1、Nucleotide Metabolism,Nucleic acid metabolism,DNA metabolism,RNA metabolism,Nucleic acid metabolism,DNA metabolism,DNA enzymatic degradation,DNA replication,Nucleic acid metabolism,DNA metabolism,DNA enzymatic degradation,核酸的酶促降解,(一) 核酸酶（磷酸二酯酶）,(二) 限制性内切酶,核酸酶 核苷酸酶 核苷酸磷酸化酶核酸 核苷酸 核苷 碱基+戊糖-1-P,磷酸,(一) 核
2、酸酶,1. 核酸酶的分类,（1）根据对底物的专一性分为,（2）根据切割位点分为,核糖核酸酶(RNase),脱氧核糖核酸酶(DNase),非特异性核酸酶,核酸内切酶 (DNase, RNase ),核酸外切酶 (蛇毒磷酸二酶、牛脾磷酸二酯酶 ),2. 核酸酶的作用特点,外切核酸酶对核酸的水解位点,牛脾磷酸二酯酶（ 5端外切5得3）,蛇毒磷酸二酯酶（ 3端外切3得5）,内切核酸酶对RNA的水解位点示意图,RNAase I,RNAase I,RNAase T1,RNAase T1,Pu：嘌呤 Py：嘧啶,(二) 限制性内切酶,类型 命名 意义,原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基
3、对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。,常用的DNA限制性内切酶的专一性,酶,辨认的序列和切口,说明, A G C T T C G A , G G A T C C C C T A G G , A G A T C T T C T A G A , G A A T T C C T T A A G , A A G C T T T T C G A A , G T C G A C C A G C T G , C C C G G G G G G C C C ,Bam
4、 H I,Alu I,Bgl I,Eco R I,Hind ,Sal I,Sma I,四核苷酸，平端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,限制性内切酶类型,I 型：分子量大于105，多亚基，需S-线苷蛋氨酸、ATP和Mg2+ ，识别位点与切割位点相差甚远，产物 为异质，是限制与修饰相排斥的多功能酶.,II型：分子量小于105，需Mg2+，切割位点位于识别位点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物学研究所用的限制性内切酶均为此类。,III型：识别位点为5-7bp的非对称序列 ，切割位点在顺序之外离识别 序列5-10b
5、p，切割双链，个别也切割单链。是限制与修饰相多功能酶.,限制性内切酶的命名和意义,Eco R I,序号,属名,种名,株名,例：Eco R I 是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶,限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具。,Nucleic acid metabolism,DNA metabolism,DNA replication,DNA replication fidelity,遗传信息传递的中心法则,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通
6、过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示了遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给
7、人类的生产和生活带来了深刻的革命。,(一) DNA semicoservative replication (DNA的半保留复制),一、DNA replication,DNA的半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,1958年Meselson和Stahl用同位素示踪和密度梯度 离心的方法证明了DNA的半保留复制,（二）Enzymes and p
8、roteins involved in DNA replication (与DNA复制有关的酶和蛋白质),(原核生物DNA聚合反应有关的酶类),（1）DNA polymetases ( DNA聚合酶) （2） primase and primosome(引物酶和引发体用): 启动RNA引物链的合成。 （3）DNA ligase (DNA连接酶） （4）DNA helicase (DNA解链酶) （5）Single-strand binding protein,SSB (单链结合蛋白): 结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。 （6）Topoisomerase(拓扑异构酶):兼具内切酶和
