1、初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内 12130min。2）采样数量：每批产品随机抽取 10 件样品.3）检测标准GB 15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准：100cfu/件次。4）洗脱液、稀释液采用 0.9无菌氯化钠溶液。2、试验步骤：1）用无菌手续取出 10 个样品，分别放入 10 支装有 10ml0.9无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打 80 次，混匀，分别吸取 1ml 放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置 37温箱培养 482h 观察结果。2）用肉眼直接计数，然后用 5-10 倍放大镜检查，有否遗漏。若
2、培养皿上有 2个或 2 个以上的菌落重叠，可分辩时仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数稀释倍数/件次。阴性对照试验：将使用的 0.9无菌氯化钠溶液吸取 1ml 放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。制备 2 个平板均不得有菌生长。3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。编制： 审核： 批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1 范
3、围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果 3 个月都稳定，监测周期改为每季度一次。2 职责质管部负责取样、按 ISO 11737 进行试验、如试验结果初始污染菌超过 6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。3 生物负载测定方法A.1 概要A.1.1 生物负载测定，可使用不同的方法内容。负责进行测定的人员应运用原材料、部件、生产环境、生产过程和产品的特性方面的知识为每一步选择适当的方法。A.1.2 图 A.1 给出了生物负
4、载测定程序主要步骤和顺序。建议负责人员在决定取样率、培养基范围和培养条件以及方法开发和确认水平时要根据情况而定。样品选择试验样品的收集送人实验室处理(如果需要)TREATMENT TEBHNIQUES移人培养基 培养计数和定性 数据解释图 1-生物负载测定程序主要步骤和顺序A.2 获取微生物所用方法A.2.1 概要A.2.1.1 本附录中所述的几种方法可以组合使用，以便增加所发现生物体的数量和降低可变性。A.2.1.2 微生物在表面附着的程度受表面特性、微生物自身和存在的其他材料(如润滑剂) 的影响。污染源也会影响到附着程度。为获取微生物，所进行的处理包括漂洗或直接表面取样。表面活性剂可以用于
5、提高回收，但应认识到，较高浓度的表面活性剂可能会抑制微生物。A.2.1.3 在相当一部分材料中，有些微生物可能以生物膜的形式出现，在生物膜的结构中，微生物在牢固附着于材料表面上的被囊状包围。生物膜状微生物可能会表现更强的抗灭菌性。生物膜可以在数分钟年形成，而且可能在与组织附和或已经使用过的医疗器械上生长出大得多的生物膜。在这种情况下，就应考虑生物膜形成的可能性，而且也不应认为 A.2.2 中列出的处理方法能完全将微生物从生物膜中释放出来。 在对获取技术进行确认时，如果在重复回收过程中重复记录到较高的微生物数，则表明有生物膜出现。A.2.1.4 在生物负载估计中所用的任何处理都应具有重现性，并应
6、避免会明显影响微生物活性的条件，如过分空化、剪切力、温度升高或渗透震动。 A.2.1.5 有些处理方法要比其他一些方法易于控制。在选择方法和设计适宜的变量组合时，建议考虑方法中的变量和控制这些变量的途径。例如，对一给定的方法，可以通过延长时间或调整机械搅动的特性来增加微生物的回收。A.2.1.6 有些处理方法可能会分解待测产品(例如碎解、袋蠕动和涡旋 )。分解的材料会给微生物计数造成困难，这时则需要进行其他处理，如将分解的材料从洗提液中分离出来。应注意保证所得到的计数具有代表性。 A.2.1.7 应尽力尽快将试验样品移至试验室。如果必须要推迟转送，试验样品的保存条件应能避免微生物的丢失或改变。
