1、本科毕业论文(设计)黑木耳粗多糖提取工艺优化二级学院 食品科学学院专 业 食品科学与工程班 级 2011 级（2）班学生姓名 刘晓静学 号 1110502229指导教师 吴小勇2015 年 4 月诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日黑木耳粗多糖提取工艺优化【摘要】目的：比较多个文献中对黑木耳粗多糖
2、的提取方法，锁定几个最主要影响因素进行探讨实验，最终找出最优的提取工艺。方法：以粗多糖得率为指标，用热水浸提-乙醇沉淀的方法得到黑木耳粗多糖，然后采用单因素实验和 L9(34)正交实验探究影响黑木耳多糖提取时的因素并得出最优提取方案。其中研究的因素包括颗粒大小（目数） 、料水比、搅拌时的转速、浸提温度以及提取时间，测定的方法为蒽酮-硫酸法测定法。结果：单因素实验显示最佳提取条件为：料水比 1:35g/ml；搅拌速度 150r/min；颗粒大小 80 目；浸提温度 100；提取时间 50min，而正交试验反映了黑木耳多糖提取工艺中影响最大的因素为颗粒的大小，其次是搅拌速度和浸取时间，而料水比在此
3、实验范围内对测定结果的影响最小。最后得到的最佳提取工艺条件为：颗粒大小 80 目、料水比1：35g/ml、提取时间 70min、搅拌速度 200r/min、温度 100，且可以进行二次提取。结论：通过验证实验显示，所得出的优选工艺条件稳定且合理。【关键词】黑木耳；粗多糖；提取；蒽酮-硫酸法Auricularia auricula polysaccharides extraction process optimizationAbstractObjective: To compare multiple documents on the Auricularia auricula polysaccha
4、rides extraction methods, the lock several experiments to explore the most important factors, and ultimately find the optimal extraction process. Methods: The crude polysaccharide yield index, using hot water extraction-ethanol precipitation method to get Auricularia auricula polysaccharides, and si
5、ngle factor experiments and L9(34) orthogonal to explore factors AAP was extracted and when the optimal extraction scheme. Which factors include particle size (mesh), water ratio, speed, extraction temperature and extraction time of agitation, the method for the determination of anthrone-sulfuric ac
6、id assay. Results: Univariate experiments showed that the optimum extraction conditions: water ratio 1:35g/ml; stirring speed 150r/min; 80 mesh particle size; extraction temperature of 100; extraction time of 50min,while the orthogonal experiment reflects the Auricularia auricula polysaccharide extr
7、action process in the biggest factor affecting the size of the particles, followed by stirring speed and leaching time, the minimum ratio of material to water influence in this experimental range of the measurement results. Finally, the optimum extraction conditions were as follows: 80 mesh particle
