1、1,牛肉膏蛋白胨培养基的配制与灭菌方月琴,2,一、复习 二、实验：配培养基与灭菌 三、斜面的划线培养 四、倒平板的操作 五、平板划线培养,3,一、复习,4,5,微生物培养与检验主要课程内容,1.微生物营养需求 2.微生物形态 3.微生物纯化、分离 4.微生物培养、筛选与保存 5.微生物检验,6,课程内容,7,规则：,1.上课不迟到：第1、5节课，提前10min到教室2.下课前，自己的实验物品归类，该清洗的清洗，该收拾的收拾3.值日生负责擦黑板、扫地、擦桌；为大家做好服务工作4.上课时间请不要玩手机,8,安全操作与标准操作,9,（一）微生物培养基的制备 （二）微生物的消毒灭菌 （三）认识微生物培
2、养所需的仪器设备,10,（一）微生物培养基的制备,培养基：是人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养物质。 满足微生物生长发育的水分、C，N，生长因子，P，S，Na，Ca等 适宜的酸碱度、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位，合适的渗透压,11,根据物理状态划分,培养基分 液体、半固体和固体 3种 液体培养基有各种肉汤培养基，主要用于细菌扩大培养； 半固体培养基含0.4%琼脂，主要用于保存细菌 固体培养基含15%20%琼脂，主要用于分离细菌,12,培养基的配制原则,1.选择适宜的营养物质 实验室中常用：,13,2.营养物质的浓度及配比合适 3.控制pH条件细菌和放线菌：pH7.07.5
3、酵母菌和霉菌：pH4.56.0 4.控制氧化还原电位 5.原料来源的选择 尽量利用廉价且易获得的原料作为培养基成分,14,6.灭菌处理 避免杂菌污染，要对所用器械及工作场所进行消毒与灭菌 培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基0.1MPa，121.3 1530min,15,（二）微生物的消毒灭菌,灭菌指利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。 消毒是指用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢。 消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的目的 无菌,16,消毒灭菌方法：,（一）干热灭菌法 （二）湿热灭菌法 （三）过滤除
4、菌 （四）紫外线杀菌 （五）药物杀菌,17,（一）干热灭菌法 1.火焰灭菌法2.热空气灭菌法 14016023h,18,（二）湿热灭菌法 1.高压蒸汽灭菌法 121 2030min2.常压蒸汽灭菌法 3.常压间歇灭菌法,19,（三）过滤除菌 薄膜滤菌器0.22m和0.45m,20,（四）紫外线杀菌 240280nm波段紫外线杀菌力较强 多以253.7nm作为紫外线杀菌波长 特点：穿透力弱 超净工作台：,21,（五）药物杀菌 1.酒精 2.新洁尔灭,22,（三）认识微生物培养所需的仪器设备,1.培养平板,23,2.试管与棉塞,24,3.接种环，涂布棒,25,4.高温高压蒸汽灭菌锅,26,p42
5、高压蒸汽灭菌,请回顾灭菌锅的操作方法,27,1）用之前检查水位及水质。若水质不好，需换水 2）放置灭菌物品，勿过满；瓶子灭菌，瓶盖拧松 3）盖上锅盖，相对的两个螺帽一起拧 4）启动加热，同时打开放气阀；检查安全阀是否关上。调整温度时间121 15min。 5）待排气阀冒出大量热气并持续约25min后排尽冷空气后，再将其关闭； 6）灭菌结束，待压力下降至0，可打开放气阀，之后开盖。注意防止烫伤 7）固体物品可进行干燥；液体物品冷却后拧紧。尽量避免二次污染。,28,5.鼓风干燥箱,29,6.超净工作台,30,每次使用前，先用75%酒精（或新洁尔灭）擦洗台面，并提前用紫外线灭菌灯照射1530min处
6、理净化工作区内积存的微生物；关闭灭菌灯后应启动风机使之运转2min后再进行培养操作；工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰；使用完毕应及时清理工作台面上的物品并用酒精擦拭台面使之始终保持洁净。,31,7.微量移液器的使用,32,今天的工作：,1.固体物品的灭菌 2.配制培养基并进行灭菌 3.学习倒平板 4.学习斜面培养基制作 5.超净台的准备 6.划线接种 7.灭菌效果检查,33,开始实验,1.固体物品： 1）平皿（6只/组） 2）试管与棉塞/塑料封口（6只/组）的包扎 3）灭菌蓝色、黄色和白色枪头将以上物品放入灭菌锅中进行灭菌121 20min,34,2.培养基：,培养基分