7、应规定贮存的最长时间。干燥可能是微生物数量减少的重要原因，所以在选择贮存条件和贮存时间时应加以考虑A.2.2 获取方法A.2.2.1 袋蠕动A.2.2.1.1 将试验样品和一已知体积的洗脱液包封于一无菌胃型袋中开动往复式搅拌，使洗脱液穿过并环绕试验样品。A.2.2.1.2 应规定处理的时间长度。 A.2.2.1.3 该方法因为使用了相对大量的洗脱液，所以可能会生成微生物浓度较低的悬浮液。如可行，洗脱液应予过滤处理。A.2.2.2 搅动 (机械或手工)A.2.2.2.1 将试验样品浸于装有已知体积洗脱液的适宜器皿中，并用机械搅拌器(往复式、环绕式或手腕作用式)进行搅动。也可使用手工搅动，但其效力
8、会因操作人员而异。A.2.2.2.2 应规定搅动的时间和频率。A.2.2.2.3 可以加人一定大小的玻璃珠来增加表面磨损以提高回收效率玻璃珠的大小以及搅动频率和时间不应导致过热和/或对微生物造成破坏。注：加人玻璃珠会增加微生物可附着的表面积。A.2.2.4 冲洗A.2.2.4.1 让洗脱液通过试验样品的内腔。可以靠重力或泵来使液体流动。另外还可将洗脱液充人产品中，夹住并抖动。A.2.2.4.2 应规定器械与洗提液的接触时间、冲洗速度和液体体积。 A.2.2.4.3 设备结构和内腔大小可能限制从表面彻底取下生物体所需的力的大小。A.2.2.5 搅切(碎解)A.2.2.5.1 将试验样品浸于装有已
9、知体积洗提液的适宜容器中。在规定的时间内进行搅切。 A.2.2.5.2 搅切时间取决于试验样品和搅切器，但不宜过热，以免会引起洗脱液过热和对微生物造成破坏。 A.2.2.5.3 该方法能将试验样品分割成足够小，以便能用适当的方法对微生物计数。 A.2.2.6 擦拭A.2.2.6.1 含有可吸收取样材料的棉拭子通常被固定于杆或把手上。样品材料可以是也可以不是可溶性的。A.2.2.7.2 通常的使用方法是用缓冲液或液体培养基湿润棉拭，用棉拭擦拭界定好的取样表面。在有些情况下，可以先湿润样品表面，然后用干棉拭擦拭，这样可以提高回收效率。随后将棉拭放至缓冲溶液或液体培养基中，并搅动以从棉拭上取下微生物
10、。另外，有时也可用可溶性棉拭，使棉拭溶解于缓冲液。A.2.2.6.3 拭擦是从不规则形状产品或相对难以接近的区域取样的有效方法，该方法对取样面积必须大时也有效。A.2.2.7.4 但该方法因擦拭方式的不同而更易出错。而且，通过擦拭不太可能将样品上所有的微生物都收集到。有些微生物可能会被棉拭本身吸附，从而不会被测到。A.2.2.6.5 棉拭中不应有微生物杀灭剂或微生物抑制剂。A.2.3 洗脱液、稀释液和转送培养基A.2.3.1 在生物负载估计过程中，洗脱液可用于从产品上取下微生物 ;传送培养基可用于将取下的微生物移去计数;稀释液可用于获得含有可计数微生物的悬液。A.2.3.2 洗脱液和稀释液的特
11、性对所用方法的效率有显著影响。在选择稀释液或洗提液时，应注意它们的成分(如组成、浓度、渗透性和 pH) 这些成分不应使微生物增殖或失活。A.2.3.3 当用液体从固体表面取下微生物时，可考虑使用表面活化剂。A.2.3.4 常用的洗脱液和稀释液见表 A.1 。表 A.1 -洗 脱 液 的 稀 释 液 示 例溶液 水中的浓度 应用缓冲的蛋白胨水溶液 Auffered peptone water 0,067 M 磷酸 phosphate0,43 %氢氧化钠 sodium Bhloride0,1% 蛋白胨 peptone 通用林格氏溶液Balgon Ringer 1/4 强度 溶解藻酸钙棉拭Disso
12、lution of BalBium alginate swaAs蛋白胨水溶液 Peptone water 0,1%-1,0% 通用磷酸盐缓冲盐水溶液 Phosphate Auffered saline 0,02 M 磷酸 phosphate0,9 % 氢氧化钠 sodium Bhloride 通用林格氏溶液 Ringer 1/4 强度 通用氯化钠溶液 Sodium Bhloride 0,25 % - 0,9 % 通用硫代硫酸盐林格氏溶液 Thiosulphate Ringer 1/4 强度 中和残留氯Neutralization of residual Bhlorine水Water NA 水稀