8、 size, water ratio 1:35g/ml, extraction time 70min,stirring speed 200r/min, the temperature of 100 and can be re-extracted. Conclusion: validation experiments show the results of the preferred process conditions stable and reasonable. Keywords Auricularia auricular polysaccharides extraction anthron
9、e- sulfuric acid method目 录1 前言 11.1 黑木耳的概述 11.1.1 黑木耳的历史 .11.1.2 黑木耳的分布 .11.1.3 黑木耳的各种药理作用 .11.2 多糖的概述 21.3 研究的目的与意义 22 材料与方法 32.1 实验原料 .32.2 主要仪器设备和化学药品试剂 32.2.1 主要仪器设备 .32.2.2 主要化学药品与试剂 .42.3 溶液的配制 42.3.1 葡聚糖标准溶液的配制 .42.3.2 蒽酮-硫酸试液的配制 .42.4 实验方法 .42.4.1 黑木耳粗多糖的提取工艺流程 42.4.2 粗多糖含量的测定 52.5 实验数据处理 .9
10、3 结果与分析 103.1 料水比对黑木耳粗多糖得率的影响 .103.2 搅拌速度对黑木耳粗多糖得率的影响 .103.3 颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响 .113.4 提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响 .113.5 浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响 .123.6 黑木耳粗多糖提取工艺正交试验的研究结果 .123.7 验证试验 .133.8 提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响 .14参考文献 .16致 谢 .1711 前言1.1 黑木耳的概述 黑木耳，又名光木耳、云耳、木茸等，属于层菌纲，木耳目，木耳科，木耳属，营养丰富，味道鲜美，不但是大家日常餐桌上的美味佳肴，还是具有药用价值极高的药用菌，更
11、是世界公认的保健品之一。1.1.1 黑木耳的历史早在公元前一百年,西汉戴圣在礼记中写道：“芝杨木耳皆人君燕所加庶馐也” 。后魏末期著名的农学家贾思勰也在齐民要术中详细记载了黑木耳的食用方法：煮五沸、云腥汁、置冷水中。可以看出我国人民在采食和利用黑木耳已经有了上百甚至千年的历史。1.1.2 黑木耳的分布黑木耳对温度敏感程度很高，所以一般生长在北半球温带地区。正因为这个独特的性质，导致全球黑木耳产地不多，但幸运的是，我国是世界上主要的木耳生产国之一，年产量占世界总产量的 60%以上，其产区遍布 20 多个省(自治区、直辖市) 。在我国，黑龙江、吉林、湖北、云南、四川、贵州、湖南、广西等多个省区都有
12、人工栽培及天然的黑木耳生长，其中尤以黑龙江、湖北、云南等省的黑木耳产量多，质量好而著称于国内外 1。1.1.3 黑木耳的各种药理作用黑木耳是一种胶质真菌，其所含的胶体有较强的吸附能力，能够帮助清理消化道。药用子实体，具有益气强身、补气血、肺、止血、止痛、通便等功效。用于治疗高血压、血管硬化、月经、白带过多、便血、子宫出血、反胃多痰、吐血、便秘等 2-5，对女性具有极好的作用。目前市场上已经有很多以黑木耳作为原材料的女性口服液。另外，居于黑木耳多糖为黑木耳的重要活性成分，受到了广大学者的青睐。多个研究发现，黑木耳多糖具有降血脂、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫调节等生物活性 6-10，有重要的研究和
13、应用价值。21.2 多糖的概述生物生命活动中所需的能量来源于糖类，而多糖是一类分子结构复杂的糖类物质，由多个单糖分子脱水缩合而成。随着学科的飞速发展，自 20 世纪 80年代发现真菌多糖具有抑瘤活性后，各大领域开始对真菌多糖进行深入的研究。目前，香菇多糖和云芝多糖等已广泛用于市场和临床。糖工程将成为人类关注的继基因工程及蛋白质工程后的一个新技术领域。我国植物多糖和动物多糖的资源丰富，其开发工业已经势不可挡。把我国丰富的多糖资源利用在医药及保健食品等方向上，以提高人民身体素质、增进健康、提高生活质量已成为现今世界发展的潮流与趋势。1.3 研究的目的与意义 虽然我国黑木耳产量大，但生产方式落后，且
