1、一、组织培养的基本概念Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。体外培养 In VitroTissue cultureCell cultureOrgan culture细胞培养目的与用途1、科学研究：药物研究开发与基础研究(1) 新药筛选：(2) 疫苗研究与开发： (3) 基因工程药物研究与开发： (4) 细胞工程药物研究与开发： (5) 单克隆抗体制备： (6) 药物作用机理(6) 基因功能(7) 疾病发生机理2、 生物制药(1) 疫苗生产： (2) 基因工程药物生产： (3) 诊断用和药用单
2、克隆抗体生产(4) 细胞工程药物生产：对组织培养的评价优点：1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。2、便于用各种不同技术方法研究细胞。3、培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，广泛用于分子生物学和基因工程研究。4、同时提供大量的生物学性状相似的实验对象。不足：利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞一样。组织培养的发展简史1、早期组织培养: Roux（1885） 用温 NS 培养鸡胚。Jolly(1903)用盖片悬滴法培养蝾螈白细胞。Beebe and Ewing(1906)培养狗淋巴细胞。2、现代组织培养：Harrison(1907) and Carrel(1912)开始， Harri
3、son 培养蛙胚神经组织。 Carrel 培养了鸡胚心肌组织。3 从 50 年代起，组织培养技术快速发展。试管培养 组织培养细胞生物学一、体内外细胞的差异 “反祖” （Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。二、培养细胞的分化1、不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。 （培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）2、脱分化或去分化（Dedifferentiation): 细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉储存肝糖原能力）培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。细
4、胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子。培养细胞的形态分类分为贴附型和悬浮型两大类（一）贴附型 1、成纤维型细胞：心肌细胞、平滑肌、血管内皮细胞等2、上皮型细胞 3、游走型细胞4、多形型细胞培养细胞的生长和增殖过程（一）组织培养细胞生命期：原代培养期传代期 衰退期原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。细胞系（cell line) ：初代培养细胞一经传代后，称
5、做细胞系。无限细胞系： 细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.（二）组织培养细胞一代生存期1、潜伏期（Latent phase) :细胞从悬浮状态贴附于底物表面上。原代培养细胞贴附慢 （10-24 h） 。连续细胞系贴附快（10-30 min) 。细胞贴附受多种因素影响（1）支持物：底物表面要清洁， 底物表面有阳性电荷有利于细胞贴壁。（2）一些特殊物质的存在：血清2 指数增生
6、期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续 3-5 天。细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数 .3、停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖。培养细胞生存环境、条件和代谢一、无污染环境二、温度：三、气体环境和 pH四、培养细胞生存所需基本物质1、糖 2、氨基酸 3、各种维生素4、促生长因子* ：血清*5、其他物质 五、渗透压培养基*合成培养基（Synthetic Medium)天然培养基（Natural Medium)血清，以牛血清和马血清为最常用。血清内含有多种促细胞生长因子
7、，促贴壁因子及其它活性物质等。一般需加 10%-20%。附着底物：1、玻璃2、一次性聚氯乙烯材料3、饲细胞（Feeder cell)用成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢功能。将特殊难培养的细胞接种于其上。体外培养细胞成功率分析成功的关键:培养物必须贴附在底物上细胞生长和增殖一、组织和细胞的供体年龄二、培养条件三、贴附底物四、培养方法：酶消化分离组织培养设施和基本条件实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新
8、，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌。操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。常用设施及设备（1）超净工作台：。（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。培养器皿常用的器皿有下面几种。（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml
9、、250ml、100ml。（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径 30mm、60mm 、120mm（4）培养板培养用液平衡盐溶液（Balanced Salt Solution,BSS)天然培养基(Natural Medium)合成培养基(Synthetic Medium)Hanks 平衡盐溶液（ Hanks Balanced Salt Solutions， HBSS）成分 含量（g/L）CaCl2 (无水氯化钙) 0.14KCl 0.40KH2PO4 0.06MgC
10、l26H2O 0.10MgSO47H2O 0.10NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01钙镁有促使细胞凝聚作用,配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用 D-Hanks 天然培养基血清 细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清热灭活是指 56, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血
11、清的质量合成培养基一、种类RPMI1640：适用于很多细胞的生长，特别是血液细胞。DMEM（Dulbecco minimum essential medium) (高糖和低糖）低糖对肿瘤细胞有力。HamF12 和 Mc-Coy5A 多用于难培养的细胞。合成培养基的成分：1、氨基酸 2、碳水化合物 3、维生素 4、无机离子 5 其它成分：在杂交瘤技术中，常在 DMEM 培养基中加入 2-巯基乙醇（2-Me). 2-Me 对细胞的生长有非常重要的作用，能诱导细胞增殖。常配成 0.1M 储存液，用时每升培养液加0.5ml.培养液的配制1、玻璃三蒸馏水2、把干粉加入温（15-30 度）水中，搅拌使其溶
12、解；3、加 NaHCO3;4、加水至终量5、用 0.22 mm 微孔滤膜滤过消毒。其它常用液消化液：分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液。可以单独使用，也可以混合使用。1）胰蛋白酶溶液胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰酶溶液在 pH8.0，温度为 37时，作用能力最强。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因
13、此，胰酶溶液常用无 Ca2+、Mg2+的 D-Hanks 平衡盐溶液配制成 0.25%溶液。胰蛋白酶溶液配制：（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许 D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状，然后再补足 D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；（2）次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为 0.25% 或 0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调 pH 至 7.2 左右。保存条件：-20冰箱中，以免分解失效。EDTA4Na 溶液EDTA 是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离觧作用，而且