9、连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。,解旋酶,DNA聚 合酶III,解链酶,RNA引物,引物酶和引发体,DNA聚合酶I,SSB,3,3,5,3,5,5,RNA引物,Enzymes and proteins involved in DNA replication in prokaryotes,Reactions catalyzed by DNA Pol (DNA聚合酶催化的反应),or DNA nucleotidyl transferase, or DNA-directed DNA polymerase, or DNA-dependent DNA polyme
10、rase i.e. DDDPase,1. DNA Polymerase (DNA聚合酶）,Catalytic Mechanism of DNA Pol (DNA聚合酶的作用机理),5,RNA引物,子链,3,5,模板链,在大肠杆菌中至少发现了五种DNA polymerase， 分别是DNA polymerase I、II、III、IV和V，其中Polymerase I发现最早（1956年），而polymerase IV和V直到1999年才发现。,DNA polymerases in E. coli,1959年Kornberg获得诺贝尔化学奖。,DNA polymerase I（pol I）,也称
11、Kornberg酶, 1956年Kornberg等在Ecoli中发现的第一个DNA聚合酶， Mr 103 Kd, 一条多肽链,一个锌原子（活性所必需）,每个E.Coli细胞内大约有400个分子的pol I。,（1）53聚合作用 （2）35核酸外切酶的活性 （3）53核酸外切酶的活性 （4）焦磷酸解作用 （5）焦磷酸基交换的作用 因此它属于一种多功能酶,功能：,（1）53聚合作用： DNA pol I 不能“从无到有”，只能从已有的多核苷酸链的3-OH端延长DNA链，也就是说必须要有Primer, primer多数情况下是RNA，少数情况下是DNA，Primer必须要有一个游离的3-OH。,模板
12、： 单链DNA（单链线状DNA、单链环状DNA） 局部变成了单链的双链DNA 有切口（nick）的双链DNA 有缺口（gap）的双链DNA 注意：完整的双链DNA不能作模板,单链线状DNA,单链环状DNA,B. 局部变成了单链 的双链DNA,C. 有切口（nick）的双链DNA,D.有缺口（gap）的双链DNA,A.单链DNA,用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶处理DNA pol I可以得到两个片段。,A. 大片段：第324928氨基酸残基组成，Mr68000， 具有聚合酶的活性和35核酸外切酶 的活性，这大片段称Klenow fragment。,B. 小片段：第1323个氨基酸残基组成，Mr 350
13、00， 具有53核酸外切酶的活性。,大片段：,35核酸外切酶主要功能校对。,53核酸外切酶的主要功能在DNA修复和切除引物中起作用。,小片段：,Pol II是由一条Mr为88Kd的多肽链组成，它的活性大约只有polI活性的5%，也要模板和带3OH 的引物，最好的模板是带短的gap的双链DNA，有53聚合酶和35核酸外切酶的活性，但没有53核酸外切酶的活性，主要用于DNA的修复。,1970年和1971年先后分离出pol II和pol III，,DNA Polymerase II（DNA pol II）：,是由多种蛋白质组成的复合物, Mr 高达900Kd。,每个Ecoli约含10分子DNA po
14、l III，虽然pol III的量很少，但活性很强，为pol I的15倍，模板和pol II大致相同，除聚合酶活性外，还具有35核酸外切酶的活性，但无53核酸外切酶的活性。 DNA pol III是原核细胞DNA复制的主要酶。它催化脱氧核苷酸的合成速率达到体内DNA的合成速率。这个酶的缺陷株往往是致死的。,DNA polymerase III (DNA pol III) ：,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,DNA polymerase IV和V（DNA pol IV和V）： 1999年才被发现，涉及DNA的
