1、1国家标准猪多能干细胞技术规范编制说明（征求意见稿）一、 任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会二 0 一七年国家标准制修订项目，项目编号“20171812-T-424”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，项目周期 24 个月。本标准由中国农业大学等单位共同完成。二、 目的及意义猪作为重要的人类发育和疾病研究的模式动物，具有重要的科研价值，猪与小鼠相比，与人类在胚胎发育、生理结构、神经系统，心血管系统，消化系统和全基因组上均具有高度相似性 1; 2，因此，用猪作为模式动物研究细胞治疗、组织修复与器官再生等方面具有极大的应用前景。而且与灵长类动物相比，猪的繁殖周期更短，产仔量更
2、高，更加经济，且没有伦理道德问题。另外，猪也是我国畜牧业最重要的家畜之一，猪的高新技术育种直接影响未来我国猪业，甚至畜牧业的发展。到目前为止，只有在小鼠、人和大鼠上获得了真正的 ESC，而且小鼠和大鼠 ESC 能形成嵌合体动物。由于 ESC 可以在体外长期稳定培养，容易进行基因修饰生产转基因动物，进行科学研究和实际生产，不同实验室在大动物 ESC分离培养上进行了大量研究，建立了牛、羊、恒河猴、猪等动物的类胚胎干细胞系，但至今仍未获得像小鼠 ESC 具有体内发育能力、形成嵌合体尤其是生殖系嵌合体的胚胎干细胞系，也没有一个完整的猪多能干细胞建系及检测标准，但随着高通量分子筛选技术及单细胞测序等技术
3、的发展成熟，使猪胚胎干细胞的分离建系成为可能。建立猪 nave 多能干细胞系，一方面可以作为人类 ESCs体内发育分化的模型，服务于再生医学；另一方面 nave 多能干细胞可以作为种子细胞，进行基因编辑、动物快速繁育等，从而服务畜牧业家畜育种。现有的小鼠及人的多能干细胞建系及检测标准并不通用于猪等大型哺乳动物，猪多能干细胞建系领域没有完善的行业标准来指导和规范科研工作者的2工作，因此，建立猪多能干细胞的建系及检测标准，对以猪为载体的人类器官再生医学的探索、人类相关重大疾病模型的构建及大动物的繁殖育种等具有重要意义。建立猪多能干细胞建系及检测产业共性标准，也可以规范行业行为，为后续研究提供借鉴和
4、指导。三、标准制定原则1. 本标准在制定中应遵循以下基本原则：a) 本标准编写格式应符合标准化工作导则第 1 部分：标准的结构和编写规则GB/T1.1-2009 的要求；b) 本标准规定的技术内容及要求应科学、合理，具有适用性和可操作性；c) 本标准的水平应达到国内领先水平。2. 本标准编写的依据：本标准主要依据目前猪胚胎干细胞和猪诱导多能干细胞建系的最新研究进展以及相关技术标准。四、标准工作过程1. 接到任务后，项目成员开始进行分工：文献图书资料的调研，相关法律法规的查阅，相关资料的归纳整理，标准说明的撰写，标准说明的修改和完善。2. 依据现有实验结果，结合相关法律法规，文献等内容，进行标准
5、的撰写，最终形成征求意见稿及编制说明。3. 对专家的意见进行汇总和整理，根据专家意见对标准进行修改和整理，形成最终编制说明。 五、标准主要内容本标准共包含以下五部分内容： 5.1 猪多能干细胞建系方法猪多能干细胞建系主要包括细胞来源和分离方法。细胞来源上主要包括早3期胚胎卵裂球，囊胚 ICM，附植前胚胎 Epiblast 及原始生殖细胞等。分离方法主要包括机械分割法，酶消化法、免疫外科法以及全胚接种法等。5.2 猪多能干细胞培养方法猪多能干细胞培养方法可以根据细胞状态的不同进行调整，目前，猪胚胎干细胞样细胞在形态上类似于人胚胎干细胞，呈 primed 状态，因此，其培养方法也多借鉴于人胚胎干细
6、胞培养的方法。5.3 猪多能干细胞培养体系目前研究并未获得最优的猪多能干细胞培养体系，在研究概况中我们列出了相应的已有体系及细胞状态作为参考。5.4 猪多能干细胞鉴定方法猪多能干细胞鉴定方法参考如下综述文章六、国内外研究概况6.1 胚胎干细胞定义及研究进展胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的多能性干细胞 3，根据其来源的不同，将来源于附植前囊胚内细胞团(Inner cell mass, ICM)的细胞称为胚胎干细胞，将来源于附植后胚胎原始外胚层（Primitive Ectoderm,PrE）的细胞称为外胚层干细胞（Epibla