14、毒性小。常用工作液浓度为 0.02%。通常与 0.25%的胰蛋白酶溶液按 1：1 混合使用（混合液） 。注意：使用 EDTA 处理细胞后，一定要用 Hanks 液冲洗干净，因残留的 EDTA 会影响细胞生长。EDTA 溶液配制：用无钙、镁的 D-HBSS 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，室温或 4冰箱保存。胰蛋白酶EDTA4Na 溶液（0.05%胰蛋白酶, 0.53mM EDTA4Na）0.5g 胰蛋白酶0.2gEDTA4Na1L D-HBSS。-20 冰箱中保存。pH 调整液（1）NaHCO3 溶液常用浓度为 7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌，分装，4冰箱或室温保存。当
15、pH 值超过后，可用高压灭菌的 10醋酸溶液或通入 CO2 气体方法调节。（2）HEPES（分子量 238.31）溶液HEPES 使用终浓度一般为 10-50 mM, 但通常配成 1M 储存液：用 200ml 双蒸水溶解 47.6克 HEPES，用 1N NaOH 调节 pH 至 7.5-8.0;然后过滤除菌，分装小瓶，室温或 4保存。抗生素溶液：青霉素 100 单位/ml 培养液链霉素 100 mg /ml 培养液玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤（1）浸泡：需先用清水浸泡。然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白
16、质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于 6 小时。清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g） 浓硫酸（ml） 蒸馏水（ml） （A）强清洁液 631000 200000 （B）次强清洗液 12020
17、0 1000 （C）弱清洁液 100100100 。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发。清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸后都必须用水充分冲洗。胶塞的清洗细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用 2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用 1%稀盐酸浸泡 30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸 10-20 分钟，晾干
18、备用。塑料制品的清洗必要时用 2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用 5%盐酸溶液浸泡 30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。消毒消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等） ，化学灭菌法（各种化学消毒剂）和抗生素。（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过 2.5 米，且消毒物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，
19、保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。常用物品消毒压力及时间：培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121, 15 磅, 20 分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先 121, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；。（3）干热消毒：玻璃瓶，干热灭菌 170, 4 小时（4）滤过消毒：（4）化学消毒法：最常见的是 70%酒精及 1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒
20、。基本培养技术一、培养操作基本要领和要求1、无菌操作2、培养前准备（1）操作野消毒（2）洗手和着装（3）火焰消毒3、培养操作基本培养操作技术（一）取材（二）组织的分离1、离心分离法：培养物为血液、腹水、羊水等可采用离心分离法在分离淋巴细胞进行培养时可采用分层液进行分离。2、机械分离法（1）切割分离法（2）机械分散法*3 消化分离法（1）胰蛋白酶消化法浓度 0.01-0.5% 常用 0.25%, 37C 消化.(2)胶原酶消化法适用于消化纤维组织、上皮组织以及癌组织等，不受钙镁离子的影响，终浓度常为 0.1-0.3mg/ml.(3) EDTA 消化法(三) 细胞计数法(四)细胞的冻存冷冻保存要点
21、：（1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在 4冰箱中放置 3060 分钟；然后转入-20，放置 30 分钟；然后再转入-80 放置 1618 小时（或过夜） ；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到 -3速度降温，一直到-80以下，然后直接放入液氮中长期保存。（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于 90，无微生物污染。（3）细胞浓度控制在：11075107/ml。（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于 20。（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是
22、DMSO(二甲基亚砜) ，使用终浓度为 5 10。但是，有些细胞系不能用DMSO 作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系 HL-60。因为， DMSO 能诱导 HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。特别注意：（1）细胞在冷冻过程中在-20冰箱内放置时间不可超过 1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20这一步骤直接放入-80 冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。（2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。（3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的 DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶
23、后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4保存。避免反复冻融造成 DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤 DMSO，必须选用耐 DMSO 的尼龙滤膜。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻剂，基础培养液，血清或蛋白。常用细胞冷冻保存液：（1）10DMSO 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）（2）10甘油 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）操作程序(1)细胞: 选对数生长期的细胞(2) 计数: 细胞密度 5 106/ml(3) 冻存液 培养液 9 份+DMSO1 份 加入细胞内(4) 分装: 每安瓶 1.5ml.(5)封口(6)冻存细胞解冻与复苏冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快
24、速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在 1 分钟内全部融化（不要超过 3 分钟） 。（2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到 2530ml 新鲜完全培养液中） ，24 小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液，以去除 DMSO。如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。特别注意：（1）解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。 ，要带手套，