15、错误倾向修复，当DNA受到严重损伤时，即可诱导产生这两种酶，使修复缺乏准确性，因而出现高的突变率。,DNA polymerase IV和V（DNA pol IV和V）:,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的 错误倾向修复（errooune repair）,有DNA pol 、5种，除DNA pol r存在于线粒体内，其余均存在于细胞核中。它们的差别除了细胞定位外，主要在于动力学性质和对抑制剂的敏感性不同。其他性质基本上同E coli的聚合酶，也需要模板, 带3-OH的引物和4种脱氧核苷三磷酸，链的延伸方向为53。,DNA pol in Eukaryotes
16、(真核生物),哺乳动物DNA聚合物,Aphidicolin: 杀蚜虫毒素 Dideoxy NTPs N-Ethylmakimide:,真核和原核DNA细胞复制比较,2. DNA ligase (DNA 连接酶),连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,缺口,3,5,5,3,模板链,3,5,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,P,5,3,模板链,DNA 解螺旋酶，DNA解旋酶，DNA解链酶,目前已知E.Coli含有4种解螺
17、旋酶，即解螺旋酶I、II、III和Rep蛋白，其中Rep蛋白是E.Coli中最主要的解螺旋酶，每解开一个碱基对需水解2分子ATP。通过水解ATP打断互补双链间的氢键。,通过水解ATP获得能量, 使双螺旋DNA两条链分开。,3.使DNA双螺旋解开所需的酶或蛋白质,（1）DNA helicase,SS-B，单链结合蛋白功能：与解开双螺旋后的单链DNA结合，防止单链DNA重新形成双螺旋，另外防止单链DNA被核酸酶降解。,原核生物的SS-B与单链DNA的结合表现为 正协同效应，而真核生物的SS-B就没有这 种协同效应。,（2）Single-strand binding proteins,此酶首先在E.
18、Coli中发现，当时称-蛋白，后来在真核生物中也发现了类似活性的酶，真核生物中的这类酶名称各不相同，有称nicking-closing enzyme （切口开合酶，切口闭合酶等），untwisting enzyme（解缠酶）。,拓扑异构酶I，Top I,此酶的功能是切开超螺旋双链DNA中的一条链，链的切口末端就可转动，使DNA变成松驰状态，然后再将切口封闭，这酶作用时不消耗ATP。,（3）topoisomerase I,它的功能也是使超螺旋松驰。在消耗ATP的情况下，能将复制叉前方产生的正超螺旋变成负超螺旋。在无ATP时，可同时切开超螺旋的两条链，使DNA变成松驰状态，然后将切口封接好，克服解
19、链过程中在复制叉前方造成的“打结”现象。,拓扑异构酶II，Top II,此酶首先也是在E.Coli中发现，也称DNA gyrase （DNA旋转酶），,（4）topoisomerase II,Top I和Top II使超螺旋松驰机制的相似处和不同处。,4. telomerase（端粒酶）,DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后
20、的线形DNA分子的末端保持不变。,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,5,3,AAAACCCCAAAACCC,C,C,C,A,端粒酶,Telomere（端粒）：指真核细胞线状染色体末端的 DNA序列。 Telomerase（端粒酶）：由RNA和蛋白质组成的一个 复合物，以端粒酶中的RNA （有特殊的序列）为模板，通 过反转录合成端粒DNA。,A,端粒合成的一种模型,3,5,TTTTGGGGTTTTG,5,3,AAAACCCCAAAACC
21、C,C,C,C,AA,3,5,TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG,5,3,AAAACCCCAAAACCC,C,C,C,A,AA,T,TGGG,TGGG,T,3,5,AA TTTTG,5,3,AAAACCCCAAAACCC,C,C,C,A,GTTTTG,整合和杂交,移位和再杂交,原核生物：1个起点（origin of replication， 复制起点，复制原点）。,复制起点核苷酸序列的特征: （1）碱基序列高度保守。 （2）富含AT，有利于DNA的解链。,方向: 大多为双向复制。,（三）DNA的复制过程,1. DNA复制的起点和方向,E.Coli染色体DNA复制: 复制时有一个复制起点