7、st Stem Cells，EpiSCs） 。虽然二者均来自于胚胎，且均表达多能性标记，具有自我更新能力及多向分化潜能，也能够分化为外、中、内三胚层中所有的细胞类型，但是 ESCs 与 EpiSCs 在克隆形态、维持多能性所依赖的信号通路、基因表达谱系、X 染色体活化状态、代谢方式等方面具有显著差异， 2009 年，Austin Sminth 率先提出干细胞的 Nave 和 Primed 两种多能性状态，即将小鼠 ESCs 所处的多能性状态称为 Nave 状态，将小鼠 EpiSCs 所处的状态称为 Primed 状态，到目4前为止，nave 和 primed 状态依然是衡量干细胞的标准，nav
8、e 状态的干细胞比 primed 状态的干细胞具有更好的多能性状态 4。41981 年，Evans 和 Kaufman 课题组以及美国的 Martin 等分离并建立了小鼠的 ES 细胞系，这类细胞具有正常核型，能够在体外分化成三胚层的各种类型细胞，能够自我更新。为了表彰他们建立了小鼠的胚胎干细胞系，三人获得了 2007 年诺贝尔生理学或医学奖。随后，科研人员在不同物种上进行尝试胚胎干细胞建系，陆续在仓鼠 5、猪 6、牛 6、羊 7、貂 8、兔 9、大鼠 10建立了胚胎干细胞系，但是大动物如猪、牛等，或多或少都无法通过标准的干细胞检测标准，如体外形成拟胚体，体内形成畸胎瘤及通过构建嵌合体胚胎获得
9、生殖系嵌合后代。 1995 年，James Thomson 首次建立灵长类恒河猴的胚胎干细胞系，这是胚胎干细胞研究第一次到灵长类动物的跨越 11，随后的 1998 年，James Thomson 从人的囊胚内细胞团分离并建立了第一株人的胚胎干细胞系 12。但是猪的胚胎干细胞却无法证实可以进行生殖系嵌合，这是制约大动物胚胎干细胞应用的最大的障碍。6.2 猪胚胎干细胞的研究进展及应用价值从 1990 年 Evans 等开始尝试分离建立猪的胚胎干细胞系到现在已经三十多5年了，大部分研究者分离的 pESCs 均来自猪早期囊胚 ICM 或者 Epiblast，对培养体系的探索一般是基于小鼠 ES 培养系
10、统或者人 ES 培养系统，所选取的用于建系的胚胎大多是体内胚胎，也有用 IVF 胚胎或孤雌胚胎等的尝试，但一直没有可以达到生殖系嵌合的胚胎干细胞出现。猪胚胎干细胞研究进展汇总，部分引自张伟博士论文 13，有增减。胚胎来源 培养体系 饲养层细胞 多能性/分化能力 参考文献体内胚胎 DMEM; FCS; 2ME; PS STO EB 6体内胚胎 DMEM; FBS; L-Glu; 2ME; PS STO EB 14体内胚胎 DMEM; FCS; Nucleosides STO EB 15体内胚胎DMEM or DMEM199; FCS;hLIFPUF Spontaneouslydifferenti
11、ation 16体内胚胎 DMEM; FCS; 2ME; hLIF; hSCF; EGF; PDGF; TGF- PEF EB; teratoma 17体内胚胎 DMEM; FBS; L-Glu; 2ME; PS STO Spontaneously differentiation 18体内胚胎 DMEM; FCS; 2ME; PS; hLIF PEF SSEA-1; CK8/18; lamine 19体内胚胎DMEM or DMEM/F10; FBS; LGlu; NEAA; 2ME; hLIFGelatin AP 20体内胚胎 ES culture medium MEF AP 21体内胚胎C
12、ondition medium; FCS; 2ME;NEAA; Nucleoside; LIF; bFGFSTONuclear transfer, developed to blastocysts22体内胚胎DMEM; FBS; 2ME; NEAA; bFGF; hLIF; PS; nucleosidesMEF;PEF;STOInduced to differentiated into neuron-like cells23体外胚胎DMEM; 2ME; PS; NEAA; bFGF; hLIF; nucleosides; FBSMEF EB 24体外胚胎 DMEM; DMEM/F10; DME
