1、1,内容提纲,一、离心机的工作原理 二、常用的离心方法 三、离心机的分类与结构 四、离心机的使用和维护,2,离心现象是指物体在离心力场中表现的沉降现象。,引 言,应用离心沉降进行物质的分析和分离的技术就称为离心技术。,实现离心技术的仪器是离心机(centrifuge)。,3,第一节 离心机的工作原理,4,一、圆周运动与离心现象,向心力：做圆周运动的物体所受的外力的合力。它的大小取决于外力的大小，方向是与速度的方向垂直，指向圆心。,v:线速度; :旋转角速度(弧度秒) ; r:旋转体离旋转轴的距离(cm) ; m:颗粒质量; :物体密度; V:物体体积,F=mv2/r=mr2=Vr2,5,二、液
2、体中的微粒在重力场中的分离,颗粒静置一段时间后，受重力场影响会开始沉降运动。粒子越重，下沉越快。反之密度比液体小的粒子就会上浮，这个现象为重力沉降。,沉降速度(sedimentation velocity)：微粒在重力场中下降的速度。它的影响因素：微粒的大小、形态、密度、液体的粘度和重力场的强度。,如实验室制备血清时就可以采用室温静置的方法得到。,6,如果重力场的强度(g)足够大 ，则沉降速度足够快， 那么就可以实现生物大分子的分离。,扩散现象：重力场中扩散现象是无条件的，绝对的。特别是对于病毒和蛋白质类小分子物质，扩散对物质的沉降影响更大。如何克服？,二、液体中的微粒在重力场中的分离,7,三
3、、液体中的微粒在离心力场中的沉降,颗粒在圆周运动时的切线运动称为离心沉降。,实际上，颗粒在介质中作切线运动时，将受到介质的摩擦阻力，使颗粒在离心管中作曲线运动。,8,三、液体中的微粒在离心力场中的沉降,颗粒在离心管中的沉降速度与离心机转速有关，旋转速度越快，颗粒沉降越快。,m2r=m(2N/60)2r=42N2rm/3600,m: 颗粒质量; : 旋转角速度； N: 每分钟转头旋转次数； r: 离心半径,9,相对离心力（RCF，Relative centrifugal force）是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g” 。例如25000g，则表示相对离心
4、力为25000。,三、液体中的微粒在离心力场中的沉降,相对离心力 RCF的值 （g值）取决于转子的转速 （rpm）和旋转半径 （r, 以mm计算），可用如下公式表示,（rpm ：revolutions per minute每分钟转数，r/min）,10,由上式可见，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。,三、液体中的微粒在离心力场中的沉降,rav=( r minrmax) / 2,但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“rav”代替：,11,一般情况下，低速离心时常以转速“rpm
5、”来表示，高速离心时则以“g” 表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFav），即离心管中点的离心力。,三、液体中的微粒在离心力场中的沉降,12,三、液体中的微粒在离心力场中的沉降,由于转头的形状和设计，离心管中从管顶至管底各点到旋转中心的距离是不同的，为了计算相对离心力的数值可用平均相对离心力来表示，即同一离心转头部和底
6、部所受离心力的平均值。 离心机常有多种不同形状的转头，其各自所反映的离心力场的大小和离心沉降距离也不一样，在实际工作中应根据分离要求正确选择使用。,13,四、沉降系数,沉降系数 (sedimentation coefficient):是指单位离心力场中样品的沉降速度。它与样品的质量和密度成正比。,14,第二节 常用的离心方法,15,一、分类,制备离心方法：差速离心法密度梯度离心法分析离心方法：沉降速度法沉降平衡法等密度区带分析离心法,16,二、差速离心法 (differential centrifugation),差速离心法 (differential centrifugation metho
7、d)：是利用样品中各种组分的沉降系数不同(S)而进行分离，又称差分离心或差级离心。,17,特点 介质的密度均一； 速度由低向高，逐级离心； 分辨率不高。,二、差速离心法 (differential centrifugation),通常两个组分的沉降系数差在10倍以上。分离大小相差悬殊的细胞和细胞器，仅仅适合粗提或者样品浓缩。,优点：样品处理量较大，可用于大量样品的初级分离。,缺点：分离复杂样品和要求分离纯度要求较高时，离心次数太多，操作繁杂。,差速离心形成的沉淀（肝脏）,例,注：RCF即相对离心力。,20,三、密度梯度离心 (isodensity centrifugation),密度梯度离心
8、(isodensity centrifugation)：又称为区带离心，是将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。离心脱水机,21,按照离心分离原理，密度梯度离心又可分为两种类型：,三、密度梯度离心 (isodensity centrifugation),分类,速率区带离心法（连续密度梯度离心法),等密度离心法（不连续密度梯度离心法）,22, 分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性。,优点,三、密度梯度离心 (isodensi
9、ty centrifugation),常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖、甘油。,23,（1）速率区带离心法 (velocity sedimentation),原理,根据分离的粒子在梯度液中沉降速度（s)不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层向下沉降最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束。,24,分离密度相近而沉降速度不等的细胞或细胞器。,用途,（1）速率区带离心法 (velocity sedimentation),操作
10、注意事项,先在离心管中装入密度梯度介质。然后将预分离样品混入一起离心。 梯度液在离心过程中及离心完毕应该避免因为震动而引起的粒子再混合。 离心的时间要严格控制，如果时间过长，所有样品可能全部到达离心管的底部；离心时间不足，样品则还没有完全分离。,25,（2）等密度离心法 (isopycnic sedimentation),原理,样品颗粒在连续梯度的介质中经过一定时间的离心后，沉降到与自身密度相等的介质处达到平衡，从而将不同密度的颗粒分离。,特点,所需的力场通常比速率区带离心法大10100倍，往往需要高速或超速离心。,26,操作注意事项,预先配置介质的密度梯度溶液，将介质和预分离样品混合或者是置