22、，双向展开，形成状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称复制。,复制子: 受同一个复制起始区控制的DNA被称为复制子（replicon），它是复制的功能单位。 原核细胞DNA复制只有一个复制起始区，因此它只有一个复制子。通常细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的。 真核生物有很多复制起点，复制方向也是双向。真核细胞的细胞核DNA复制有多个复制起始区，因此它包含多个复制子。,起点,起点,在复制的起始点处，DNA双链部分解开为单链，形成叉子形状称复制叉（replication fork）。,大多数生物DNA的复制是双向的，但也有例外，如滚环式复制（rolling circle
23、replication）。,semi-discontinuous replication,2. DNA的半不连续复制,所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是53。1968年日本学者Okazaki冈崎提出了DNA的不连续复制模型，他认为35走向的DNA链的合成是不连续的，是由许多53方向合成的DNA片段连接起来的，这些不连续的DNA片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）。原核细胞冈崎片段的长度为10002000个核苷酸，相当于1个顺反子（cistron）的大小，即基因的大小；真核生物冈崎片段的长度为100200个核苷酸，相当于1个核小体DNA的大小。 35走向的DNA链是不连续的，另
24、一条链根据最近的实验，认为53走向的DNA链是连续的，因此称semidis continuous replication。,在DNA复制时，以35方向为模板合成的一条新链是连续的, 称前导链（leading strand），它的延伸方向与复制叉的移动方向相同。另一条新链的合成是不连续的，由许多53方向的冈崎片段组成，这条新链称后随链（lagging strand），它的延伸方向与复制叉的移动方向相反。,DNA聚合酶不能“从无到有”地合成多核苷酸链，只能从已有的多核苷酸链上延长，这个已有的多核苷酸链就是引物，所以DNA的合成必须要有引物，体内的引物多数情况下是RNA，但也可利用体内原有的DNA片
25、段。,RNA引物是以单链DNA为模板，沿53方向合成小分子RNA引物，在大肠杆菌中RNA引物（RNA primer）由引发酶（primase）催化，引物的长度160个核苷酸（引物的长度取决于物种）。,3. DNA的合成需要以RNA为引物,合成RNA引物的过程称引发，引发是一个十分复杂的过程。,Preprimosome预引发体或称前引发体,primosome引发体,priming引发,4.引发,（a）大约20个DnaA蛋白各带1个ATP结合到4个9bp的重复序列上，DNA缠绕在上面，形成起始复合物（initial complex）。,（b）HU蛋白是类组蛋白，可与DNA结合，促进起始，受其影响，
26、邻近的三个13bp重复序列被变性成开链复合物（open complex），即解链而形成小段单链，所需能量有ATP供给。,（c）DnaB（解链酶）在Dnac的帮助下结合于解链区，DnaB借助水解ATP产生的能量，沿DNA链53方向移动，解开DNA的双链，此时称为prepriming complex，i.e.preprimosome，再与引发酶（primase）组装成引发体（primosome），才能起引发作用。,DNA复制时，DNA双螺旋的解开靠helicase（解螺旋酶）、SS-B 、 Top II（i.e DNA gyrase), RNA引物合成后，DNA pol III与复制叉结合，形成复
27、制体（replisome）的结构，而启动DNA的合成。 replisome：为大的多分子复合物，由DNA pol III以及其他酶和蛋白质组成，组装于细菌染色体的复制叉，并在DNA复制中完成各种各样的反应。,5. DNA复制叉的结构和链的延长,复制起点解开后形成2个复制叉，进行双向复制，前导链和后随链的合成都需要RNA引物，前导链先由引发酶在起点处合成一段RNA引物，随后DNA pol III即在引物上加脱氧核苷酸。前导链的合成与复制叉的移动保持同步。,后随链的合成是分段进行的，需要不断合成冈崎片段的RNA引物，然后由DNA pol III加入脱氧核苷酸。,后随链的合成比较复杂，由于DNA的两
28、条互补链方向相反，为使后随链能与前导链被同一个DNA pol III不对称二聚体所合成，后随链必须绕成一个环状（loop）。,合成冈崎片段不断与模板脱开，然后在新的位置又与模板结合,（1）除去引物：DNA pol I，有53核酸外切酶的活性，可把RNA引 物除去， 所出现的缺口（gap）由 DNA pol I按模板要求将缺口填满。,（2）DNA连接酶将相邻的两个核苷酸的 磷酸二酯键连接起来成大分子DNA，再形成一定的空间结构。,6链的终止,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制的起始,DNA链的延长,DNA链的终止,复制叉的 移动方向,解旋酶,解链酶,引物体,SSB,3,5,3,5,DNA