13、M/NCSU-23; L-Glu; MEF;STO AP 2562ME; PS; hLIF; NEAA; FBS孤雌胚胎、IVF 胚胎DMEM/F10; FBS; KOSR; bFGF; hLIF MEFOCT4, NANOG, REX1, SOX2, SSEA-4; AP; EB26体内胚胎 DMEM/F12;NEAA;GLUTAMINE;P/S;2ME;bFGF MEFSSEA1;SSEA4;OCT4;NANOG;SOX2;EB;AP27体内胚胎体外胚胎-MEM ;KOSR;FGF2;EGF; InsulinTransferrinSelenium solution;2ME;NEAA;Glu
14、tamax;hLIF;ActivinAMEFOct4, Nanog, and SSEA1;EB;chimera28SCNT 胚胎DMEM/F10; FBS; KOSR; bFGF; hLIF; TSA MEF AP; EB28IVF 胚胎 DMEM; FBS; LIF;L-Glu; 2ME; CHIR; PD MEF OCT4, NANOG; AP 29体内胚、IVF 胚、孤雌胚DMEM/F10, L-Glu; 2ME; bFGF; SCF; NEAA; FBS MEFOCT4, NANOG,SOX2, REX1; AP30孤雌胚胎 MEM; FBS; bFGF; SC MEFOCT4, NA
15、NOG,SSEA-4; AP; EB; teratoma31体内胚胎 DMEM/F12;FBS;B27;FGF2;EGF;Gentamicin MEFPOU5F1, KLF4, CMYC; CDX2, TEAD432体细胞克隆胚聚合而来的重构胚ROCK inhibitor (Y-27632);bFGF; hLIF; FBS/KOSR; 2ME;L-Glu; NEAA; adenosine;guanosine; cytidine; uridineSTO;MEF OCT4, NANOG, SOX2, REX1; AP; EB 33体外聚合囊胚DMEM/F10;FBS;Glutamax;2ME;NE
16、AA;p/s;human SCF;Human FGF2MEF AP;Oct4, Sox2, and Nanog;EB 34piPSCs 为 DMEM/F10 NEAA; 2ME; MEF OCT4, NANOG, 357核供体的体细胞克隆胚bFGF; FBS; L-Glu SOX2;AP; EB5.5day IVF 胚胎KO-DMEM;DMEM/F12;Neurobasal;KOSR;L-Glutamine;p/s;2ME;NEAA;N2;B27;BSA;Vitamin C;hLIF;bFGFMEFOCT4, NANOG, SOX2AP; normal karyotypes;EB; terat
17、oma36体内胚胎 DMEM/F10;FBS;2ME;NEAA;bFGFagarose-based 3D hydrogelsOCT4, NANOG,SOX2;AP37猪胚胎干细胞因其可无限传代和多向分化能力，其应用价值主要体现在以下几个方面：1）细胞分化及胚胎发育研究2017 年来自英国剑桥的研究团队分析了猪胚胎在不同发育阶段的完整胚盘结构，发现与人类模型相匹配，与非人灵长类动物胚胎干细胞也相近。并且对比了人胚胎干细胞和猪体内胚胎发现 SOX17-BLIMP1 在原始生殖细胞 PGCs 命运决定中扮演重要作用 2， 此研究进一步阐明了猪和人在早期胚胎发育类似的发育模式，预示着猪是一种研究人类早
18、期胚胎发育，深入理解遗传病起源的理想模型。2）基因功能及信号通路研究胚胎干细胞是从胚胎中分离出来的在体外具有多向分化潜能和自我更新能力的一类细胞，因其可以稳定传代，便于进行基因编辑，所以是研究基因功能及信号通路功能的很好地模型。但是因为没有真正的猪 ESCs，已获得的 pESCs或很难稳定传代，或很难进行基因编辑，所以应用性不大。目前对于猪多能性基因功能及维持干性所依赖信号通路研究大多基于 piPSCs，但 piPSCs 因其外源基因不能完全沉默，内源多能性基因不能完全激活，所以并不能完全反映胚胎干细胞的特性。西北农林科技大学王华岩教授课题组研究发现，piPSCs 的自我更新能力的维持是通过
