1、分离LB 液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将固体培养基倒入 4 个灭菌后的培养皿中，制备平面培养基在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养 12h灭菌倒平板培养划线分离平板划线法培养皿倒置，37恒温培养 1224 小时划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。（一）制备 LB 培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨 10.0 克，牛肉膏 5.0g，氯化钠 10.0 克，水 1000ml（配固体培养基再加琼脂 20 克）2、流程计算称量 溶解 调 pH 分装 加塞，包扎 灭菌 倒平板培养基配制(特)培养基应现配现用，每次配置 350ml，一次性使用完
2、毕。1、 按下表称取物资配置 LB 培养基到 500ml 锥形瓶中：例如：配制 350mlLB 培养基配方如下：配置双份成分名称蛋白胨TRYPTONE氯化钠酵母提取物YEAST XTRACT去离子水称取质量 3.5g 3.5g 1.75g 补足 350ml2、 用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。待灭菌。分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用_三角漏斗 _。加塞：试管用塑料盖或_棉花塞_；三角瓶口用_ 封口膜_或_ 6 层纱布封口,再用_牛皮纸_或报纸封口。包扎：用_牛皮纸 _或报纸灭菌：高压蒸气灭菌法 1）
3、加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _.2）装锅：物品放置的要求_整齐、稳定、留出空隙 ：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽_内。再以_两两对称 方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。4）保温保压：当锅内压力升到 1 _kg/cm2 时，控制热源，维持压力至15 _min。 5）出锅： 切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至 _0_时，打开_排气阀_，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造
4、成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。灭菌后，通常将实验用具放入 6080 _ 烘箱 中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。倒平板、制斜面操作平台：超净台灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开_紫外线 _和_过滤风，灭菌 30min.倒平板：待培养基冷却至_60_ 时，将每只培养皿倒入_1012_ml 未凝固的固体培养基，置于_水平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。_倒置_备用。制斜面：将未凝固的固体培养基的试管 斜 放，冷却待凝使即成为斜面。思考题：一、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过
5、滤风，灭菌 30 分钟。2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。二、培养基灭菌后，需要冷却到 60 后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 三、为何要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。 四、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中
6、的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。五、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。（重点）液体培养基接种培养主要器具：接种环、摇床等操作方法：先将接种环进行 灼烧_ 灭菌, _冷却_后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。置于_ 37_摇床振荡培养小时。思考：如何冷却接种环？可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的目的。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结
7、束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。5、
8、如何判断接种操作是否符合无菌要求？如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。（五）斜面接种及菌种保存主要器具：接种环、恒温箱、冰箱操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取_单_菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在_斜面_ 上， _37_恒温培养箱中培养_ 24_小时后，_4 _ 冰箱保存。无菌操作：同前思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。 6、如何操作才可以尽量避免被杂菌
9、污染 ?(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如 PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜 37 度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30 度7、在培养后如何判断是否有杂菌污染 ?（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。8、实验完成后 ,接种过细菌的器皿应如何处理 ?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再
10、洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。实验一 大肠杆菌的培养和分离实验步骤：一 、配制 LB 培养基计算称量 溶解 调 pH 分装 加塞，包扎 灭菌二、倒平板、制斜面三、 大肠杆菌的培养 使所需细菌大量繁殖四 、大肠杆菌的分离 获得单菌落，纯化菌株平板划线分离法（或稀释涂布平板法）五、 斜面接种培养 目的菌株的纯培养和菌种保存大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌 取 2 个 250ml 的三角瓶中分别装入 50mlLB 液体培养基和 50mlLB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌 15min。封口膜：既通气又不使菌进入LB
11、液体培养基细菌的扩大培养LB 固体培养基细菌的划线分离（二）倒平板 灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入 4 个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到 60 左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.（三）大肠杆菌的扩大培养 将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在 37摇床培养 12 小时。注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原. 菌种扩增 摇床震荡培养 12h（于 LB 液体培养基中）