14、大多是以原料方式销售，使其在加工运输中造成大量的损失。同时，黑木耳多糖因其独特的性质，还被继续研究。目前，在其提取分离方法上、分子量、结构及其功效上，均有着不同的报道或结果 11-14。黑木耳细胞壁质地坚韧，壁内多糖物质难以透过细胞壁被人体所吸收，所以破碎胞壁是提取黑木耳细胞内多糖物质的关键步骤。其中粉碎操作是最常见也是最为广泛使用的手段之一。目前国内外对中药多糖的提取方法有热水提取、酸碱提取、酶提取法、超声波提取法、超高压提取法、膜分离技术等方法。其中热水浸提法是国内外常用的一种用于真菌类多糖提取的方法，此方法简单经济容易操作，可是所需周期长，多糖溶出率不高。但是本实验采用粉碎后的黑木耳进行
15、热水搅拌浸提研究，既能提高粗多糖的得率，也能节约时间和材料。32 材料与方法2.1 实验原料原料 来源 前处理黑木耳由无限极（中国）有限公司提供，人工挑选出干燥、无异味的优质黑木耳用高速万能粉碎机将黑木耳块粉碎，然后依次用目数为 100、80、60、40和 20 规格的筛子进行过筛。其中 100目筛上和 80 目筛下的颗粒标注为 80目的黑木耳颗粒，以此类推。2.2 主要仪器设备和化学药品试剂2.2.1 主要仪器设备仪器设备 型号或规格 制造商高速万能粉碎机不锈钢检验筛电子天平力德加强型纯水机FW10020/40/60/80/100 目JJ500LJQ-5-Z天津市泰斯特仪器有限公司金坛市富华
16、仪器有限公司双杰测试仪器厂力德科技双列八孔智能恒温水浴锅 HH-ZK8 巩义市予华仪器有限责任公司低速离心机 SC-3610 安徽中科中佳科学仪器有限公司电子调温万用电炉 DK-98-II 天津市泰斯特仪器有限公司电子分析天平 AEY-220 湘仪天平仪器设备有限公司可见分光光度计电热鼓风干燥箱721NDGX-9243 B-2上海仪电分析仪器有限公司上海福玛实验设备有限公司手持折射仪糖度计 - 成都光学厂美菱电冰箱 BCD-181BCT 合 肥 美 菱 股 份 有 限 公 司不锈钢锅 理光（C13B） 顺德市夏朗实业有限公司42.2.2 主要化学药品与试剂药品与试剂 型号或规格 制造商蒽酮 A
17、R 上海强顺化学剂有限公司浓硫酸 AR 广州化学试剂厂葡聚糖 T-40 北京方程生物科技有限公司无水乙醇 AR 天津市永大化学试剂有限公司无水乙醚 AR 天津市百世化工有限公司丙酮 AR 广州化学试剂厂2.3 溶液的配制2.3.1 葡聚糖标准溶液的配制用分析天平精密称取干燥的葡聚糖标准品 0.1g，加入蒸馏水溶解后定容于1000ml 容量瓶中，配制而成 0.1mg/ml 的葡聚糖标准溶液。2.3.2 蒽酮-硫酸试液的配制用分析天平精密称取 50mg 蒽酮，然后将 100ml 浓度为 100%的浓硫酸沿着玻棒缓慢加入烧杯中，搅拌溶解，配制成浓度为 0.05%的蒽酮硫酸试剂，现配现用。2.4 实验
18、方法2.4.1 黑木耳粗多糖的提取工艺流程2.4.1.1 黑木耳粗多糖提取液的提取用量筒量取 600ml 的蒸馏水于 1000ml 的烧杯中，按照一定的料水比称取相应重量的不同大小的黑木耳颗粒，在一定的温度和搅拌转速下水浴加热一段时间，加热停止后迅速用冷水冷却，然后用两层滤布抽滤（20 目、40 目和 60目）或离心（80 目和 100 目）得到黑木耳粗多糖提取液。2.4.1.2 黑木耳粗多糖提取液的处理52.4.1.2.1 黑木耳粗多糖提取液的浓缩向黑木耳粗多糖提取液中加入适量玻璃珠，用电炉直接加热浓缩，使提取液保持微沸状态，浓缩至重量为 60g 左右，冷却、称重，装瓶，得到黑木耳粗多糖浓缩
19、液。2.4.1.2.2 黑木耳粗多糖的醇沉用胶头滴管吸取黑木耳粗多糖浓缩液滴到小烧杯上，并用电子天平精密称量 2.0g。取样后，往小烧杯中加入 8ml 无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，使黑木耳粗多糖变成沉淀析出，然后用保鲜膜封口置于冰箱中静置过夜（12h） ，使黑木耳 粗多糖完全沉淀析出。2.4.1.2.3 黑木耳粗多糖样液的配制用低速离心机离心已经醇沉过夜的混合液，转速为 3500r/min，时间为10min，去除上清液后再分别依次用 10ml 的 80%乙醇、5ml 丙酮和 5ml 无水乙醚进行洗涤脱色离心，转速、时间皆与第一次相同，去除上清液后得到黑木耳粗多糖沉淀。最后加入适量的蒸馏水溶解，