19、Activin-SMAD 信号通路上调 Nanog 和 OCT4 的表达来实现的 38。猪 NANOG 是由 1 号染色体上单一外显子基因（ single exon gene，SEG）编码的，其有两个子基因；一个假基因 NANOGP1 在 5 号染色体8上，启动子区高度甲基化，另一个假基因副本 NanogP2 在 1 号染色体上和Nanog 序列高度相似，但是因为缺失终止密码子故不编码有功能的蛋白 39。Esrrb 对于提高猪体细胞重编程的效率也十分重要 40。赖良学等通过CRISPR/Cas9 技术，建立了一个猪的 Oct4 报告系统，即使猪内源 OCT4 的启动子直接控制 RFP 来指示
20、OCT4 的表达，这对于产生真正的猪 ES 细胞来说是一个很重要的工具 41。3）人类疾病模型的制作与转基因猪的生产转基因动物模型对于了解人类疾病和药物筛选具有重要的现实意义，小鼠虽然在基因组上与人相似，但其生理特性，发育周期，基因表达等与人类相比有较大差距，因此并不能很好地模拟人类疾病，猪与小鼠相比，与人类在胚胎发育、生理结构、神经系统，心血管系统，消化系统和全基因组上均具有高度相似性 42。而且与灵长类动物相比，猪的繁殖周期更短，产仔量更高，更加经济，且没有伦理道德问题。传统转基因猪的生产方法十分困难且低效。如原核注射法只有 1%的注射后的受精卵能够发育为转基因猪 43。现在最常用的生产转
21、基因猪的方法是对体细胞进行基因编辑，然后通过体细胞核移植方法生产转基因猪 44。随着 CRISPR-Cas9 技术的出现及不断优化，基因编辑技术得到极大提升，许多新的人类疾病模型转基因猪应运而生，如脱发模型 45等。pES 因其可以稳定传代和便于基因修饰的特点将对转基因猪的生产有极大的推动。下表对已经报道的人类疾病模型转基因猪进行汇总 46。94）异种器官移植及器官再生研究异种器官移植对于缓解人类器官移植的供求关系失衡来说前景巨大。猪的器官大小及发育周期同人类十分相似，是良好的器官提供供体，但是除了异种的免疫排异反应需要解决外，猪本身所带的内源性逆转录病毒（PERVs）也是临床转化的一大障碍。
22、剑桥大学 Church 等利用 CRISPR-Cas9 技术敲除了全部PERVs 并且通过体细胞核移植技术获得了无 PERVs 的克隆猪 47，这证明了PERVs 在全基因组被敲除的可能性，为异种器官移植的临床应用提供了安全保障。6.3 猪诱导多能干细胞的研究进展自 2006 年首次报道诱导多能干细胞 iPSCs 后，iPSCs 技术受到了广泛的关注。用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞类型的细胞。iPS 技术是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植医学上的免疫
23、排斥问题，使干细胞向临床应用又迈进了一大步。iPSCs 技术的产生同时也给猪、牛和羊等大动物多能性干细胞的建立带来了新希望。人们希望 piPSCs 可以成为猪胚胎干细胞的可替代材料, 应用于生物医学和畜牧业。自 2009 年，piPSCs 成功建系以来 48; 49，究者除了采用逆转录病毒和慢病毒的诱导方法, 还采用了转座子、Episomal 质粒以及 microRNA 模拟体等多种方法诱导 piPSCs 50-52。诱导 piPSCs 的培养体系主要参照小鼠和人的 ESCs/iPSCs 的培养体系。使用不同的培养体系,piPSCs 会呈现不同的细胞形态。但是，目前只有 West 等报道的pi
24、PSCs, 注射到猪囊胚中可以获得嵌合体猪，但是仅用 PCR 方法对生殖系嵌合的猪进行鉴定, 缺乏更有利的证据 53。Fujishiro 等报道 nave-like 的 piPSCs 可以嵌合到早期猪胎体中, 却无法获得成活的后代 54。这些结果表明目前建立的 piPSCs 还没有达到真正的 nave 状态 。七、关键试验内容和技术指标说明 7.1 猪多能干细胞建系方法7.1.1 猪 ES 细胞建系的细胞来源 目前，用于猪胚胎干细胞建系的源头细胞目前主要是囊胚的内细胞团细胞10（inner cell mass，ICM ） , 目前报道的能够长期传代的猪的类胚胎干细胞细胞系均来源于内细胞团。此外