13、释含水样品Dilution of aqueous samples计数前制备可溶材料Preparation of isotoniB solutions ofsoluAle materials prior to Bounting注: 本表并不是全都包括的。表面活化剂如聚山梨醉醋(吐温. 80)可以加人洗提液和稀释液中。根据具体的应用 ，通常使用的浓度在 0.0l% -0.1%之间。应使用适当浓度的表面活性剂，并加以特殊处理以防止泡沫形成。A.3 非洗提方法A.3.1 接触板A.3.1.1 接触板或玻璃片可用于将凝固的培养基放在样品表面上，使存活微生物能附着在培养基表面，然后再培养接触板或玻璃片，至
14、形成可以计数的菌落。A.3.1.2 该系统的优点在于易于使用，结果与凝固的培养基的接触表面直接相关。A.3.1.3 表面上天然集聚的细胞群、菌落在琼脂介面散布、琼脂干燥、可能存在的厌氧菌等都是潜在的不利因素。A.3.1.4 由于该方法的效率普遍较低，所以只有在其他方法都不适用的情况下使用接触板和玻璃片一般只适用于平的或至少是规则的表面。A.3.2 琼脂覆盖A.3.2.1 当生物负载低和在产品构型适宜时，在产品表面涂上熔化的琼脂培养基( 最高温度在45B)，培养至生成可见菌落。当生物负载低以及产品构型适宜时，适用本方法。A.3.2.2 表面上天然集聚的细胞群、菌落在琼脂介面散布、琼脂干燥、可能存
15、在的厌氧菌等都是潜在的不利因素。A.3.3 连续稀释的最大可能数(MPN)法A.3.3.1 MPN 法，是业已建立并且充分文件化的用于估测产品上随机分布的活性微生物数量的方法。其主要应用为使用液体、粉体和半固体产品或原材料的食品和水工业。MPN 法特别适用于生物负载平均值低的产品。A.3.3.2 如果具有足够多的洗脱液，可将其一系列的稀释液接种于营养培养基中，使接种的培养基部分在随后的培养中不产生可见生长。用表现出生长的稀释度，用统计学方法来估计微生物的原始数量。目前利用统计学假设已经设计出了 MPN 表格，可查表直接估计出微生物的最可能数目(MPN) 。A.3.3.3 MPN 法易于操作，但
16、是可以使用的培养条件范围则很有限，而且因该方法是基于统计学，所以它更适于一般性评价而不是精确测定。 A.3.3.4 如果存在杀灭微生物或抑制微生物的物质，可考虑 A.8 部分所列述的内容。A.4 移至培养基A.4.1 总则A.4.1.1 经过处理后，通常在洗脱液中会生成微生物悬液，可用如下所描述的方法检查其中的存活微生物数。 A.4.1.2 在移人培养基之前，还可能必须进行额外的处理，以便将聚集的微生物分解开来，以降低变异。在有些情况下，从试验样品中取下微生物的方法也会分解这种聚集。A.4.1.3 如果洗脱液中有杀灭微生物或抑制微生物的物质，这可以通过稀释将其浓度降至无效，或通过过滤或化学中和
17、法来去除。因为，杀灭微生物或抑制微生物的物质可能会影响计数方法的选择。 杀灭微生物或抑制微生物的物质的存在可能会影响到培养方法的选择。 A.4.2 膜过滤法A.4.2.1 通常，经膜过滤后，将滤器放到适宜的生长媒介上进行培养形成可见菌落是一种评价污染的有效方法。滤膜的孔径大小应适宜，能滤除通过它的洗提液中的微生物。通常孔径为0.45的滤膜能促进菌落的形成。A.4.2.2 通常需要一真空或正压(有些情况下)源。应注意避免负压过大，这会引起滤膜变形或损坏。A.4.2.3 进行培养时，滤膜可以放在琼脂表面或放在浸泡了营养媒介的吸水纱布垫上。滤膜表面上形成的菌落可以计数，也可从滤器上分离出来进行定性。
18、A.4.2.4 膜过滤尤其适用于微生物浓度较低的悬液。A.4.2.5 从洗提液中取出微生物时，当怀疑液体基质中含有杀灭或抑制微生物时，膜过滤特别适用，先将洗提液中的微生物过滤出来，并可在培养前对滤膜上的微生物进行冲洗。但是有些类型的膜滤器可以吸收或释放抑制微生物生长的物质，所以只使用那些适于给微生物计数的滤膜是很重要的。滤膜和洗提液应相容。A.4.3 平板倾注A.4.3.1 运用平板倾注技术，将一定量的悬浮液在不超过 45下与熔化的琼脂混合，随后浇到平板中，放至凝固。对平板进行培养至菌落形成并计数。 A.4.3.2 倾注板技术并不能将微生物从洗提液中分离出来。如果存在杀灭微牛物或抑制微生物的物
