1、2.4.7 测定米糠解脂酶的相对分子量本实验采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定米糠解脂酶的相对分子量 14。购买标准 Marker 蛋白做标准曲线,标准蛋白分子量范围为 14.4 kD97.4 kD。2.3.7.1 试剂准备:i. 30%丙烯酰胺贮存液:29 g 丙烯酰胺和 1 g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于 100 mL 热水中,验证其 pH 值不大于 7.0。置棕色瓶中,4保存。ii. 1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)溶液iii. 10% SDS 溶液:10%(W/V) ,4保存,用时加热溶解iv. 10%过硫酸铵:称取 AP1 g,加重整水定容到 10 mL,现用现
2、配v. TEMED 溶液:1%(V/V),4保存vi. 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)溶液vii. Marker 标准蛋白样品缓冲液:0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液 2.0 mL甘油(丙三醇) 2.0 mL20%( W/V)SDS 2.0 mL0.1%(W/V)溴酚蓝 0.5 mL-巯基乙醇 1.0 mL重蒸水 2.5 mLviii. 待测样品缓冲液:0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液 1.0 mL甘油(丙三醇) 1.6 mL10%( W/V)SDS 1.6 mL-巯基乙醇, 0.4 mL0.05%( W/V)溴酚蓝 0.4 m
3、Lix. 电极缓冲液(5):称取 45.0g Tris,216.0g 甘氨酸和 15.0 gSDS 用重整水定容到 3 L,4 保存,使用前 37加热。x. 固定液:冰乙酸甲醇 水=1 27xi. 考马斯亮蓝 R 染色液:每 100 mL 甲醇、水、冰乙酸混合物(992)中,溶解 0.25 g 考马斯亮蓝 R,过滤除去未溶物。xii. 脱色液:甲醇水 冰乙酸 =9922.3.7.2 操作步骤如下:1、准备步骤1)将凝胶板依次用水、无水乙醇洗涤干净,然后使其自然风干或烘干。2)试样格(梳子)临用前用无水乙醇擦拭,让其挥发至干。3)灭菌枪头、eppendorf 管。2、制备凝胶1)安装玻璃板、板条
4、,并将玻璃板固定在电泳槽中,以 5%琼脂封底。2)配制 12%的分离胶(10 mL): 依次将 4.0 mL30%丙烯酰胺贮存液,3.35 mL 双蒸水,2.5 mL1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)溶液,0.1 mL 10% SDS 溶液,50 L10% 过硫酸铵, 5 LTEMED 混合,一定要搅拌均匀。3)灌胶:迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶,直至剩余的板宽比梳子长度多 1 cm。用移液枪小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。4)在分离胶聚合的过程(约 40 min)中,配制 4%的浓缩胶(5 mL):依次混合 3.05 mL 双蒸水,650l 30%丙烯酰胺贮存液,1.25 mL
5、0.5 mol/L Tris-HCl( pH6.8)溶液,50 L10% SDS 溶液,25 L 10%过硫酸铵,5 L TEMED(TEMED 应在灌胶前才加入) 。5)分离胶聚合完全后,倒去正丁醇,用蒸馏水冲洗胶面数次,用滤纸吸干胶面上的残余水。灌注积层胶,立即插入干净的梳子,避免产生气泡。6)积层胶聚合完全后,小心拔出梳子,用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次,以除去未聚合的丙烯酰胺。3、样品的制备在标准蛋白溶液中加入等体积的 2样品溶解液,使蛋白的终浓度为 3-4 mg/mL,混合液在沸水浴中加热 3 分钟,冷却后即可上样。待测蛋白按 1 体积待测蛋白溶液加 3 体积样品缓冲液,混合后
6、在沸水浴中加热 3 分钟,冷却后上样。4、上样用微量进样器上样,上样量为 15 L 左右。每加入一种样品,应在双蒸水和电极缓冲液中洗涤加样器数次。5、电泳向电泳槽内加入适量电极缓冲液,使内槽电极缓冲液没过短玻璃板 5 mm,外槽液面较内槽低约 10 mm 打开电源,初始电流为 10 mA(电压为 40 V);当染料进入分离胶(这段时间约为 2 h)后,将电流提高到 20 mA(电压为 80 V),继续电泳直至染料到达离凝胶底部 0.5 cm 处。6、后处理1)固定:从电泳装置上卸下玻璃板,用镊子小心撬开玻璃板,除去积层胶部分,将分离胶移入固定液(固定液的量至少为胶体积的 5 倍)中固定,直至染料由蓝绿色变为黄色。2)染色:除去固定液,加入染色液(用量同上) ,摇床缓慢振荡染色 1 h。3)脱色:将凝胶板浸泡于脱色液中,至背景脱至无色,其间需更换脱色液34 次。7、观察记录结果、绘制 Marker 蛋白标准曲线,并对凝胶进行扫描照相。