1、开题报告,2006年10月1日,学科专业 儿科心脏病专业 学生姓名 孙胜涛 导师姓名 阳冠明 攻读学位 硕士研究生,前言,阿霉素（ADR）属蒽醌类抗生素，是一种高效、广谱抗肿瘤药物，临床常用于治疗多种肿瘤，然而其对心脏有毒性损伤作用。为此，研究和阐明ADR对心肌的毒性损伤机制以及寻找减轻ADR对心肌毒性的药物具有重要的意义。,题目,-胡萝卜素（-car）对ADR致大鼠心肌氧化应激的影响,研究目的,探讨ADR半醌自由基清除剂-car拮抗ADR致心肌抗氧化酶活性降低的机制，为临床应用ADR半醌自由基清除剂防治ADR对心肌的毒性损伤提供理论依据。,立题依据,1、ADR进入心肌细胞内代谢形成ADR半醌
2、自由基，这是ADR导致心肌细胞产生活性氧（O2-. 、H2O2、 .OH）增加的始动环节。ADR进入心肌内代谢形成ADR半醌自由基，其把电子传递给O2生成O2-.，同时伴有H2O2生成增加，O2-.与 H2O2通过 Haber-Weiss反应或Fenton反应产生.OH（1、2）,立题依据,2、Sazuka等人报道ADR导致心肌细胞的抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性降低，且与活性氧-脂质过氧化无关（3）。 3、SOD、GSH-Px是心肌的主要抗氧化酶，它们主要存在于心肌细胞，故心肌的SOD、GSH-Px活性变化可反映心肌细胞的SOD、GSH-Px活性变化。ADR导致的心肌的SOD、
3、GSH-Px的活性降低与其抑制SOD、GSH-Px的mRNA表达水平有关（4）。,立题依据,4、已经证实ADR导致心肌细胞产生活性氧 （O2-. 、 H2O2 、.OH ）增加，导致心肌细胞的氧化酶活性降低，使心肌细胞的抗氧化与氧化失衡，由活性氧引发心肌细胞的生物膜系统脂质过氧化是ADR导致心肌毒性损伤的重要机制（5、6 ）。 5、因此，清除ADR在心肌细胞内形成的ADR半醌自由基以及拮抗ADR导致的心肌细胞抗氧化酶活性降低亦即保护心肌细胞的抗氧化酶是防治ADR对心肌毒性损伤的关键。业已证实-car清除ADR半醌自由基，并可拮抗ADR导致心肌的SOD、GSH-Px活性降低（7）。,立题依据,6
4、、-car拮抗ADR导致心肌的SOD、GSH-Px活性降低的机制尚不清楚。本研究拟观察-car是否通过拮抗ADR所致心肌的SOD、GSH-Px的mRNA表达降低而拮抗ADR导致心肌的SOD、GSH-Px活性降低，且与维生素E（抗氧化剂）作对比，初步探讨ADR半醌自由基清除剂对心肌抗氧化酶的保护机制。这方面的研究尚未见文献报道。,研究方案-研究对象,1、研究对象：SD大鼠，由广西医科大学动物实验中心提供，,体重220-300g，清洁级。 2、样本含量：采用完全随机设计，分为5组，为了防止失访等因素，适当增加5%的数量，每组8只大鼠。,研究方案-研究指标的选择,1、抗氧化酶的活性测定 2、心肌的脂
5、质过氧化物（LPO）的产物丙二醛（MDA）含量的测定 3、抗氧化酶的mRNA表达水平的测定 4、心肌酶之一肌酸激酶同功酶（CK-MB）的测定,实验方法-药品及试剂,总RNA提取试剂盒及RT-PCR试剂盒为GIBCO公司产品，DNA Marker为宝生物工程（大连）有限公司（Takara）产品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其他试剂均为分子生物学专用试剂。,实验方法-药品及试剂,盐酸阿霉素（上海华联制药有限公司产品） ；-胡萝卜素（上海第六制药厂）；VitE（上海第九制约厂）；硫代巴比妥酸（TBA）：（德国Merck公司产品）；5,5-二硫对二硝基苯甲酸（DTNB）、邻苯三酚：美国S
6、igma公司产品；CK-MB测定试剂盒：日本第一化学药品株式会社产品。,实验方法-仪器,PCR仪、电泳仪、离心机、分光光度计、自动生化分析仪等仪器均为广西医科大学实验中心仪器。,实验方法-动物分组及处理,50只大鼠随机分为5组，每组为10只。 正常对照组：腹腔注射（ip）同体积的生理盐水，每日1次，共3次。 ADR组：ADR20mg.kg-1（ip）（8），共1次。 ADR+-car（）组：-car10mg.kg-1 (ip)(7)，每日1次，共3次。ADR的剂量及给药方法同ADR组。,实验方法-动物分组及处理,ADR+-car（）组：-car为30mg.kg-1(ip)(7)，每日1次，共3
7、次，ADR的剂量及给药方法同ADR组。 ADR+VitE组：VitE为300mg.kg-1(ip)(9)，每日1次，共3次，ADR的剂量及给药方法同ADR组。所有动物均 于实验的第4d处死（9）。,实验方法-生化测定,取心肌匀浆,做如下测定: 1、用TBA比色法测定MDA的含量（11） 2、用邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性（12） 3、用DTNB法测定GSH-Px的活性（13） 取大鼠血清，用酶的速率法测定心肌酶CK-MB的活性,实验方法-组织形态学观察,取心室游离壁，用10%的福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片，H.E染色，光镜观察。,实验方法-心肌抗氧化酶mRNA的测定,TrizolTM提