25、，4-8 细胞期胚胎 24、桑葚胚 21或附植前胚胎 15也可作为源头细胞用于分离培养猪胚胎干细胞，但由 4-8 细胞胚胎或桑葚胚用于建系时，胚胎贴壁率低，outgrowth 形成率低，均未获得能够稳定传代的猪的多能干细胞系。猪胚胎干细胞建系所用的胚胎主要来源于冲取的体内正常胚胎和核移植胚胎、孤雌胚胎、体外受精胚胎等体外培养获得的囊胚。7.1.2 胚胎接种方式胚胎干细胞建系过程中胚胎接种形式包括机械分割法，酶消化法、免疫外科法以及全胚接种法。机械分割法：用玻璃管拉成细针或用普通的 1 ml 注射器在显微镜下机械分离 ICM 细胞，将 ICM 细胞接种培养。 这是一种高效，经济，省时且无污染的理
26、想方法，需要操作者操作熟练技术稳定。酶消化法：链蛋白酶或机械法去除胚胎透明带后，将其置于 0.25%的胰蛋白酶细胞消化液中消化，在显微镜下将滋养层细胞开始脱落的囊胚移入培养液中，用口吸管和玻璃针分离 ICM, 接种培养。免疫外科法：用 0.2%的链蛋白酶处理胚胎 3-5 分钟，使囊胚脱掉透明带，将脱去透明带的囊胚置于抗体中，然后转入补体中，利用抗体和补体相互作用使囊胚的滋养层细胞发生免疫溶解，出去溶解的滋养层细胞，从而得到 ICM 细胞。然后将 ICM 细胞转移至 ES 培养基中接种培养。全胚接种法：猪囊胚的 ICM 很小且不明显，这样就给免疫外科法和机械分离法带来困难。因此，可以将经过自然孵
27、化或酶解法脱掉透明带的胚胎直接接种于饲养层细胞上，通过反复传代去除 TE 细胞和已分化的细胞，就可以分离到猪胚胎干细胞，这种方法的操作简单，但是由于未去除 TE 细胞，需要经过多次的传代纯化才能建系，建系效率较低。7.2 猪诱导多能干细胞建系方法猪诱导多能干细胞的建系方法主要参考 Takahashi 等文献中报道的方法 55。7.2.1 逆转录病毒包装11 GP2-293 细胞的培养，转染当天保证细胞密度在 70-80%, 分布均匀状态健康。 脂质体转染 GP2-293 细胞。在 1.5 ml 离心管中加入 200 l Opti-MEM, 按照质粒与脂质体 (1 g: 2.5 l)的比例加入
28、Lipofectamine 2000,轻轻混匀。室温静置 5 min。在另一个 1.5 ml 离心管中加入 200 l Opti-MEM, 加入 pMXs 过表达载体质粒(12g)与包装质粒 V-SVG (4 g), 轻轻混匀。室温静置 5 min。 将上述两个 1.5 ml 离心管中的液体混匀, 使脂质体与质粒形成络合物。室温静置 30 min。 弃去 T75 培养瓶中旧的细胞培养基。加入 10 ml Opti-MEM 培养基, 然后逐滴加入脂质体与质粒的混合物。将 T75 培养瓶轻轻地放回培养箱中。 转染 12 h 后, 在二级安全柜内将 Opti-MEM 更换为含有血清的 MEF 培养基
29、。7.2.2 逆转录病毒收集以及浓缩 在二级生物安全柜进行以下操作。病毒包装后的 48 h, 开始收集 GP2-293 细胞上清液, 4, 1000g 离心 5 min, 去除大块细胞碎片。 使用 0.45 m 滤膜过滤上清液至超速离心管中, 进一步去除细胞碎片。 在分子天平上配平超速离心管。 超速离心浓缩病毒。使用 T70i 转子, 4, 40000 g 速度离心 2 h。 超速离心后, 轻轻取出离心管, 拿到二级生物安全柜内打开。可以看到在离心管底有淡黄色沉淀, 用标记笔圈住。倒掉上清 , 用 1 ml 移液器吸掉残余的病毒上清。再用新鲜培养基溶解沉淀,吸到 1.5 ml 离心管中。浓缩的