25、用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入 37水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。（2）冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。解冻冷冻保存细胞的离心方法:(1)从液氮中取出冻存的细胞，立即放入 37水浴中快速解冻。（2）将 12ml 冻存细胞液加入到 25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。（3）用 1000 转 离心 23 分钟，弃上清液。（4）用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。（5）接种细胞到培养瓶中，起始密度为 3105/ml。常规的培养法原代培养法仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至 37） ，培养瓶或培养板、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管
26、、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37）材料：胎鼠或新生鼠试剂：DMEM 培养基（含 20%小牛血清） ，0.25%胰酶，Hanks 液，碘酒操作步骤（一）胰酶消化法1、将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 23 秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用 Hanks 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2） ，再用 Hanks 液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入 56 倍的 0.25%胰酶液，37中消化 2040 分钟，
27、每隔 5 分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离 5、加入 35ml 培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂） 。6、静置 510 分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离心 10 分钟，弃上清液。8、加入 Hanks 液 5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入培养液 l2 ml（视细胞量） ，血球计数板计数。10、将细胞调整到 5105/ml 左右，转移至 25ml 细胞培养瓶中，37下培养。注意事项1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3、凡在
28、超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。五、无菌操作的几个注意事项1、操作前要洗手，进入超净台后手要用 75%酒精或 0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。无菌操作的几个注意事项1、操作前要洗手，进入超净台后手要用 75%酒精或 0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2、点
29、燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。传代培养法细胞生长增殖形成单层后进行传代1、吸除培养瓶内旧培养液2、加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液，以能覆盖平底为限。3、显微镜下观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大，立即终止消化4 吸出消化液，加入 Hanks 液 吹打5 计数细胞传代时注意事项1、把握好传代时机，在 80%-90%汇合阶段最好2、消化时
30、间要适度3、消化液浓度要适宜细胞培养的污染、检测和排除污染途径1、空气2、清洗消毒3、操作4、血清5、组织污染对细胞的影响一、真菌污染二、细菌污染三、支原体污染微生物污染的排除一、抗生素除菌法二、加温除菌法（除支原体）三、动物体内接种除菌法四、巨噬细胞吞噬法正常细胞和组织的培养一、上皮细胞培养上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原
31、的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低 PH、Ca2+ 含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。 表皮细胞培养1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.51 平方厘米小块。2、置 0.02%EDTA 中，室温， 5 分钟。3、换入 0.25%胰蛋白酶中， 4过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置 0.25%胰酶中，37，3060 分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用 80 目不锈钢
32、纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle 加 20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2 温箱培养。二、内皮细胞培养1、产后新鲜脐带，无菌剪取 1015 厘米长一段，如不能立即培养，可于 12 小时内保存于4。2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为 0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化 310 分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温 PBS 轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复） 。5、离心去上清，
33、加入 RPMI1640 培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。神经胶质细胞培养神经细胞（神经元不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置 Hanks 液中漂洗一、二次。2、置于 3050 倍体积
34、的 Hanks 液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立 510 分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数并调整细胞密度。 5、接入培养瓶或皿中，置 5%CO2 温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以 0.25%胰酶消化处理。肌组织培养（）骨骼肌细胞培养1、出生 1 一 2 天的乳鼠，引颈处死。2、无菌取大腿肌组织，切成 0.
35、3 一 0.5cm2 小块后，用不含钙镁离子的 Hanks 液配的 0.25%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。3、计数调整细胞密度。4、快接种量 2106/皿入培养基培养。5、培养基内含 10%小牛血清，可加 1%的胎汁以促进分化。接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，细胞生长开始呈纺锤形，培养 5052 小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。巨噬细胞培养巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活 2
36、3 周，多用做原代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用， 1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml（勿注入肠内！） ，以刺流产生大量的巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入 70%乙醇中 35 秒。4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针头，把液体注入离心管。8、4下 250g 离心 10 分钟后，去上清，加 10ml DMEM 培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生 20 一 30106 细胞，其中 90%为巨噬细胞。10、以 3105 个贴附细胞/平方厘米接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用 DMEM 液冲洗1 一 2 次，再加新 DMEM 培养液置 CO2 温箱中。
