现象使斑点拖尾或重叠，严重影响分离点样直径 经典薄层 5mm (一般3mm)高效薄层 12mm点样间距 经典薄层 12cm 高效薄层 0.5cm,点样方法a.点状点样 b.带状点样c.自动点样 d.接触点样,接触点样示意图,样品溶液粘度大或点样体积100L,25,26,3.5 展开,28,（1）展
9、开方式线性展开a.上行展开 b.下行展开 c.双向展开 d.近水平展开,29,环型展开展开斤自圆心向四周展开，展距短、展速快、节约展开剂、分离效率高，适用于Rf（线性展开）值较小的组分的分离。(Rfc)2 = Rf,30,反圆心式展开样品点在薄层的四周，展开剂自四周向中心展开展速快、可提高R值较大组分的检测灵敏度和定量准确性,多次展开a.单向多次展开 一次展开分离效果不佳时。可待展开剂挥干后，用相同展开剂展开相同举例。nR = 1 - (1 - R)n一般二次展开即可,能得到最佳的分离,但还不能使斑点十分浓集b.增量多次展开 展距递增方式展开，以薄板的长度分数方式展开，直至薄板全长度，如：1/
10、4, 1/2,3/4增量多次展开能提供比一般薄层色谱好得多的分离度，在短时间内得到较多次展开，有利于斑点的浓集及R值较小的组分的分离。,c.阶式展开（分级展开） 使用两种或两种以上极性不同的展开剂分别展开几次，可以将极性相差很大的组分在一块薄层板上分离。 用乙醚-环己烷-甲醇（5：3：0.5）、乙醚-环己烷-甲醇（5：3：0.5）、 甲苯-氯仿甲醇-二乙胺（7：2：1：0.3）展开三次，在一块薄层板上实现了11种异喹啉生物碱的分离。,在常规色谱中，仅在展开时出现一次斑点浓集。如重复展开n次，则最后斑点宽度降低到:(1 - R)n 起始宽度，但实际上没有(1 - R)n 那么明显，主要是展开时又
11、扩散增宽，所以多次展开的优点不是在斑点的宽度上，而是增加相邻斑点的距离，并经过一个最大值后再随着继续展开而降低。,对R 值低的斑点这种浓集更有效，这意味着对极性较大组分的分离效率及灵敏度的提高。,连续展开不增加薄层板长度而使展距加长，使R值较小的组分移动较大的距离从而得到较好的分离。a.Regis短床展开室,连续展开示意图,35,b.蒸发展开当展开剂前沿推进到某一位置时，流入薄层的展开剂量恰好全部蒸发掉，此时处于稳定态，溶剂必然成负速度梯度，因此蒸发展开的分离效果比普通展开方式为高，有利于R值小于0.3的组分的分离。,蒸发展开示意图,(2)影响薄层展开的因素相对湿度a.预活化的薄层板可迅速吸附
12、空气中的水蒸气，数分钟内可达平衡；b.溶质和溶剂极性的增加，展开时最佳相对湿度的范围也相应增大。 c.控制相对湿度的方法:硫酸溶液法、无机盐溶液法溶剂蒸气的影响a.展开室饱和 b.预吸附 c.吸附饱和 d.毛细管饱和,边缘效应,“脱混”现象,多区带展开薄层色谱法,温度的影响温度对分配色谱影响较大，对吸附色谱影响较小。 展距的影响展距增加一倍，分离度为原来的21/2倍。,（3）展开剂的选择,分子间的作用a.色散力 b.偶极作用 c.氢键作用 d.介电作用,色散力很弱,无选择性,对层析无关重要 对非电解质溶剂主要研究它们的偶极作用和氢键作用 介电作用只对溶解离子化合物的样品溶剂有重要意义,展开剂的
13、极性和强度a.极性参数P混合溶剂的P值 P=APA + BPB PA、PB分别代表溶剂A和B的极性参数，A和B分别代表它们在混合溶剂中的体积分数。A/B两种溶剂组成的展开剂，当用溶剂C去替换溶剂B并保持展开剂极性不变，则C可按下式计算：C=B（PB/PA）展开剂强度越强,样品组分k值越小，R值越大;反之亦然。,b.强度参数 （：吸附层析，S：反相层析）溶剂在单位表面积的标定活度的吸附剂上的吸附能。它是通过实验测定 的，以丙烷的为零，其它溶剂的与丙烷比较而求得的相对值。,在硅胶上与P的关系曲线,Synder溶剂选择性分组,溶剂分类,溶剂选择性三角形,展开剂的选择原则：先找出一种极性或强度能使组分