20、并定容于 100mL 的容量瓶中，配制得到黑木耳粗多糖样液。2.4.2 粗多糖含量的测定2.4.2.1 实验原理糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生有色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于 620nm 处有最大吸收。显色与多糖含量呈线性关系，通过测定其吸光度，即可以得到多糖的得率。2.4.2.2 标准曲线的绘制用移液管分别精密吸取葡聚糖标准溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml 于 6 支比色管中，并补充蒸馏水至1.0ml 混合摇匀。将加好相应葡聚糖和蒸馏水的比色管放入冰水浴中，沿壁缓慢加入蒽酮- 硫酸试液 4ml 振荡摇匀，然后水浴加热 12m
21、in，加热后立刻取出冷却至室温。以 1ml 蒸馏水作空白对照，用 1cm 比色杯，在可见分光光度计波长为620nm 处上测定吸光度。6以葡聚糖标准液的质量浓度（mg/ml）C 为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，绘制标准曲线并得出回归方程。结果见下列图 1：图 1 葡聚糖的标准曲线由标准曲线数据可到一元线性回归方程为：Y=0.5889X+0.0496，R=0.999，线性关系明显。2.4.2.3 样品溶液的测定精密吸取配制好的黑木耳粗多糖样液 1.0ml 于比色管中，沿壁缓慢加入4.0ml 蒽酮- 硫酸试剂振荡摇匀，测定步骤跟制标准曲线一样。若样液吸光值不在标准曲线范围内，则需要将样品溶液稀释一定
22、倍数 D，再精密吸取稀释液1.0mL 重复以上的操作。平行测定两次，取其平均值，要求相对误差5%。根据标准曲线和样液吸光值计算出样液中黑木耳粗多糖质量浓度 c=（A-0.0496 ）/5.889（mg/mL） 。2.4.2.4 粗多糖得率的计算公式 %1010289.5/)0496.( WVDAM式中：M黑木耳粗多糖得率，%；A样液吸光值D供试液的稀释倍数；V提取液的重量， g；W称样重量，g；72醇沉重量，g。2.4.2.5 粗多糖提取率的计算公式 %10WGV式中： 黑木耳粗多糖提取率，%；V提取液的重量，g ；W称样重量，g；G浓缩后的固形物， %。2.4.3 黑木耳粗多糖提取工艺的单因
23、素实验本次实验对黑木耳粗多糖提取中最主要的五个影响因素进行了研究。分别研究料水比(1:25、1:30、1:35、1:40、1:45)、搅拌速度（100r/min 、150 r/min、 200 r/min、250 r/min、300 r/min） 、颗粒大小（20 目、40 目、60 目、80目、100 目） 、提取温度(80、85、90、95、100)和浸提时间(30min、40min、50min、60min、70min)等因素对黑木耳粗多糖得率的影响。2.4.3.1 料水比对黑木耳粗多糖得率的影响准确量取 5 份 600ml 蒸馏水于 1000ml 烧杯中，分别按照料水比为1:25、1:3
24、0、1:35、1:40 和 1:45 称取加入相应重量的 40 目黑木耳颗粒，在提取温度为 100和搅拌速度为 150r/min 的条件下进行水浴提取，浸提时间为 50min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为 60g。剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按 2.4.2.3 和 2.4.2.4 的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。2.4.3.2 搅拌速度对黑木耳粗多糖得率的影响准确量取 5 份 600ml 蒸馏水于 1000ml 烧杯中，然后按照料水比 1:35 称取加入相应重量的 60 目黑木耳颗粒，分别在搅拌速度为 100r/mi
25、n、150 r/min、 200 r/min、250 r/min、300 r/min 的条件下进行水浴提取，提取温度为100，浸提时间为 50min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为 60g。剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按 2.4.2.3 和 2.4.2.4 的方法进行8测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。2.4.3.3 颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响准确量取 5 份 600ml 蒸馏水于 1000ml 烧杯中，然后按照料水比 1:35 分别称取加入相应重量的 20 目、40 目、60 目、80 目、100 目黑木耳颗粒，在搅拌速度