19、质，可用 A.8 适用。A.4.3.3 由于可浇倒的洗提液数量有限，所以，本方法可能会对微生物低浓度悬浮液不具备所要求的灵敏度。A.5 培养 （培养基 和培养条件）A.5.1 培养基和培养条件见表 A.1A.5.2 应注意，所有非选择性厌氧培养方法可能导致兼性寄生的厌氧生物体的生长。A.6 计数A.6.1 使用群落计算的计数方法时，所建立的程序应着重于不同情况，如：a)检测小群落 (如使用立体显微镜)；A) 计算并记录不平常的群落(e.g. spreaders)；B) 计数并记录大量群落 (如 TNTB)；d) 记录连续稀释的计数。A.6.2 使用群落计算的计数方法时，应考虑所产生群落的数量。
20、此数量应即能够表现自我存在，而又不被其周围群落所干扰。A.6.3 标准平板计数通常指定群落数量的某一低限。这一低限在生物负载低时不必用于生物负载的测定。A.6.4 不同技术人员的测定结果的可变性应予以评估。技术人员的可变性可以高至 10 %。A.6.5 对于自动计数方法，体系操作应符合 ISO/IEB 17025 要求。A.7 检测微生物的其他方法估计生物负载时还可使用菌落计数以外的其他方法。这包括新陈代谢物测定和荧光法。这些方法被称为“间接法” ，为了建立起与以往确定的存活微生物数量的关系，它们必须对照菌落计数校准。这些技术的一个主要限制就是需要相对较高的微生物数悬浮在样品洗脱液中。一般来说
21、，检测的数据量下限要超过 100 个菌落形成单位(Bfu) 。A.8 释出物对生物负载估计不利影响的检验A.8.1 检验的目的是研究从产品向悬液中释出的物质对脆弱微生物的影响，这里列举了一个方法，可用其评价获取技术是否符合 6.1.2.3 规定。A.8.2 选用灭菌产品，每一产品都应经受常规微生物洗脱技术。如果洗脱技术中用到洗脱液，则可按 A.8.3 的步骤进行，如果产品直接放人培养基中，则可按 A.8.4 进行。A.8.3 洗提液应既不促进也不抑制从产品上所获取的微生物的生长。为了确定洗提液的效果，应将已知低数量的微生物嫁接到产品上，嫁接后的产品在洗提液留置与常规生物负载测定所需相等的时间。
22、回收的微生物最终进行计数。药典中详细记载了可以使用的微生物。结果评价参见 A.8.5 。所用微生物的数量应接近 100。A.8.4 如果洗脱技术中用到洗脱液（如 MPN， 参见 A.3.3） ，可以使用药典中的细菌抑制试验。实验中，产品与少量微生物一同引进到培养基，并与常规生物负载测定所需条件相同情况下进行培养。所用微生物的数量应接近 100。结果评价参见 A.8.5 。经过一定时间，检测培养基是否生长。如果某一医疗器械中伴有抗菌物质，并可缓慢释放到培养基，那么，应适用在培养阶段后期将产品-培养基暴露于少量微生物中。A.8.5 如果嫁接的微生物数量与回收的数量差异不大，或者，细菌抑制试验中没有
23、发现微生物的生长，则应对生物负载测定方法予以重新审议。可能有必要引进稀释物、中和或者过滤来减少阻止活动，或者消除抑制性物质。A.9 物理力的负作用的检验可使用物理力从产品上获取微生物 (参见 A.2.2)。应评价这些力对生物负载估计值的影响。将物理力作用于已知数量的少量微生物上(约 100 Bfu),测出物理力对微生物计数的影响。但是还应将洗脱液对从产品上获取的存活微生物的影响考虑在内。B 生物负载方法的确认B 生物负载方法的确认B.1 重复性回收方法进行确认注：本方法使用了对产品中自然形成的生物负载进行确认过程。有时它是指“完全回收”。B.1.1 在开始对从产品上获取微生物的技术进行确认之前
24、，应将被确认的技术确定下来并形成文件。B.1.2 应对测定回收率的产品或部件进行选择。应确定针对每一产品技术，并用其估计产品上的微生物数。此方法通常是用于测定生物负载方法之一。B.1.3 确定出产品上微生物的估计值后，再将该技术应用于同一产品来确定是否还有微生物被洗下。该技术应用于同一产品的过程可重复进行一定的次数。准确的重复次数取决于若干因素，这包括产品的特性，构成生物负载的微生物和初始污染水平。预试验可用于确定重复的次数。B.1.4 在某些产品上，进行重复处理后有必要确定产品上是否还存有存活微生物。这可以通过下列方法得到:a) 用熔化的回收培养基涂在产品表面上，等到培养基变硬，然后使产品作