29、的双向和单向复制,环状DNA复制时 所形成的Q结构,起始点,复制叉 的推进,复制叉,起始点,起始点,起始点,复制叉,未复制DNA,单向复制,双向复制,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,GATCTNTTNTTT,成串排列的 三个13bp序列,共有序列,共有序列,TTATCCACA,DnaA蛋白结合位点 四个9bp序列,DnaA,DnaB (解螺旋酶),SSB,大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型,返回,聚合酶III 核心酶,大肠杆菌复制体结构示意图,聚合酶I,聚合酶III 核心酶,滞后链,前导链,解螺旋酶,引物合成酶,RNA引物,引发体,拓扑异构酶II,-夹子,-聚体,-夹子, -复合物
30、,RNA引物,单链结合蛋白 （SSB）,返回,大肠杆菌染色体复制的终止,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶,连锁染色体,返回,真核生物与原核生物的DNA复制大体相同，但有差异。,（1）原核生物每时每刻都在复制，而真核生物DNA的复制 在细胞周期的S期。,（2）原核生物DNA的复制只有1个复制起始点，而真核生 物DNA的复制有许多复制起始点。,（3）原核生物与真核生物DNA复制的酶不同，切除引物的酶 亦不同。,（4）真核生物的DNA与组蛋白组装成核小体。,（5）端粒和端粒酶：真核生物染色体DNA是双链线状，由于 DNA合成需要RNA作引
31、物，引物除去后，5端留下一 段无法填补的空缺，这样DNA复制后就会愈来愈短，而 生物体有端粒酶来解决这个问题。,DNA的复制是高度忠实的，出现差错的机会很小，出错的几率在10-810-10之间，即每复制1081010bp才出现1次错误。主要有5种机制使DNA复制的错误率降到很低。,2. DNA聚合酶的两步反应机制。 3. DNA聚合酶具有自我校对能力，可及时切除错配的碱基。 4. 错配修复。 5. RNA引物。,1. 通过核苷酸合成的调节机制保持细胞内4种脱 氧核苷三磷酸浓度的平衡。,二、DNA复制的高度忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现
32、一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:, DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配 对原则，但错配率为7 10-6 ）, DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5外切酶切除）, 起始时以RNA作为引物,DNA聚合酶的校对功能,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,起始时以RNA作为引物的作用,DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否
33、正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。,三、 DNA的突变,二、诱变剂的作用 碱基类似物 (base analog) 碱基修饰剂 (base modifier) 嵌入染料 (
34、intercalation dye) 紫外线 (ultraviolet) 和电离辐射 (ionizing radiation),一、突变的类型 碱基对的置换 (substitution) 移码突变 (framesshift mutation),DNA突变的类型,-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-,转换,野生型基因,-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-,-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-,颠换,碱基对的置换 (substitutio