26、为 150 r/min 的条件下进行水浴提取，提取温度为 100，浸提时间为 50min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为 60g。剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按 2.4.2.3 和 2.4.2.4 的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。2.4.3.4 提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响准确量取 5 份 600ml 蒸馏水于 1000ml 烧杯中，然后分按照料水比 1:35 称取加入相应重量的 20 目黑木耳颗粒，分别在提取温度为 80、85、90、95、100的条件下进行水浴提取，搅拌速度为 150 r/min，浸提时间为 5
27、0min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为 60g。剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按 2.4.2.3 和 2.4.2.4 的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。2.4.3.5 浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响准确量取 5 份 600ml 蒸馏水于 1000ml 烧杯中，然后分按照料水比 1:35 称取加入相应重量的 40 目黑木耳颗粒，在提取温度 100，搅拌速度为 150 r/min的条件下进行水浴提取，浸提时间分别为 30min、40min、50min、60min、70min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重
28、量约为 60g。剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按 2.4.2.3 和 2.4.2.4的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。2.4.4 黑木耳粗多糖提取工艺的正交试验正交试验设计是一种使用正交表来安排多因素多水平试验，并利用普通的统计分析方法来分析试验结果的一种试验设计方法。影响热水提取黑木耳粗多糖的因素主要有料水比、搅拌速度、颗粒大小、浸提温度、提取时间等因素。在研究温度单因素时发现当温度为 100时粗多9糖得率明显比其他因素高，所以正交试验最终选择其他四个因素（料水比、搅拌速度、颗粒大小、提取时间）进行 L9(34)正交试验来研究，并结合单因素结果
29、和实际要求，每个因素三个水平，因素的编码及水平见表 1，以粗多糖得率作为指标，得到最优提取方案。每次量取 600ml 蒸馏水，按表 1 因素水平表进行试验，得到黑木耳粗多糖提取液后剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按 2.4.2.3和 2.4.2.4 的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。表 1 提取工艺因素水平表水平A颗粒大小( 目)B料水比（ g/min）C搅拌速度（ r/min）D浸提时间（min）1 60 1:30 150 502 80 1:35 200 603 100 1:40 300 702.4.5 验证实验准确量取 5 份 600ml 蒸馏
30、水于 1000ml 烧杯中，按照 2.4.4 得到的最佳提取工艺条件进行提取。得到黑木耳粗多糖提取液后剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按 2.4.2.3 和 2.4.2.4 的方法进行测定与计算，最终得到黑木耳粗多糖得率。2.4.6 提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响保留 2.4.5 的滤渣，分别补充 600ml 的蒸馏水继续按照 2.4.4 得到的工艺条件进行二次浸提，得到黑木耳粗多糖提取液后剩下的步骤按照 2.4.1.2 操作，按2.4.2.3 和 2.4.2.4 的方法进行测定与计算，最终得到黑木耳粗多糖得率。第三次浸提重复以上步骤。2.5 实验数据处理实验所得数据用 SPSS17.