8、取大鼠心肌的RNA，紫外分光光度法测定RNA的含量和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。 取总的RNA1g 为逆转录模板，cDNA第一链合成按照SUPERSCRIPTTMRnase H- Reverse Transcriptase操作流程进行。第一链以OligodT为引物。,实验方法-心肌抗氧化酶的mRNA的测定,Cu-Zn-SOD基因、GSH-Px基因及内标三磷酸甘油醛脱氢酶（G3PDH）基因的扩增分别取第一次反应液1l为模板进行，PCR扩增程序：首轮945min，然后9430s，59 1min，72 30s，共35个循环，最后72 延伸，PCR产物琼脂糖电泳，UV检测、拍照；再以激光密度扫描
9、分析仪分析SOD（GSH-Px）G3PDH密度比值。,实验方法-抗氧化酶的mRNA的测定,各基因片段的引物序列如下(4)： Cu-Zn-SOD 5-TTCGAGCAGAAGGCAAGCGGTGAA-35-AATCCCAATCACACCACAAGCCAA-3 GSH-Px 5-CAGTCCACCGTCTATGCCTTC-35-ATCGTCACTGGGTGCTGGCAA-3 G3PDH 5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-35-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,数据资料的分析,实验结果以X+-S表示，采用完全随机设计单因素方差分析（one-way ANVOVA），多个样本均数
10、间的两两比较采用SNK-q检验；相关分析采用直线相关分析。P0.05有统计学意义。,实验条件,我们广西医科大学的医学实验中心能够 完全满足该实验所需要的条件。 我的导师对该领域有很高的造诣，同时，儿科实验室的老师都有很高的理论和实践水平，在他们的帮助和指导下，我相信一定能够完成实验。,经费预算,1、RNA试剂提取盒及逆转录试剂盒约3000 ￥，PCR约需要1000 ￥。 2、SOD、GSH-Px的活性测定试剂盒及 MDA含量试剂盒共需要1000￥。 3、CK-MB的活性测定约需要500 ￥。 4、每只大鼠价格需要20￥，共1000 ￥ 。 4、购买化学仪器、试剂和药品需要1000￥。预算总共约
11、8000￥。,参考文献,1、Doroshow JH.Effect of anthacyclin antibiotics on oxygen radical formation in rat heart.Cancer Res.1983;43(2):460-472 2、Olson RD,Mushlin PS.Doxorubicin cardiotoxicity:anlaysis of prevailing hypothesis.FASEB S.1990;4(3):3076-3086,参考文献,3、 Sazuka Y, Tanizawa H, Takino Y.Effect of adriamyci
12、n on the activities of superoxide dismutase,glutathiione peroxidase and catalasse in tissues of mice.Jpn J Cancer Res.1989;80(10):89-94 4、李咏梅，宁泊根，赵桂芳，沈丽贤.盐酸阿霉素对大鼠心肌损伤的分子机制研究.2002；7（3）：209-212,参考文献,5、Dorr RT.Cytoprotective agents for anthracyclines.Semin Oncol.1996;23(4suppl8):23-24 6、Xu MF,Tang PL,Q
13、ian ZM,Ashraf M.Effect by doxorubcin on the myocardium are mediated by oxygen free radicals.Life Sci.2001;68(8):899-901,参考文献,7、 吕焕章，耿宝琴，朱永康et al.胡萝卜素对阿霉素所致的大鼠心脏毒性的作用.中国药理学报.1996；17（4）：317 8、 Mohamed HE,El-Swefy-Sahar-E,Hargar HE,et al.The protective effect of glutathione administration on adriamycin
14、 induced acute cardiac toxicity in ratsJ.Pharmacology Res.2000;42(2):115-121,参考文献,9、吴玉玲，许广源.阿霉素致小鼠急性心毒性及维生素E保护作用的实验研究.大连医学院学报.1991;13（1 ） :22-27 10、陈顺志，金有余，李常淳，张增全.过氧化脂质TBA显色的三种方法比较.临床检验杂志,1984;2（4）:8-10 11、邓慧玲,张均田.超氧化歧化酶测定.见:徐叔云,卞如濂,陈修主编.药理实验方法学.第2版,北京:人民卫生出版社,1994：502-504,参考文献,12、夏亦明,朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究,1987;16（4）:29-33,致谢,我的开题报告及综述是在我的导师阳老师的亲切指导下完成的，在此，我向他表示诚挚的感谢！ 入学一年多来，儿科的经主任、王主任、农主任、韦主任、钟主任等都给予我极大的帮助及指导，在此，我向她们表示深深的感谢！,