7、 液体、半固体和固体 3种 液体培养基有各种肉汤培养基，主要用于细菌扩大培养； 半固体培养基含0.4%琼脂，主要用于保存细菌 固体培养基含15%20%琼脂，主要用于分离细菌,35,牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g 蛋白胨 10gNaCl 5g 琼脂 15-20g pH 7.4-7.6，加水至1 000mL；若需分装，需先融化，摇匀后分 于121高压灭菌1520min备用 用途：普通细菌常用的培养基,（1）固体培养基配置,36,请大家配制：,请大家查看“营养琼脂”的成分与配制说明，每组配置牛肉膏蛋白胨固体培养基150mL于锥形瓶中 请大家先写出1L的配方，然后再写出150mL的配方,37,配制完毕
8、，将配制好的培养基装入锥形瓶内，瓶口塞上棉塞，用牛皮纸/报纸包扎瓶口，标注好组别，进行高温高压蒸汽灭菌,38,（2）液体培养基,为固体培养基中不含琼脂 牛肉膏蛋白胨培养液牛肉膏 3g 蛋白胨 10gNaCl 5g pH 7.4-7.6，加水至1 000mL 于121高压灭菌1520min备用 用途：普通细菌常用的培养基,39,请大家查询LB培养基配方 每组配置LB液体培养基50mL于锥形瓶中，包扎好瓶口（纱布+牛皮纸/报纸）后灭菌 请大家先写出1L的配方，然后再写出50mL的配方,40,1.固体物品的灭菌 2.配制培养基并进行灭菌 3.学习斜面培养基制作 4.学习倒平板 5.超净台的准备 6.
9、划线接种 7.灭菌效果检查,41,3.如何倒平板,（1）超净工作台的准备 将超净工作台台面用酒精棉球擦干净；关上门后，紫外灯打开，灭菌15-30min 灭菌结束，打开风机,42,2.加热融化培养基（若为刚灭菌结束未凝固的培养基，则略） 将培养基放入微波炉内加热融化，注意观察，不要加热时间过长或温度过高，以免液体溅出。,43,4.倒平板 超净工作台灭菌完毕，关紫外灯，打开风机； 超净工作台门不能开太高，约20cm即可； 用新洁尔灭棉球擦拭工作台和手； 将酒精灯瓶外擦干净，转移入工作台； 将已融化的培养基瓶身擦干净，转移入工作台； 待培养基冷却至50C左右（不烫手为原则，但是不可冷却过度），倒平板
10、。,44,平板要求：平板平整，无凸起；平板无“挂壁”；培养基布满整个平皿 倒平板操作视频,45,平板倒制结束，静置，待凝固使用,46,4.学习斜面培养基制作,取无菌试管，倒入1/3高度的培养基，塞上盖子，斜靠，使得斜面长度34cm，待凝固后使用,47,请大家先制备4个试管的斜面培养基，然后将剩余培养基用于制备平板,48,1.固体物品的灭菌 2.配制培养基并进行灭菌 3.学习斜面培养基制作 4.学习倒平板 5.超净台的准备 6.灭菌效果检查 7.划线接种,49,6.灭菌效果检查,50,生化培养箱,为微生物培养提供恒温设备（固体培养基）,51,7.平板划线法：,取一接种环细菌，左手持平皿将盖口微开
11、，用沾有细菌的接种环在琼脂平板上划直线；接种环火焰灭菌，待冷却，再用接种环在顶端边缘划线处沾取标本继续划线，如此划45次，划毕加盖。并用蜡笔在皿底玻璃上写明接种菌名。于37培养1824h观察，注意平皿表面生长各菌落的大小、形态、边沿、表面结构、透明度和颜色等特征。,52,四区划线,53,圆形、突起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽，不透明菌落，直径12mm,54,请大家划线接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，置于培养箱1618h后取出置于4冰箱保存,55,斜面培养基接种法,将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上轻轻挑取少量菌苔退出菌种管。再伸进待接种的培养基管，进行斜面培养基接种，从斜面底部轻轻向顶端弯曲划线，不要触破培养基表面。,56,斜面培养基接种法,57,请大家划线接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，置于培养箱1618h后取出置于4冰箱保存,