31、0 软件进行统计分析。采用单因素方差分析进行总体比较。103 结果与分析3.1 料水比对黑木耳粗多糖得率的影响由表 2 数据可以看出，在实验条件下黑木耳粗多糖提取得率随料水比的增加呈现先增加后减少的趋势，差异有统计学意义（F=20.102，P=0.000 0.05） 。当料水比达到 1:35 时，黑木耳粗多糖得率显著升高，与料水比为 1:25、1:30 时差异显著（F=10.851，P=0.0100.05） 。当料水比为 1:40g/ml 时，黑木耳粗多糖得率和提取率达到最大，随后便有所降低，说明如果进一步增加料水比，黑木耳粗多糖的提取效果反而会下降，考虑到料水比太大容易造成原料浪费且后期浓缩
32、成本高，所以选定最佳料水比为 1:35，此条件下提取黑木耳粗多糖已较为充分。另外，从表 2 中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间有一定的相关性，提取率越高，粗多糖得率越高。表 2 不同料水比对黑木耳粗多糖得率的影响料水比（g/ml） 粗多糖得率 (%) 提取率（%）1:25 3.730.14 15.861:30 3.670.27 12.911:35 4.650.39 16.271:40 4.940.05 16.891:45 3.860.04 14.81注：多糖提取其他工艺条件：搅拌速度为 150r/min，颗粒大小为 40 目，浸提时间为 50min，提取温度为100。3.2 搅拌速度对黑
33、木耳粗多糖得率的影响由表 3 数据可以看出，在实验条件下黑木耳粗多糖提取得率随料水比的增加呈现先增加后减少的趋势，差异有统计学意义（F=20.102，P=0.000 0.05） 。当转速达到 150r/min 的时候，虽然粗多糖提取率不是很高，但得率却达到最高值，与转速为 300r/min 时相比有明显差异（F=10.663，P=0.0310.05） 。此后转速增大可能会破坏多糖的结构导致得率减低而且搅拌机长期高速运转工作容易造成机器损坏；综合考虑，最佳搅拌速度为 150r/min，此条件既能令黑木耳粗多糖最大程度地提取出来，又能保障搅拌机的正常工作。此外，从表 3 中的11数据可以看出，提取
34、率与粗多糖得率之间不存在明显的相关性。表 3 不同搅拌速度对黑木耳粗多糖得率的影响搅拌速度（r/min） 粗多糖得率 (%) 提取率（%）100 3.960.18 14.44150 5.740.49 14.93200 4.240.47 16.41250 4.190.19 17.52300 4.410.50 14.74注：多糖提取其他工艺条件：料水比为 1:35，颗粒大小为 60 目，浸提时间为 50min，提取温度为 100。3.3 颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响从表 4 数据可以看出，此实验条件下差异具有统计学意义（F=32.131，P=0.0000.05） 。当颗粒大小为 80 目时，此
35、条件下的粗多糖得率最高，与 60 目时有显著性差异（F=19.732 ，P=0.0040.05） ，但与 100 目时无显著性差异（F=2.600，P=0.158 0.05） ，说明当黑木耳颗粒越小，提取效果越好且粗多糖提取得率越高。黑木耳颗粒太大时其多糖难以破壁完全溶出，颗粒太小时在过滤浓缩等步骤中操作困难；综合考虑，选定 80 目作为最佳提取颗粒大小。另外，从表 4 中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间有一定的相关性，提取率越高，粗多糖得率越高。表 4 不同颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响颗粒大小（目） 粗多糖得率(%) 提取率（% ）20 3.500.44 14.6540 3.700
36、.38 15.4260 4.370.91 15.3180 6.460.25 16.90100 6.250.06 17.80注：多糖提取其他工艺条件：料水比为 1:35，搅拌速度为 150r/min，浸提时间为 50min，提取温度为100。3.4 提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响表 5 考察了不同提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响。此实验条件下差异具有统计学意义（F=14.107 ，P=0.000 0.05） 。由表可以看出：黑木耳粗多糖得率随着提取温度的增加而增大，当温度为 100时提取率达到最大，且明显高12于其他温度条件得到的结果。所以实验结果表明最佳提取温度为 100。另外，从表 5 中
37、的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间不存在明显的相关性。表 5 不同提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响温度（） 粗多糖得率(%) 提取率（ %）80 2.220.11 13.0285 2.170.27 14.4690 2.560.32 13.9395 2.580.16 15.05100 3.500.44 14.65注：多糖提取其他工艺条件：料水比为 1:35，搅拌速度为 150r/min，浸提时间为 50min，颗粒大小为 20目。3.5 浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响由表 6 可以看出黑木耳粗多糖得率和提取率随着提取时间的增加而增大。此实验条件下差异具有统计学意义（F=11.646 ，P=
38、0.0000.05） 。当提取时间为50min 时黑木耳粗多糖得率几乎已经到达最高点，随着时间的延长，虽然黑木耳粗多糖的提取率也增加，但得率几乎不变甚至减少，与条件为 70min 时的结果差异不大（F=1.701，P=0.2400.05） 。其原因可能是因为多糖在长时间高温条件下被分解了。综合考虑，此条件下提取时间为 50min 效果最为合适。另外，从表 6 中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间有一定的相关性，提取率越高，粗多糖得率越高。表 6 不同浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响时间（min） 粗多糖得率(%) 提取率（%）30 2.890.21 16.4740 3.900.61 16.
