1、一、 绪论干细胞用途：用于药物的研究或毒性的检测。实验室中研究基因的控制与表达。可以用来分化培养一些治疗细胞。（一） 名词解释1. 细胞工程制药：根据细胞生物学和工程学原理，运用体外细胞培养技术定向改变细胞遗传特征，建立和创建新型细胞系（株） ，并通过专门的细胞培养方法研究细胞生命现象和活动规律，采用工程化的大规模细胞培养方法，探索生产方法和工艺，制造药用生化和生物制品。（1）细胞培养基本技术 （2）细胞工程常用技术 （3）细胞工程制药应用技术2. 生物工程：以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。第一代生物工程 近代生物工程 现代生物工程（1）发酵工
2、程 （2 ）酶工程 （3 ）蛋白质工程 （ 4）基因工程（5）细胞工程：以细胞为基本单位或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种或创造新品种；或加速繁育动、植物个体；或获得某种有用的物质的过程。、植物细胞工程 、动物细胞工程 、微生物细胞工程3. 细胞与组织培养：生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖。体外（in vitro）培养细胞工程的最基本技术4. 细胞核移植：利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂种细胞。5. 胚胎工程：以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作，主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。6. 干细胞：动物体
3、内具有分化潜能，并能自我更新的细胞。（1）胚胎干细胞：来自囊胚期的细胞团，属于全能干细胞，每个细胞可以发育成为完整的个体。（2）组织干细胞：存在于成体组织中，属单能或多能干细胞，可以定向分化为一种或几种不同的组织。7. 细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，在融合介子诱导下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。（二） 动物细胞培养标志性事件& 人物A.Barli 细胞融合 1859 黏虫生活史首例克隆动物成功的报道 1962 非洲爪蟾小肠上皮细胞的核（未受精卵）（三） 脱分化&再分化1. 脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。恢复细胞的分裂活性。高度分化的细胞，通过
4、诱导后，失去其特定结构和功能而转变成未分化细胞（愈伤组织）的过程。2. 再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下转变为各种不同细胞类型的过程。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。（四） 植物细胞工程的基础细胞全能性二、 细胞工程基础（一） 实验室设置&仪器（ 6 个分区）实验室是细胞工程研究的主要场所，应能满足：清洗 培养基制备 灭菌 储藏无菌操作 培养；等方面工作。1. 基本实验室设置（1）清洗室 （2 ）制备室 （3 ）灭菌室 （4）储藏室（5）无菌操作室：实验材料接种操作，又叫接种室。更衣间：鞋帽架、口罩缓冲间：水槽、小型仪器接种间（
5、无菌间）：超净工作台、紫外灯、接种器械（6）培养室细胞培养（动物、植物）2. 辅助实验室设置（1）鉴定室对培养材料进行细胞学鉴定和研究（2）生化分析室分析化验培养细胞产物（3）温室驯化移植3. 常用仪器与设备（二） 实验室污染1. 污染：混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括微生物和化学物质。（1）细菌污染表现：变浑浊，pH 改变。胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。（2）真菌污染表现：培养液中漂浮着白色小点，一般不浑浊。倒置显微镜下可见菌丝排列。念珠菌和酵母菌呈卵形散在细胞周边和细胞之间。（3）支原体污染表现：不易发现。电镜下可见其三层结构。部分敏感细胞生长变慢，部分变