25、用于规定的培养条件下对 培养形成的菌落计数;或A) 将产品浸于液体回收培养基中，作用于规定的培养条件下，检查是否生长。在浸于液体培养基并培养之后，如果在产品的一小部分上出现活微生物，可以用 MPN 法的计数结果。但是如果全部结果都表明有微生物生长，则 MPN 法不适用，那么就应重新考虑确认方法。B.1.5 获取方法初始应用计数之后的群落数量，可以表述为计数之后的总群落数量的分数。总群落数量的分数，可以由所测每一产品样品计算得出，并可以用于得出回收效率。B.3 条款给出了一个示例。B.1.6 本方法的原理是生物负载估计法应重复进行，直至回收的微生物累积数量无明显增加。每重复一次后，从产品上或产品
26、部分上将洗脱液全部回收并计数。比较连续回收得到的结果。但是应注意的是，本方法不是很精确。从产品上回收的微生物数与产品上实际的微生物数间的精确关系是永远无法验证的。B.2 修正系数计算举例B.2.1 本例中，表 B.1 给出了反复处理得出用于确认的一套数据，这些数据表示了一个医疗器械的 5 个平行结果。表 B.1 某一器械平行试验中通过重复处理测得的菌落数处理 平行计数1 2 3 4 51 60 50 70 55 452 10 12 5 2 33 1 0 2 0 04 0 1 2 1 0琼脂覆盖 2 1 2 1 0平均菌落数 73 64 79 58 49B.2.2 根据表 B.1 中的数据，取下
27、率计算如下：第一次处理: 60 50 70 55 45总数 : 73 64 79 58 49回收率 /(%): 82 % 78 % 89 % 95 % 92 %平均回收率= 87.2 % 范围= 78 % to 95 %运用一种琼脂覆盖的理想情况也包括在了本计算中。某些医疗器械的特性可能会无法用琼脂覆盖。B.2.3 使用平均取下率，计算回收率的修正系数：100-=1,15 (B.1)87,2在有些应用中，可以决定使用取下率范围中最低值，以反应出最坏情况。这一决定将会影响数据的使用。B.3 产品接种B.3.1 产品接种确认B.3.1.1 由接种某一已知数量的微生物到某一产品，可以制造一个人工生物
28、负载，用以确定回收效率。微生物可以是植物细胞，但通常更多的是使用有氧细菌芽孢。使用植物微生物时，由于干燥过程降低其活性，实际应用中存在一定困难。B.3.1.2 应制备给产品接种的微生物悬液，并测定出存活计数。作为接种用微生物应能抵抗干燥，这一点十分重要，因此经常使用需氧菌芽抱。B.3.1.3 应制备该悬液的稀释液，并测定出存活计数。接种体的数量级应与产品上的自然污染相同。对具有较低生物负载的样品，悬液的适宜浓度是向产品上放 100 个存活微生物。有必要进行预备试验来确立适宜的稀释液B.3.1.4 应选择一定数量的用于测定回收率的无菌产品或部件。每一产品用一定量的微生物悬液进行接种并可以在层流条
29、件下进行干燥(如果对产品适用)。如果样品是经环氧乙烷灭菌，则应经过充分通风来降低残留物的影响。应在预试验中对从产品中洗脱出的任何具有限制影响的物质进行研究。将悬液分布于产品上时，应包括最难取下自然污染的部位。B.3.1.5 指定的生物负载测定方法用于发现脱离产品后所接种微生物的数量。 B.3.1.6 脱离后微生物的数量可以表示为接种到产品上的微生物的数量的一部分。这一部分对于每一产品都是可以计算的，并且可以用于确立回收效率。B.3.1.7 从包括直接接种的生物负载回收确认的结果，不能够完全模仿真实生物负载回收的结果。B.3.2 用于说明使用产品接种情形下矫正系数计算的示例B.3.2.1 确认时，对预试验表明生物负载非常低的情况可选择产品接种法。 B.3.2.2 制备枯草杆菌黑色变种芽抱水悬液，并用最佳培养条件测定悬液中的存活微生物数。B.3.2.3 制备悬液的稀释液，使 0.1 m L 中含有 100 个芽抱。向器械所选部分接种 0.1 m L该稀释悬液，并在层流下进行干燥。B.3.2.4 使经接种的产品在经受上述选定的洗脱技术，洗脱的平均芽抱数为 35，其范围是在25-45 之间。B.3.2.5 回收率的校正系数计算如下:100/35=2,9 (B.2)