39、6250 4.620.33 16.2760 3.660.26 17.0270 4.290.39 17.82注：多糖提取其他工艺条件：料水比为 1:35，搅拌速度为 150r/min，颗粒大小为 40 目，提取温度为100。3.6 黑木耳粗多糖提取工艺正交试验的研究结果按 2.4.4.2 设计的正交试验表，以黑木耳粗多糖得率为评价指标，其得率结13果和极差分析见表 7。由表 7 中的极差分析结果可知，各因素对黑木耳粗多糖得率的影响顺序为:A(颗粒大小) D(浸提时间) C(搅拌速度) B（料水比） 。由表 7 分析结果可知，A（颗粒大小）取 第 2 水平，即 A2 好，B（料水比）取第2 水平，
40、即 B2 好，C （搅拌速度）取第 2 水平，即 C2 好，D （浸提时间）取第3 水平，即 D3 好。黑木耳粗多糖提取工艺的最优组合为 A2B2C2D3，即颗粒大小为 80 目、料水比为 1:35、搅拌速度为 200r/min、浸提时间为 70min、提取温度为 100。表 7 黑木耳粗多糖提取工艺 L9（3 4）正交试验表A B C D实验号 颗粒大小（目）料水比（g/ml）搅拌速度(r/min)浸提时间(min)提取率（%）1 1 1 1 1 4.170.202 1 2 2 2 4.320.273 1 3 3 3 4.270.284 2 1 2 3 7.770.125 2 2 3 1 6
41、.650.676 2 3 1 2 6.360.157 3 1 3 2 5.610.258 3 2 1 3 6.811.079 3 3 2 1 6.650.05K1 12.76 17.55 17.34 17.47K2 20.78 17.78 18.74 16.29K3 19.07 17.28 16.53 18.85R 8.02 0.5 2.21 2.563.7 验证试验从表 8 可以看出，平行五组实验得到的黑木耳粗多糖得率平均值为8.46%，高于正交试验表中的所有试验结果。可知条件为颗粒大小为 80 目、料水比为 1:35、搅拌速度为 200r/min、浸提时间为 70min 和提取温度为 10
42、0的14提取工艺方案稳定可行。表 8 验证试验结果实验序号 1 2 3 4 5粗多糖得率% 8.47 8.09 9.06 8.15 8.51平均值 8.460.393.8 提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响由表 9、图 2 可以看出，黑木耳粗多糖的得率随着浸提次数的增加而减小，提取三次后总的粗多糖得率约为 14%。从比例上开看，浸提第二次的得率约为第一次的一半，浸提第三次的得率仅为第一次的 20%左右。综合考虑工业化生产以及成本回收等方面，可进行二次提取。表 9 提取次数对粗多糖得率的影响粗多糖得率(%)第一次提取 第二次提取 第三次提取 三次提取的粗多糖得率(%)8.47 3.19 1.87
43、13.538.09 4.06 1.59 13.749.06 4.25 1.63 14.948.15 4.28 1.04 13.478.51 3.68 1.62 13.81注：提取方法为颗粒大小 80 目、料水比 1:35、搅拌速度 200r/min、浸提时间 70min 和提取温度 100。15图 2 提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响164 结论本研究以黑木耳作为研究对象，通过热水浸提法提取粗多糖活性物质并采用蒽酮- 硫酸法测定，以粗多糖得率为指标。探究不同的颗粒大小、搅拌速度、提取温度，料水比及浸提时间对提取结果的影响，最终得到优化的工艺条件。（1）本实验提取黑木耳粗多糖的提取剂采用蒸馏水，