35、n),移码突变 (framesshift mutation),-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-,插入,-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-,缺失,A,T,DNA复制的速度很快，每分子酶每分钟合成约1000个核苷酸片段。E.Coli 5106bp, 30min; human 3109bp, 8h。另外生物体生长的环境中种种物理和化学因素可作用于DNA，引起DNA结构的改变，使DNA受到损伤（damage），生物体有修复系统可使受损伤的DNA得到修复。,四、DNA的修复,（1）光复活作用
36、（photoreactivation）,光复活酶（photoreactivating enzyme）,1. 损伤：,形成嘧啶二聚体,2. 形成酶DNA复合物：,光复合酶结合于损伤部位,3. 酶被可见光所激活,4. 修复后释放酶,（2）切除修复（excision repair）,（3） 重组修复（recombination repair）,错配修复实际上是一种特殊的核苷酸切除修复，它专门用来修复在DNA复制中出现的新合成DNA链上的错配的碱基。但如何避免将DNA链上正确的碱基切除呢？这就需要将old strand 和new strand区分开来。,（4）错配修复（mismatch repair）
37、,原核生物利用甲基化区分old strand 和new strand，因此原核细胞中的错配修复也称甲基化指导的错配修复（methyl-directed mismatch repair）。原核细胞DNA的甲基化位点位于5GATC序列中腺嘌呤碱基的6位N原子上，催化甲基化的酶为Dam甲基化酶（Dam methylase），刚合成的DNA新链上的GATC序列还没有来得及甲基化，而作为模板的old strand早已被甲基化了，利用这种差别区分old strand 和 new strand。,一旦发现错配碱基，即将未甲基化的链切除，并以甲基化的链为模板进行修复合成。,错配修复是一个非常耗能的过程。错配的
38、碱基距离GATC序列越远，被切除的核苷酸就越多，重新合成新链所需要消耗的脱氧核苷三磷酸单体就越多。无论消耗多少dNTPs，目的都是为了修复一个错配的碱基，这说明机体为了维护遗传物质的稳定性可以说不惜一切代价。,真核生物DNA错配修复机制与原核生物大致相同，但区分old strand和new strand的机制不同，详细的机理还不十分清楚。,(5). SOS修复（SOS repair）：,SOS比喻细胞处于危险状态，是细胞DNA合成受到阻断或DNA受损伤时诱导产生的一种错误倾向修复。在DNA合成受阻或DNA受损伤时诱导出一种新的DNA聚合酶，这种新的DNA聚合酶能通过DNA损伤部位而进行复制，但
39、复制的精确度很低。校对功能很差，因而容易出现复制的差错，从而导致高的突变率。,SOS反应的机制,（40个不同的位点被阻遏）,RecA(辅蛋白酶),未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA蛋白质部分阻遏,LexA(阻遏物),靶基因表达,lexA靶基因表达 但产物被分解,recA大量表达,RecA促使分解LexA,诱导的细胞,（逆转录，reverse transcription）,1970年有人从致癌RNA病毒中发现了依 赖于RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase RDDPme）or称RNA指导的DNA聚 合酶（RN
40、A-directed DNA polymerase）, 即反转录酶（reverse transcriptase,RT）, 能以RNA为模板合成DNA。,DNA,转录,反转录,RNA,五、反转录,后来在胚胎细胞和正常细胞中也分离得到了这种酶，反转录酶的发现使中心法则更完善。,复制,DNA,转录,反转录,RNA,翻译,蛋白质,反转录酶催化的反应:,反转录现象发现的生物学意义,六、DNA的遗传重组,DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(genetic recombination)，或者基因重排(gene rearrangement )。重组产物称为重组体DNA(recombina
41、nt DNA)。 重组的意义在于，它能迅速地增加群体的遗传多样性；使有利的突变与不利突变分开；通过优化组合积累有意义的遗传信息。此外，重组还参与了许多重要的生物学过程，它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受基因重组的调节，生物发育过程也受到基因加工的控制。,(一) 同源重组（homologous recombination ） (二) 特异位点重组（site-specific recombination） (三) 转座重组（transpositional recombination）,一、DNA指导的RNA合成（转录） 二、RNA转录后的加工 三、RNA指导下RNA的合成（