30、病毒放在 4暂存。 所有实验垃圾用 5%次氯酸钠溶液浸泡处理。7.2.3 感染成纤维细胞 病毒感染的前一天准备猪胎儿成纤维细胞。 第二天观察细胞贴壁和生长状况, 细胞分布均匀和状态良好为宜。 将装浓缩病毒液的 1.5 ml 离心管, 离心 10000 g, 5 min, 4。除去血清中12的蛋白沉淀。 PMX-OCT4 、PMX-SOX2 、PMX-KLF4 和 PMX-MYC 四个因子病毒体积按照 1:1:1:1 的比例加入孔中, 再加入 1ml 新鲜培养基。最后加入 polybrene (终浓度达到 8 g/ml), 混合均匀。 12 h 后, 弃去含有病毒的培养基, 换成新鲜 MEF 培
31、养基, 这天计为 0 d。 在感染后 2-3 d, 准备饲养层细胞。 消化病毒感染后的猪成纤维细胞, 并用细胞计数仪计数。在 6 孔板的每个孔中铺上 2104 个细胞，每孔中加入 2 ml 培养基。 第二天换成 iPSCs 诱导培养基 , 开始诱导。隔 2 d 换一次培养基。 每天观察细胞生长状况, 3-4 d 可以出现明显的细胞增殖和细胞形变, 7-14 d内出现克隆。7.2.4 猪诱导多能干细胞克隆挑取 每天观察感染后的细胞生长状况。在克隆出现后, 每日观察克隆的形态。将边缘清晰, 形态饱满的克隆在显微镜下用记号笔在培养皿底下画一个圈, 做好标记。 准备饲养层细胞，使用前将培养基换成猪多能
32、干细胞培养基。此外，在一个新的 96 孔板中每孔加入 100 l TrypLE, 放 37的 CO2 培养箱内待用。在体视镜下, 把 6 孔板培养皿敞开, 在视野下将事前标记好的克隆挑至 96 孔板的 TrypLE 中消化。每个孔放一个克隆，每次挑取 20-30 个, 然后放置 37培养箱内消化 5 min。 消化后用 200 l 移液枪将克隆吹成单细胞, 并加入到准备好的饲养层细胞上, 放入培养箱内培养。7.2.5 猪多能干细胞的传代、冷冻与复苏 挑取克隆到 12 孔板中, 计为第 1 代 (P1)。待克隆长满时 , 准备传代。 提前准备好饲养层细胞。 用 Tryple 消化 P1 代细胞克
33、隆，消化 5 min 后，用含血清的 MEF 培养基终止消化, 吹散成单细胞后接种到新的饲养层细胞上培养。 有足够量的细胞时即可冻存细胞, 细胞冻存液按照梯度降温的方法，最终保13存在-196 的液氮中。7.3 猪多能干细胞培养方法不同的培养体系、不同胚胎来源、不同分离时间及分离方法等所建立猪多能干细胞系会有所不同。根据细胞的生长状态一般三到四天传代一次，根据细胞密度，每次传代比例为 1:3-1:5 或略有差异。传代的主要方式有机械切割法、胶原酶消化法和中性蛋白酶消化法，这两种酶的作用效果均较为温和。细胞冻存采用含血清的冻存液，根据细胞状态可适当调整血清比例，如细胞冻存液可按如下比例配置 Me
34、dium:FBS:DMSO=5:4:1 或 FBS:DMSO = 9:1。7.4 猪多能干细胞培养体系对于培养体系的研究主要可以分为对以下几个内容的研究：7.4.1 基础培养液包括低糖和高糖的 DMEM ，-MEM ，KO-DMEM，无血清培养基的基础培养基 DMEM/F12，Hams-F10 等。7.4.2 细胞因子目前，猪多能干细胞多被认为是 Primed 多能干细胞，Hanna 等报道用细胞因子和小分子抑制剂制备的培养液能够有效的将处于 Primed 状态的小鼠上胚层细胞和人胚胎干细胞转变为 Nave 状态的小鼠胚胎干细胞和 Nave 状态的小鼠样的人胚胎干细胞系 56，这也为开展猪 N
35、ave 多能干细胞建系研究提供了理论和技术参考。初步的研究显示，猪上胚层依赖 Activin/Nodal 信号通路维持自我更新 27 ，LIF 受体在早期猪胚胎分离得到的细胞中检测不到 57，b FGF 能结合并激活 PI3KAKT 通路 58，并对多能性的维持起重要作用 59。但是，猪在胚胎发育和多能细胞自我更新上的基因表达调控和所依赖的信号通路不同于其他物种，因此，需要深入探索影响猪多能性的关键调控因子，揭示其相关的调控网络，进而优化猪 Nave 多能干细胞体外培养体系。7.4.3 血清或血清类似物胎牛血清在小鼠胚胎干细胞的培养中有着举足轻重的作用，因此在猪胚胎干细胞的建系研究中，血清及其