14、的k 值在110（最好在0.55,或R值在0.650.17)之间，保持这个强度不变，改变展开剂的选择性直到使组分有合适的分离度。a.选择展开剂的方法a)三角形法 b)点滴试验法,46,b.二元展开剂的极性和强度的选择二元展开剂由一种强度较大的溶剂（极性调节剂）和一种强度近于零的溶剂（底剂）按一定比例混合而成。,乙醚-正己烷（50：50） P=乙醚P乙醚 + 正己烷P正己烷=0.52.8 + 0.50=1.4,在乙醚-正己烷（50：50）中，分别用氯仿、二氯甲烷替代乙醚，其体积比为：氯仿=0.52.8/4.1=0.34二氯甲烷=0.52.8/3.1=0.45氯仿：正己烷（34：66）二氯甲烷：正
15、己烷（45：55） 为了使选择性的差别达到最大，应该从靠近三角形顶部的组中选择强度较强的溶剂。,c.二元展开剂的选择性二元展开剂选择性的改变，主要是通过其中强度较强溶剂的组别的替换来实现的,d.其它因素a)拖尾抑制剂b)降低粘度和促溶作用氯仿-甲醇-水、正丁醇-冰醋酸-水,吸附层析法中的几条规则： 增大则R值增大，但选择性变小； 减小则R值减小，但选择性增大。 二元展开剂中，当较强的溶剂所占体积最大或最小时选择性最大。 当展开剂的组成改变时，如果能引起溶剂分子和溶质分子间的氢键作用的改变，则会产生最大的选择性。 如果用无水展开剂时组分斑点拖尾，则可选用去活性的吸附剂。,51,（1）光谱检出法
16、紫外 0.5g 荧光 0.01ng（2）蒸气检出法（3）试剂显色法显色方法a.喷雾显色 b.浸渍显色 c.超压衍生化d.展层-显色法显色试剂,3.6 定位和定性,a.通用显色剂a)硫酸 组成：硫酸-水（1:1），硫酸-甲醇或乙醇（1:1），1.5M硫酸与0.51.5M铵硫酸。方法：喷后110烤15min,不同有机物显不同颜 色。b)0.5%碘的氯仿溶液c)中性0.05%高锰酸钾溶液易还原化合物在淡红背景下显黄斑。d)5%磷钼酸乙醇溶液 方法：喷后120烘烤，还原化合物显蓝斑，再用氨气熏，则背景变无色。,b.专属显色剂,（4）定性斑点的R值斑点的显色特性斑点的原位光谱扫描a.薄层色谱-紫外可见光
17、谱扫描b.薄层色谱-三维光谱扫描与其它分析技术的联用a.与其它色谱法：GC、HPLCb.与电化学法联用：阳极伏安法、脉冲极谱法、库仑滴定法c.与光谱法联用：原子吸收、拉曼光谱、IR、MS 、NMR （）定量,平板色谱简单、方便、及操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。试样一般不需要经过预处理即可分离。,3.7 特点与应用,缺点： 分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及
18、中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为液相色谱的一种预试方法。,合成药物的分析方面的应用 药物的定性检鉴别、纯度检查、合成药制剂的含量测定、稳定性考查、药物代谢研究、合成工艺的监控及反应机制的研究,58,3.8 高效薄层色谱（HPTLC）,高效薄层色谱是在经典薄层色谱基础上发展起来的一种更为灵敏、精细的薄层技术 它的分离效率比经典薄层色谱提高三倍，每分钟可分离5个以上组分，最多可分离40种组分 检出灵敏度提高，分析时间缩短 高效薄层色谱法与经典薄层色谱法在吸附剂粒度等方面不同,表19-2 TLC与HPTLC的比较,参 数 TLC HPTLC,板尺寸(cm)
19、 2020 1010 颗粒直径(m) 10 40 5,10 颗粒分布 宽 窄 点样量(l) 1 5 0.10.2 原点直径(mm) 3 6 1 1.5 展开后斑点直径(mm) 6 15 2 5 有效塔板数 600 5000 有效板高(m) 30 12 点样数 10 18 36 展开距离(cm) 10 15 3 6 展开时间(min) 30 200 3 20 最小检测量：吸收(ng) 1 5 0.1 0.5荧光(pg) 50 100 5 10,60,注意事项： 薄层色谱与HPLC一样，塔板高度在很大程度上受吸附剂颗粒大小、颗粒均匀程度、薄层质量的影响 吸附剂颗粒直径小，流动相流速慢，容易达平衡，展开过程中传质阻抗较小，斑点较圆而整齐,61,