6、圆，从瓶壁脱落。但多数无明显变化。（4）病毒污染：采用组织细胞培养法生产疫苗，如没除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。（5）非同种细胞污染（6）非细胞培养物污染（化学物质）2. 污染的鉴别（1）细菌、真菌污染的检测：肉眼观察 镜下观察 接种观察（2）支原体污染的检测：最常用电镜观察（地衣红染色）3. 污染的清除（1）使用抗生素：预防比污染后再用好。联用比单用好。（2）加温处理：支原体41（3）使用支原体特异性血清（4）其他方法三、 动物细胞与组织培养（一） 定义1. 动物细胞培养：从体内取出组织，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法
7、。常泛指：所有体外培养的统称。分类：器官培养、组织培养、细胞培养2. 细胞培养：用机械或化学的方法将组织分散成单个细胞而进行的培养。（1） 群体培养：将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单细胞或单细胞悬液。（2） 克隆培养：将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。3. 组织培养：把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。4. 器官培养：将活体中器官或一部分器官取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。优点：理化环境可控。细胞经培养后特征均一。培养物可直接被
8、观测。提供大量均一的细胞供制备用。便于进行人工筛选。缺点：与体内环境仍存一定差异，细胞形态或功能会发生改变。防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！动物细胞的特性（和微生物比较）：大，无细胞壁。生长慢，易污染。需氧量少，对剪切力敏感。以聚集体存在。原代50 代死亡。（二） 标志性事件Carrel 鸡胚浸出液 细胞生长促进效应 无菌技术引到组织培养技术中Thomson 1914 器官培养法Earle 1940 无限传代 C3H 小鼠的结缔组织细胞系1. 开始：1907 Harrison 用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元。2. 成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如 Hela
9、 细胞系。3. 研究内容：细胞内活动和流动，外界对其影响，细胞间互相作用等。4. 关键：无菌操作。（三） 体外培养细胞的分型（根据：形态特征）1. 贴附型细胞：（1）成纤维型 （2）上皮型 （3）游走型 （4）多形型2. 非贴附型（悬浮型）细胞（四） 接触抑制&密度抑制1. 接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。2. 密度抑制：培养细胞一代生长过程。（1）游离期 （2 ）指数生长期 （3 ）稳定期 （4 ）衰退期（五） 培养群体生命图（六） 原代培养期&传代培养期1. 原代（初代）培养期：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续14 周。特
10、点：（1）细胞移动较活跃。 （2）异质性。 （3）细胞与体内相应细胞性状相似。（4）是检测药物的很好实验工具。2. 传代培养期：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。（七） 细胞株&细胞系1. 细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。2. 细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。（八） 动物细胞培养条件1. 培养细胞的生存环境：（1）环境无毒和无菌。 （2）适宜的温