36、类似物也被广泛关注。但血清中含有促进胚胎干细胞分化的因子，而血清替代物（KOSR）被认为能够更好地维持胚胎干细胞的多能性 60，因此，KOSR 也逐渐用于分离培养猪胚胎干细胞系。147.5 猪多能干细胞鉴定方法7.5.1 细胞形态特征鉴定7.5.1.1猪ES 细胞形态观察目前，大多数猪ES细胞类似于人ESCs 或小鼠的EpiSCs，克隆边界清晰，形态扁平，呈上皮样，有较高的核质比，不易用常规消化方法分散成单细胞。另一种形态的猪ES细胞类似于小鼠ES，呈典型的鸟巢状, 细胞核大，排列紧密，边缘清晰, 细胞聚集增殖。 7.5.1.2克隆形成效率检测真正的ES 细胞具有在体外不断自我更新和增殖的能力
37、，细胞克隆效率和倍增时间是检测猪ES细胞是否具有正常增殖能力的重要指标 。7.5.1.3核型分析正常猪体细胞核内有18对常染色体和一对性染色体（XY）构成，染色体在数量和（或）形态结构上出现异常称为染色体异常。核型分析是以体细胞分裂中期染色体为研究对象，将染色体按一定特征排列起来，对染色体的数量、长度、大小、臂比、着丝点位置等特征进行分析，来判断染色体数目和形态结构是否存在异常，G显带核型分析法是判断细胞在体外培养条件下染色体是否正常的检测方法之一。正常的ES细胞具有二倍体核型，但随着体外传代次数的增加、细胞培养条件不断改变、细胞自身复制等其它一些因素的影响，ES细胞的遗传特性可能会发生变化。
38、具有正常稳定的二倍体核型的ES细胞，是研究干细胞多能性机制、细胞体外诱导分化模型、临床应用及药物筛选的基础，因此，鉴定ES 细胞染色体核型是否正常尤为重要。7.5.2 多能性指标的检测7.5.2.1 分子水平和蛋白水平检测猪ESCs多能性基因的表达情况mRNA水平上应用RT-PCR方法检测细胞多能性基因OCT4, SOX2, NANOG, REX1, ESRRB, TBX3等的表达情况可作为猪 ESCs多能性的评价指标。7.5.2.2 检测干细胞表面多能性标记不同类型的细胞其蛋白表达具有差异性，因此，可以通过检测细胞特异性蛋白表达情况来作为鉴定猪ESCs的手段之一。例如， mES细胞表达SSE
39、A1,不表15达SSEA3、SSEA4 61, hES表达SSEA3、SSEA4、TRA-60、TRA-81,因此，SSEA1细胞膜表面蛋白是鉴定mES 细胞特征标记物之一，而SSEA3、SSEA4可作为hES 细胞特征标记物。ES细胞表面特异性膜蛋白SSEA-1、SSEA4, 质蛋白TRA-1-81、TRA-1-60和质蛋白 NANOG, OCT4, SOX2等的表达情况可为猪ES细胞多能性的鉴定提供参考。7.5.2.3 碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)是一种单磷酸水解酶,它能在碱性条件下水解磷酸单脂。许多研究结果表明，AP表达水平与ES细胞分化状
40、态密切相关，未分化的ES 细胞中含有大量的AP，己分化细胞中AP呈弱阳性或阴性表达 62。因此,可以用AP 染色法鉴定猪ES细胞是否类似于干细胞。猪ESCs细胞AP染色（钙钴金属沉淀法检测），颜色呈深紫色为阳性, 分化细胞没有被染色或被染成浅粉红色。7.5.3 表观修饰检测7.5.3.1 X染色体激活X染色体失活发生在雌性哺乳动物的一条X染色体上，其上基因的表达受到抑制，而X染色体上的一个编码长链非编码RNA的基因Xist，在引发雌性哺乳动物X染色体失活现象中发挥着关键作用，母本来源的 Xist基因不表达，从而使母源的染色体保持活化状态。因此，染色体失活状态可以用于判定细胞的多能性状态，Nai
41、ve状态的细胞两条染色体都处于活化状态,在分化过程中会发生随机失活，Xist基因表达上调。7.5.3.2 DNA甲基化情况检测DNA甲基化能够调节体细胞特异基因和多能性基因的表达, DNA甲基化通常抑制基因的表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达，这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因的表达调控。DNA甲基化在哺乳动物基因调控、胚胎发育和细胞重编程过程中发挥着重要作用。在ES细胞生长发育过程中，基因的表观遗传特征会发生许多修饰，促使基因表达发生改变，导致细胞具有不同的分化表型。因此，细胞多能性基因甲基化状态对于维持多能性起着至关重要的作用。7.5.3.3 端粒酶活性分析16端