44、条件简便，易于操作，回收方便，既利于环保，又能不破坏多糖的化学结构，也能使得率较高。（2）黑木耳粗多糖的最佳提取工艺条件为：颗粒大小 80 目、料水比 1：35g/ml、提取时间 70min、搅拌速度 200r/min、温度 100C。可进行二次提取。其中正交试验反映了黑木耳多糖提取工艺中影响最大的因素为颗粒的大小，其次是提取温度、搅拌速度和浸取时间，而料水比在此实验范围内对测定结果的影响最小。（3）尽管热水浸提法效率不高，但保证了它的结构稳定性，有利于下一步对多糖的分离纯化。此法简化工艺流程，节约成本，减少杂质，具有合理、经济、可行的优点。（4）采用该工艺制备出的粗多糖的化学成分有待进一步研
45、究，不同工艺条件和纯化方法对其化学结构及其对人的生理活性的影响不同。另外，本实验在传统的直接热水浸提方法的基础上增加了粉碎黑木耳的处理，由于实验室设备不允许，所以只能用机械粉碎方法。目前很多研究都显示超微粉碎方法对黑木耳粗多糖的提取具有更大的效果。未来将是开发多糖的时代，在条件允许的情况下这些方面都可进一步进行探讨研究。17参考文献1 袁明生,孙佩群 .四川蕈菌M/成都:四川科学技术出版社,1995:198-991.2 丁黎.木耳多糖的分离及其组成单糖的分析J.特产研究,1994,1: 44-45.3 欧阳天贽 ,谢九皋.碱溶性黑木耳多糖的分离、纯化和表征J.华中农业大学学 报,1999,18
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47、nontoxic mushroom Auricularea auricular contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated by antithromb in J. Thrombosis Research,2003,112:151-158.10 张秀娟,于慧茹,耿丹等.黑木耳多糖对荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响J.中成药,2005,27(6):691-693.11 唐青涛, 余若黔,等.深层发酵黑木耳产孢外多糖的初步研究J.食品科学,2002,23(3):46-49.12 Zhang Lina,Yang Liqun.P
48、roperties of auricularia auricula-D-glucan in dilut e solutionJ.Biopolymers,1995,36(6):695-700.13 陈和生 .黑木耳酸性多糖 (FII)的分离、纯化及相对分子量测定J.中国医院药学杂志,2002,22(6):348-349.14 张才擎. 黑木耳药用研究进展J.中国中医药科技,2001,8(3):339-340.18致 谢本研究及学位论文是在我的导师吴小勇老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。在此我要真心感谢我的论文指导老师吴小勇老师。感谢导师在我论文的选题、资料搜集、研究思路及论文完成的全部过程中所给
49、予的指导和建议。导师渊博的专业知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风、诲人不倦的高尚师德、宽以待人的崇高风范、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我掌握了很多基本的研究方法和提高了分析问题的能力，还使我明白了更多待人接物与为人处世的道理。虽然老师工作繁忙，仍抽空给予我论文撰写上的指导，每一步都是在导师的悉心指导下完成的，在此谨向吴小勇老师致以崇高的敬意和深深的感谢。同时我还要感谢广东药学院提供的舒适的实验环境和充足的实验器材，为我论文的完成提供了莫大的帮助。还要感谢同学们在实验过程中和毕业论文撰写中给予我的热心的帮助和支持，使我的论文得以顺利进行。最后，谨以此文献给所有帮助过我、关心过我的老师和同学们，没有他们的帮助和支持我是无法顺利完成我的毕业论文的，在此我对他们表示衷心的感谢和崇高的敬意！刘晓静二 O 一五年 四月