11、于梯度溶液顶部，这也是等密度区带离心法产生梯度的两种方法。 离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。一旦达到了平衡，再延长离心时间也不能改变粒子的成带位置。,（2）等密度离心法 (isopycnic sedimentation),用途,分离大小相同、密度不等的颗粒（如线粒体、溶酶体的分离。）,27,例如： （1） 用注射器和滴管由离心管上部吸出。 （2） 有针刺穿离心管底部滴出。 （3） 用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品 区带抽出。 （4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。,（2）等密度离
12、心法 (isopycnic sedimentation),收集区带的方法,28,沉降速度法：主要用于样品纯度检查。 沉降平衡法：常用的测量绝对分子量的方法。 等密度区带分析离心法：主要用在核酸的分析和研究中。,四、分析离心法,分类,29,五、离心机的分类与结构,普通离心机：最大转速6000rpm左右，容量为几十毫升至几升。转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。,30,高速离心机：最大转速为2000025000rpm，最大容量可达3升。转头多样。一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心
13、室的温度可以调节和维持在040C。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。,五、离心机的分类与结构,31,超速离心机：转速可达5000080000rpm，相对离心力最大可达510000g，离心容量由几十毫升至两升，设有冷冻系统、真空系统和安全保护系统。分离的形式是速率区带离心和等密度区带离心。最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等。,五、离心机的分类与结构,32,仪器特点 转速高达70,000rpm。 日备有两种检测器，可供选择： 紫外(XL-A) ：190-800nm，高灵敏度 干涉光(XL-I
14、)：适用于没有紫外吸收之样品，如碳水化合物，高浓度样品 (50D值) 专利椭圆形全息衍射光栅、及四倍光束系统，减少散射光干扰。 采用光电倍增管，大大提高检测灵敏度。 精确可靠的控制软件及数据处理。 应用范围 绝对相对分子量测定 样品纯度，浓度测定 分子的聚和，解离分析 热动力学和流体力学参数确定 核酸，蛋白及病毒测定与分析 分子间之互相作用 污泥处理设备配合核磁共振应用,分析超速离心机,33,普通离心机：电动机、离心转盘（转头）、调速器、离心套管与底座。高速、超速（冷冻）离心机：驱动电机、制冷系统、真空系统（超离有）、显示系统、自动保护系统和控制系统组成。必要的配件为离心转头和离心管。,五、离
15、心机的分类与结构,34,（1）离心转头,角式转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。 荡平式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶（离心套管）构成。 垂直转头：其离心管是垂直放置。 区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。 连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似。,五、离心机的分类与结构,35,五、离心机的分类与结构,（1）离心转头,36,离心转头的注意事项,1.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则
16、须按规定降速使用。2.转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。,五、离心机的分类与结构,（1）离心转头,离心机转头损坏的原因 （操作或使用不当所造成的） 过速 腐蚀 金属疲劳 不平衡,五、离心机的分类与结构,（1）离心转头,38,玻璃离心管绝对不能在高、超速离心机上使用。 和管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。 管：透明度好，能耐高温消毒。但不耐强酸强碱及某些有机溶剂。主要用于万转分以上离心。 管：质地较软，透明，不能高压消毒，但不耐强酸强碱及某些有机溶剂，适合于蔗糖、甘油等密度梯度离心。因透明，利于收集。,五、离心机的
17、分类与结构,离心管的选用,39,六、离心机的使用和维护,离心方法的选择一般是根据样品颗粒的质量和密度，选择合适的离心方法。 离心机的转速和离心时间的确定：离心分离的效果除了与离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度外，实际操作时，与离心机转速、离心时间、离心介质的pH值和温度等条件有关。,40,离心机的使用和维护原则,离心机使用时要放置在平稳、坚固的台面上。 离心器支架必需在安置离心管后运转，严禁空架运转。 选择合适的转头，控制转头的转速。 按需选用离心管 注意转头内清洁，以保持平衡。 注意预冷处理 定期校准,六、离心机的使用和维护,41,离心操作的注意事项,使用各种离心机时，必须事先在天平上
18、精密地平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中。 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行。有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。,六、离心机的使用和维护,42,若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。,离心操作的注意事项,六、离心机的使用和维护,使用前一定要先阅读手册！,Refer to rotor manuals for operation,Use log books to record history of rotor use,44,七、离心方法的进展和离心机的应用,离心技术在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，而计算机的引入使得离心方法有了很快的进展。 垂直管离心法 超速离心法 短液柱离心法 细胞或者细菌的离心洗脱技术,