42、粒是染色体末端重复DNA序列,作为染色体的“帽子”，它负责维持染色体的完整性、调控细胞分裂周期，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。端粒酶是一种核糖蛋白，具有反转录酶的活性，能延长染色体端粒的长度。干细胞利用端粒酶重塑端粒，从而维持自我更新、多向分化的能力。细胞内端粒酶活性上升，检测ES细胞内端粒酶水平变化也可以用于鉴定细胞的多能性。7.5.4 猪ESCs体内外分化能力检测ES细胞发育多能性或全能性的检测关键在于ES细胞在无分化抑制物存在的条件下能否形成各种类型的组织细胞。7.5.4.1 畸胎瘤形成能力将ESCs注射到免疫缺陷小鼠的皮下或肾囊中可在注射部位形成畸胎瘤，将畸胎瘤组织取出进行苏
43、-木精伊红染色，这种方法可以判断ES细胞是否具有向三胚层组织细胞分化的潜能。如果被注射部位形成畸胎瘤实体，说明该细胞系具有分化为三胚层组织细胞的潜能，如果未形成畸胎瘤，表明该细胞系不具备这种分化能力。7.5.4.2 拟胚体分化能力细胞在体外定向诱导分化的过程中，往往需要形成具有内、中、外三胚层结构的拟胚体（Embryoid bodies，EB) 来完成细胞分化的启动工作，然后，在特定培养条件下继续向着特定的组织和细胞分化。猪ESCs在体外悬浮培养时, 镜下可见细胞聚集成团，多呈球形，边缘完整清晰，随着细胞培养时间延长 ,细胞集落能够形成拟胚体EB, 再贴壁培养后, EB外向性生长 , 周围分化
44、的细胞形态呈多样性。免疫荧光染色检测拟胚体是否可以分化成三个胚层的细胞, a-SMA代表中胚层,SOX17 、GATA4代表内胚层,-III-Tubulin 、NSTIN代表外胚层。RT-PCR方法检测三个胚层的相关基因，内胚层基因（AFP、GATA4 、SOX17）、中胚层基因（TBX1）和外胚层基因（PAX6、SOX1）的表达情况。7.5.5 嵌合能力检测7.5.5.1 嵌合体嵌合效率检测嵌合体试验是验证ES细胞全能性的重要指标。在猪的早期囊胚中注射ES细胞后进行胚胎移植，若ES细胞能够与正常胚胎嵌合产生包括生殖系在内的各个组织器官嵌合的个体，即可证实分离到的ES细胞具有全能性。此外，也可
45、根据17后代的毛色、皮肤颜色等外观指标检测嵌合效率。7.5.5.2 四倍体补偿能力检测细胞与四倍体胚胎形成嵌合体的过程中,细胞广泛参与胚体、尿囊、羊膜、绒毛膜中胚层和卵黄囊中胚层的形成,而四倍体来源的细胞主要分布在胚外组织,如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜、胎盘等,几乎不参与胎儿本身的形成。因此,如果将细胞与四倍体胚胎嵌合,使二者的发育能力互相补偿,就有可能得到完全由细胞发育而来的个体。因而四倍体补偿实验也成为鉴定多能性细胞发育能力的黄金标准7.5.5.3 胚内和胚外发育能力检测同时具有胚内和胚外发育潜能的干细胞系称为多潜能的多能干细胞（Extended Pluripotent Stem Cells
46、），简称为EPS细胞。单个小鼠EPS细胞即可高效地嵌合到小鼠不同发育时期的胚内和胚外组织中，并发育形成各种胚内和胚外组织类型。通过四倍体补偿技术可证明单个小鼠EPS细胞能发育成为成体小鼠 63; 64。将人EPS细胞注射到早期小鼠胚胎后，能够稳定地嵌合到小鼠胚内和胚外组织中，在mRNA和蛋白水平人EPS 细胞能够向不同的细胞谱系分化。将带有荧光标记的单个猪ES细胞注射到4-8细胞期胚胎或早期囊胚，体外培养至囊胚时期，荧光检测其是否能够嵌合到ICM和TE。7.6 饲养层细胞的选择饲养层细胞作为多能干细胞的附着基质够分泌很多关键的细胞因子（如LIF,BMP4）和细胞外基质蛋白（如胶原蛋白 -IV，纤连蛋白）等在维持多能干细胞的干性和细胞附着等方面起着重要作用 65。STO 细胞系、小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、猪胎儿成纤维细胞(PEF)和猪子宫上皮细胞(PUE)常被用作为饲养层细胞，但使用较为广泛是STO细胞和MEF细胞。八、采用国际标准和国外先进标准的程度本标准采用国际标准和国外先进标准。九、与现行的法律、法规和强制性国家标准的关系本编制说明与现行的法律、法规和强制性国家标准不冲突。