11、度：3537。（3）气体环境和氢离子浓度：pH7.27.4。 （4）渗透压。 （5）营养物质。 （6）其它。2. 培养液的营养成分：（1）氨基酸。 （2）盐类：Na、K、Mg 离子。 （3）葡萄糖：供能。（4）缓冲系统。 （5 ）生长因子。 （6 ）其它成分。（九） BBS&常用液1. 天然培养基（血清、血浆、组织浸出液、水解乳蛋白）培养常用溶液：（1）平衡盐溶液（BSS ）：PBS、Ringer功效：维持渗透压。提供缓冲系统。提供水分和无机盐。（2）其它常用液：消化液：胰蛋白酶、EDTA、胶原酶溶液。HEPES 氢离子缓冲剂：调节 pH 值。NaHCO 3 溶液：调节 pH 值。抗生素液：防
12、止污染。2. 人工合成培养基：化学成分明确的培养基，便于重复和标准化管理和控制。（1） 基本成分：氨基酸、维生素、糖、无机离子等。（2） 常用培养液：199 培养液、Eagle 培养液、RPMI1640 培养液等。（十） 取材方式1. 分离法2. 消化法（十一） 组织块培养法&单层细胞培养法1. 原代培养（1） 原代细胞的培养：1）取材（幼体较成体、分化程度低较高、肿瘤细胞较正常易）2）分离：组织块分离机械法：切割分离法：适用组织块培养机械分离法：适用某些软组织如脑、胚胎和一些肿瘤等消化法：胰蛋白酶消化法：适用消化细胞间质较少的软组织、羊膜、上皮、肝、肾等胶原酶消化法：适用结缔组织螯合剂消化法
13、（EDTA 法）：适用 消化分离传代细胞细胞悬液分离（血液、羊水、胸水、腹水）：离心法（5001000rpm，510min ）（2） 组织块培养法：粗切细切冲洗，自然沉降留少许 BSS翻转干涸法（置 37温箱中） 继续培养移入培养瓶中并吸净 BSS 细胞生长薄层营养液培养法培养 24 小时后补液（3） 单层细胞培养法（消化培养法）：切成 23cm3 小块温消化加胰蛋白酶 37消化 14 小时滤过清洗静沉去上清 离心去上清冷消化加胰蛋白酶 4消化 624 小时2. 传代培养（1） （首次）传代：使原代细胞经分散接种的过程。生长密度不高不能急于接种。胰蛋白酶消化注意时间。吹打要轻巧。pH 不能高，
14、宁可偏低些。首次接种细胞数量要多些。（2）常规传代：1 ）贴壁细胞：消化法 直接吹打法 刮除法2）悬浮细胞：直接吹打法 自然沉降法（十二） 细胞档案的建立以美国 ATCC 细胞库的标准，必须有以下的鉴定数据，才能入库：组织起源和已经传代的代数 冻存液 细胞活力 培养液：培养基、血清和抗生素融解后细胞生长特性 接种存活率 细胞形态 核型 无菌检测：细菌、真菌等物种检测：检测同工酶谱 反转录酶检测 细胞建立者 检测者（十三） 单细胞分离培养常用培养技术：悬滴培养法 培养瓶培养 旋转管培养法 灌注小室培养法培养细胞的名称：组织来源 人名 时间地点 临床疾病类型培养细胞的纯化：自然纯化 人工纯化 酶消
15、化法 机械划除法 反复贴壁法克隆法，培养基限定法，流式细胞分离法等将细胞制成细胞悬液接种培养后让细胞分散在底物上适应性和活力好的细胞能增殖形 静沉去上清加新消化液 37消化（2030 分钟）静沉去上清加营养液并吹打计数接种培养加培养液并吹打 第一步离心后：中和（BSS）离心成细胞小群（克隆）1. 单细胞分离培养：又称为细胞克隆，即把一个单细胞从一个群体中分离出来单独培养，使之重新繁衍成为一个新的细胞群体的培养技术。2. 细胞群中单个细胞形成的克隆的百分数称为克隆形成率或接种率，用来表示细胞生活力和独立生长能力。 培养基表面形成的克隆数 测得的细胞总数3. 提高克隆形成率的措施：（1）培养基：最
16、后使用适应性培养基，即不含细胞而被细胞生活过的培养基。（2）利用饲养细胞：饲细胞即滋养细胞，一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。（3） 其他：血清、激素、CO 2、底物特殊处理、适应性底物、接种密度。4. 技术方法：（1）有限稀释法：制备细胞悬液，密度为 10 个细胞/mL。（2）毛细管法。（3）将细胞接种在不同的接种底物上。底物 适用多孔培养液单层琼脂双层琼脂单细胞分离饲细胞 单细胞分离，克隆形成率软琼脂 克隆形成率（转化细胞）碟皿（聚苯乙烯或玻璃制） 克隆形成率5. 细胞转化：细胞发生遗传性改变的一种变化。其性状可以代代相传，能够长期维持和存在。分为一般转化和恶性转化。6. 细胞自