42、RNA的复制） 四、RNA生物合成的抑制剂,主要内容,第三节 RNA的生物合成,（1）DNA指导下RNA的生物合成，即转录。 （2）RNA的复制。,RNA的生物合成有两条途径：,转录的概念和DNA的有义链和反义链,转录是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照硷基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。RNA的转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止。此转录区域为一个转录单位。,启动子 （promoter),终止子(terminator),模板链（templatte strand） 反意义链 (antisense strand),有意义链 (se
43、nse strand),非信息区,DNA,5,5,3,3,非信息区,转录是遗传信息从DNA转移到RNA的过程。,转录过程的发现是由于发现了DNA directed/dependent RNA polymerase(DDRPase)，简称RNA聚合酶或称转录酶,一、转录（transcription）：,n1ATP + n2GTP + n3CTP + n4UTP,DNA指导的RNA聚合酶,DNA（模版），Mg2+,RNA + (n1+n2+n3+n4) PPi,模板：DNA 引物：不需要 底物：4种NTP 合成方向：53 辅助因子：Mg2+ or Mn2+（促进聚合反应）,RNA聚合酶的反应（分子
44、式）,RNA聚合酶的反应（线条式）,RNA聚合酶的反应（结构式）,RNA聚合酶与DNA聚合酶的异同,E.Coli RNA聚合酶,全酶: 2 核心酶：2,+,（一）RNA聚合酶,E.coli RNA聚合酶各亚基的大小与功能,大肠杆菌RNA聚合酶,E.Coli RNA Polymerase Holoenzyme,promoter,DNA,原核生物RNA聚合酶可以被利福霉素（rifamycin）和利链霉素(streptolydigin)抑制,真核生物RNA聚合酶根据它们对-鹅膏蕈碱（- amanitin）的敏感性不同分为RNA聚合酶I（A）、II（B）、III（C）。,真核生物RNA聚合酶对-鹅膏蕈
45、碱敏感性,真核生物RNA聚合酶的类型,噬菌体T3和T7的RNA聚合酶,仅为一条分子量11KD的多肽链，这些聚合酶 只需要识别噬菌体DNA的少数启动子，并无 选择地与其作用，37时的聚合速度200nt/秒。,（1）模板 : 体内DNA中的一条链被转录，体外DNA 的两条链都能被转录。,模板链（template strand）,编码链（coding strand）,并非整个DNA分子的信息都被转录成一个RNA，而是某些基因以DNA的这一条链作为模板，而另一些基因以DNA的另外一条链作为模板。,（二）原核生物转录的过程 1. 转录的一般原则：,（4）第一个被转录的核苷酸通常是嘌呤核苷酸（约为 90%
46、），其中以鸟嘌呤核苷酸最为常见。,（2）转录过程中需要模板，需要解链，但不需要引物 。,（3）以4种核苷三磷酸为底物，并需要Mg2+激活。,（5）转录的方向的53，这与DNA的复制完全一致。,（6）转录具有高度的忠实性。,（7）转录受严格调控。,DNA的转录过程：起始、延长和终止。,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,终止子(terminator),启动子（promoter),RNA聚合酶,启动子是指RNA聚合酶识别，结合并开始转录的一段DNA序列，它包括4个区域： 转录的起始点， -10区（pribnow box，富含AT，其一致
47、序列为TATAAT） -35区 一致序列为TTGACA， -10与-35之间的序列。,原核生物的RNA聚合酶能直接识别启动子，并与启动子结合，从而启动基因转录,2. 转录的起始 （1）启动子（promoter）,转录起始点（start point）为+1，位于它上游的序列为负数，位于它下游的序列为正数，没有零。,（2）RNA聚合酶对启动子的识别、结合和起始复合物的形成,RNA合成不需要引物，按照DNA中一条链的碱基序列选择1st and 2nd 核苷三磷酸，合成第一个磷酸二酯键，RNA链上参入的第一个核苷酸通常是嘌呤，因此新生RNA的5端通常是pppA or pppG。,转录起始后，因子就从起始复合物中解离。,因子释放后，进入链的延长阶段，核心酶 的移动方向沿DNA 的35方向,3.链的延长,RNA 链 的 延 伸,3,5,RNA-DNA杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生RNA,复链,解链,编码链,模板链,