17、发转化：没有使用任何诱变剂处理下，细胞自发出现的转化现象。7. 人工诱发细胞恶性转化：利用化学、物理或生物的各种致癌物人为诱发细胞发生恶性转化。诱变剂（致癌物）：（1）物理因素：放射线。（2）化学因素：亚硝胺类、多环芳烃、氯乙烯等。（3）生物因素：黄曲霉素、多发瘤病毒等。（4）促癌剂：十二癸豆蔻（TPA）（5）间接致癌物：需经过酶活化才会形成终末致癌物。8. 细胞转化的过程：（1）诱发阶段 （2）DNA 的损伤与修复阶段（3） “转化灶”的产生。人工诱发转化实验的程序：低血清培养。9. 肿瘤细胞的培养方法：（1）原代培养：取材肿瘤细胞集中、活力好的部分。防止污染（交叉） 。及时去除成纤维细胞。
18、（2）传代培养：不要急于传代（长满培养瓶表面） 。100%适当提高接种密度。消除成纤维细胞。（十四） 动物细胞药物试验（5 个等级、观测指标、测 IC50&趋势图）1. 细胞培养的药物试验（动物细胞培养的应用）（1） 优点：可以直接用人细胞作为测试对象。细胞的均一性好。获结果迅速。可结合多种技术方法测知药物效应。比动物试验经济。（2） 注意事项：体内和体外环境不同，药物试验的结果可能有所偏差。比较适用于单质药物的测试。非水溶性药物测试的溶剂，应设溶剂对照组。2. 药物剂量：先测出半效应量 IC50（梯度数值测试，常用 MTT 法测定） ，取 作为主IC5010要测试剂量。3. 细胞生长的 5
19、个等级：04 度。观测指标：（1）化学成份 （2）形态结构（3） 生长和增殖速率 （4）细胞死亡4. 细胞培养在癌症研究中的应用：（1）利用人工转化研究癌变的原理。（2）抗癌药物的检测。 （3）癌基因的研究。5. 药物疗效的评价：（1）体外抑瘤试验：IC 5010g/mL。最高抑制效 80%以上。判断：样品对细胞有杀伤作用。（2）体内抑瘤试验：瘤重抑制率=（1- ）100%试 验 组 瘤 重对 照 组 瘤 重中草药抑制率大于 30%，合成药大于 40%疗效为生命延长率=（ -1）100%试 验 组 存 活 天 数对 照 组 存 活 天 数5. 药物敏感性试验：（1）美蓝法：原理活细胞脱氢酶使甲
20、烯蓝还原为甲烯白。死细胞蓝（2）染料排斥试验法：原理活细胞在低浓度染液中不着色。0.2%台盼蓝或 0.1%的伊红（3）生长曲线测定法：原理癌细胞可以呈指数生长。加药后药物影响可通过生长曲线反映。可获得三方面数据：药物对增殖细胞的杀伤率= 100%N0-N0N0药物对倍增时间的影响：T D=tlog2logNt-logN0药物对细胞生长饱和密度的影响：N s=细 胞 数cm2或 mL（4）集落形成试验法：集落抑制率=（1- ）100%试 验 组 集 落 形 成 率对 照 组 集 落 形 成 率在半对数纸上以集落抑制百分率与剂量对数作图可以得一条 S 形曲线并求出药物的 IC50 值。集落存活分数
21、= （计算 IC50 的方法之一）试 验 组 集 落 形 成 率对 照 组 集 落 形 成 率（5）四唑盐（MTT）比色法：细胞存活率= 100%试 验 组 OD值对 照 组 OD值（计算 IC50 的方法之二）（6）ATP 生物发光法：ATP 作用于荧光素荧光色素氧化酶。（计算 IC50 的方法之三）（7）放射性同位素掺入法（8）抗癌药的效能比测定法：药物效能比=造 血 细 胞 的 D0肿 瘤 细 胞 的 D0如果效能比=1，表示该药物对细胞杀伤无选择性。6. 裸鼠移植瘤试验理想的体内试验模型（非细胞试验）：小鼠骨髓基质集落形成细胞（CFU-F）疗效评定以治疗结束时给药组瘤体积小于对照组 5
22、0%或存活天数超过对照组的 50%，才认为有效。7. 不同的抗癌药物的生物效应指标选择：（1）生物化学成分 （2）形态结构（3）生长和增殖 （4）细胞死亡8. 癌基因的研究：转染技术（磷酸钙法、脂质体法、原生质体法、显微注射法等）（十五） 动物组织培养的进展1. 无血清培养技术（1） 原因：血清干扰性（2） 应用：生长因子、单抗制备、分泌产物等EGF：表皮生长因子，促有丝分裂，改善表皮角质细胞的培养。FGF：成纤维细胞生长因子，促有丝分裂，稳定表型，延缓衰老。IGF：生长调节素，促进运输，促肝细胞分裂，促鸡胚细胞分化。PDGF：血小板生长因子。（3） 组成：基础培养液、辅加成分（4） 无血清培
23、养的操作中注意问题：成分活性 传代频率 接种密度经常检测 试剂纯净2. 大规模细胞培养技术：常用的方法有三类：单层静置贴壁培养法 悬浮培养法 固定化培养法3. 特种细胞组织培养（1） 表皮细胞的培养：切割消化分离真皮和表皮消化培养（2） 肝细胞：初代组织块培养 初代消化法培养（3） 软骨细胞：切碎软骨组织透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶消化两遍胶原酶长时间收集F12 培养液（4） 成骨细胞（5） 神经原细胞：取新生大鼠脑，接种于聚 L-赖氨酸覆底的培养皿内4. 种质资源的长期保存（1） 细胞冻存：培养液+保护剂（甘油或二甲基亚砜）要点：慢冻快融。 防护剂依细胞而定。（3） 细胞运输：液氮或干冰贮存
24、运输。充液法（十六） 大规模培养1. 大规模培养系统的类型：（1）批量换液（分批培养） （2 ）半连续批量培养系统（3）连续灌注法 （4）连续-流动培养系统2. 大规模培养细胞的方法（1）单层静置贴壁培养法1）优点：易换液 易观察 便于采用灌注技术培养液/细胞比例易改变 易适应环境2）缺点：规模受限 取样、计数困难 控制 pH 和 O2 困难 占空间 易污染3）方式：转管及转瓶培养 旋转圆柱管培养（2）固定化培养法：与单层贴壁不同、固定在一定空间内1）优点：易更换培养，易进行灌注。细胞和培养液易分离。细胞密度大，易制备产品。2）缺点：难传代和扩大生产3）方式：多层培养法：原理提供大量的细胞生长
25、面积微载体培养法：原理载体携带细胞呈悬浮状，增加细胞附着面积，使细胞与培养基充分接触中空纤维培养法：原理采用合成的中空纤维制成类似脉管分布扩散系统玻璃珠床反应器：原理使细胞贴附在玻璃珠表面包埋细胞培养法：原理使细胞包埋在有孔微载体内（3）悬浮培养1）优点：可扩大生产 与营养充分接触 条件稳定均一 连续密闭系统可长期连续培养 细胞保持生物学特性2）细胞对悬浮培养的适应：悬浮培养对造血细胞、淋巴细胞、白血病细胞、类淋巴细胞是最适合的，但对贴壁细胞，需经适应。3）选择法：悬浮贴壁再悬浮再贴壁反复多次4）适应法：悬浮浓缩再悬浮2. 固定化&贴壁 &悬浮：异同、特点、优缺点比较（结合 4 种培养系统）（
26、十七） 观察&检测1. 常规观察：（1）肉眼观察 （2）显微镜检 （3）生长状态2. 活细胞观察：（1）相差显微镜直接观察。 （2）暗视野显微镜技术观察活细胞。（3）缩时摄影直接记录动态变化。 （4）离体活细胞染色。3. 细胞固定观察法：（1）细胞固定基本方法：以盖片培养最常用。（2）常用染色方法：H.E（苏木精 -依红）染色法Giemsa 染色法（3）特殊染色方法：Feulgen 染色法 免疫荧光染色法免疫酶染色法 细胞银染色法 考马斯亮蓝染色法4. 细胞生长状况：（1）细胞计数 （2）生长曲线（3）细胞分裂指数 （4 ）细胞贴壁法 （5 ）细胞周期时间测定 细胞活力指标 贴壁存活细胞 用同
27、位素标记，流式细胞仪测定细胞周期接种细胞5. 细胞化学检测法：（1）四唑盐（MTT）比色法。 （2 ）细胞蛋白质含量测定法。（3）细胞蛋白质合成的 3H-亮氨酸掺入试验。 （4）细胞 DNA 合成测定。6. 细胞转化及恶性程度检查：软琼脂培养法四、 细胞融合&单克隆抗体Okada 1958 紫外灭活的仙台病毒可引起艾式腹水瘤细胞融合Harris（一） 细胞融合1. 定义2. 方式（二） 单克隆抗体（三） 制备过程（筛选 2 种）（四） 原理（五） 应用五、 植物细胞工程1. 植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式，二是激素调控模式。2. 微繁/快繁技术、花药培养技术、次生产物生产3. 细胞学说：施莱登、施旺；细胞全能性学说：哈贝尔兰德（Haberlandt）4. 植物组织培养和动物细胞培养的比较100%项目 原理 培养基 结果 培养目的植物组织培养 细胞的全能性 固体；营养物质；激素培养成植物株 快速繁殖，培育无病毒植株等动物组织培养 细胞的增殖 液体；营养物质；动物血清等培育成细胞系或细胞株获得细胞的产物或细胞等
