1、第二章 基因工程的载体和工具酶第一节 载体引 言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体” 及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：载体必须是复制子。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具备多克隆位点（MCS） ，便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。一、质粒载体（一）质粒的生物学特性（1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和 RNA） DNA 分子。广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植
2、物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有 F 质粒（F 因子） 、R 质粒（抗药性因子）和 Col 质粒（大肠杆菌素因子）三种。（2）质粒的大小差异很大，最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3 种蛋白质分子，最大的达到 200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好” 地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）,拷
3、贝数为 1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为 10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。（5）质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 质粒的转移 转移性质粒，含有 tra 基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。非转移性质粒，不含 tra 基因；可以为转移性质粒所带动转移。（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，（二）质粒 DNA 的制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。目前一般使用碱变
4、性法制备质粒 DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开及除去蛋白质和 RNA。1.碱变性法质粒提取的原理：根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在 pH 值 12.012.5 范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不会被变性。通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒 DNA。2.碱变性法提取质粒的步骤：（1）取 1.5 毫升含质
5、粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；（2）加入 100 微升冰冷的溶液 I， （50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。（3）加入 200 微升新配制的溶液 II， （0.2M NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温 5 分钟。（4）加入 150 毫升冰冷的溶液 III， （醋酸钾 29.4 克，冰乙酸 11.5 毫升，加蒸馏水至 100 毫升）颠倒离心管 10 次后，冰浴 5 分钟。（5）离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒 DNA。（三）质粒载体的改造去掉不必要的 DNA 区段。减少限制酶的识
6、别位点，一种酶只保留一个。 （单一的限制性酶切位点） 。加入易于捡出的选择性标记基因。对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。改造或增加基因表达的调控序列。1、质粒 pBR322结构：（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr 或 Apr） 内部有 3 种限制酶单一识别位点 。（2）四环素抗性基因（tetr 或 Tcr）内部有 7 种，启动区内有 2 种限制酶单一识别位点 。（3）DNA 复制起点（ori）pBR322 质粒的优点：（1）具有较小的分子量。4363bp，2.6106Da，（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 （3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中
7、可累积 10003000 个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。 2、pUC 质粒载体1987 年，J.Messing 和 J.Vieria 采用 MCS 技术在 pBR322 基础上构建的。结构：（1）来自于 pBR322 的 Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(amp r)。 但核苷酸序列发生了变化（3） LacZ基因 编码 半乳糖酶的 肽链即氨基末端。（4）MCS 区段是一段用于插入外源 DNA 片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。与 pBR322 相比， pUC 质粒载体优点：（1）具有更小的
8、分子量和更高的拷贝数如 pUC8 为 2 750bp，pUCl8 为 2 686bp，控制质粒复制 rop 基因的缺失，平均每个细胞即可达 500700 个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过 -互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。二、噬菌体载体（一） 噬菌体载体1. 噬菌体的生物学特性烈性噬菌体：只具有溶菌生长周期温和噬菌体：具有溶源生长周期和溶菌生长周期溶菌周期指噬菌体将 DNA 注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的
9、噬菌体 DNA 是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体 DNA 被称为原噬菌体。2. 噬菌体的生物学特性组成：蛋白质外壳和线状双链 DNA 分子组成。 DNA 长度为 48502bp，在分子两端各有 12 个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形 DNA 分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为 cos 位点（cohesive end site ）.是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期
10、。复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是“” 复制，晚期进行滚环复制基因组成DNA 至少包括 61 个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约 13 为非必须区段。3. 噬菌体载体的类型插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到 10kb置换型 （Replacement vectors ）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的 DNA 区段是 噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的 DNA 取代。如 Charon 4 载体克
11、隆能力大，2025kb（二）M13 噬菌体1、丝状噬菌体 M13 噬菌体的生物学特性是单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组 DNA 长约 6.4kb，可分为 10 个区和 507 bp 基因间隔区（IS 区） ，该区可以接受外源DNA 的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链 DNA 载体的重要前提。复制与增殖（图）2. M13 噬菌体载体的构建 在 IS 区内插入 LacZ 基因 在标记基因区内组装 MCS 区段所以能通过 互补在 X-Gal/ IPTG 平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19 等这类载体的突出优点在于
12、其既可以提供单链 DNA，也可以提供双链的 DNA。其最大的不足在于插入大的 DNA 片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在 1kb 之内，克隆 300-400bp 的片段十分稳定。（三）柯斯质粒载体1.柯斯质粒载体的特点柯斯质粒是一类人工构建的含有 DNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid 是 cos site carrying plasmid 的缩写。柯斯质粒的大小为 4-6kb，由 3 部分组成：A.多克隆位点区B. 含有 cos 位点的 DNA 区C. 复制起始位点和抗性标记区2.柯斯质粒载体的特性1、具有 噬菌体的特性 柯
13、斯质粒连接上适宜长度的外源 DNA 后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的 DNA 也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。3、高容量的克隆能力 cos 质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和 cos 位点等构成，所以其克隆上限可达 45kb 左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到 30kb。四种常用载体的比较质粒 噬菌体 柯斯质粒 单链噬菌体克隆 DNA 大片段 * + + -构建基因组文库 -
14、+ + -构建 DNA 文库 + - - -常规的亚克隆化 + - - -构建新型的 DNA 结构 + - - -序列分析 + - - +单链探针 +* - - +外源基因在大肠杆菌中的表达 + - - -第二节 基因操作的工具酶一、 限制性核酸内切酶及其应用（一）限制性核酸内切酶的发现当 (k)噬菌体侵染 E.coliB 时，由于其 DNA 中有 EcoB 核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而 E.coliB 的 DNA 中虽然也存在这种特异序列，但可在 EcoB 甲基化酶的作用下，催化 S-腺苷甲硫氨酸（SAM ）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB 核酸酶不能识
15、别已甲基化的序列。最早分离出的限制内切酶是在 1968 年，Meselson 和 Yuan，大肠杆菌 B 和 K 菌株，EcoB 和 EcoK， 是 I 型的，没有实用价值。首个 II 型限制内切酶是在 1970 年，由 H.O.Smith 等从 Heamophilus influenzae 的 Rd 菌株中 Hind II 。使得 DNA 分子的体外精确切割成为可能。从此，相关研究展开。如 NEB 公司的提取和克隆。目前已纯化出 3000 种限制性内切酶中，其中有 30%是在 NEB 发现的 。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链 DNA
16、 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。切开的是 3，5磷酸二酯键。（二）限制性核酸内切酶的分类分为 I 型、II 型和 III 型。（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3 个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌 Escherichia coli 表示为 Eco , 流感嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如 EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如 Eco R I、 Hind III。（四
17、） II 型限制性核酸内切酶的基本特性1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的 DNA 识别位点，通常是由 48 个核苷酸组成的特定序列（靶序列） 。2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的 DNA 分子） 。与 II 型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端：cohesive ends 是指 DNA 分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平 末 端 ：Blunt end 在识别序列对称处同时切开 DNA 分子两条链，产生的平齐
18、末端结构。则不易于重新环化。 同裂酶：isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶：isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如 BamH I 、Bcl I、Bgl II 和 Xho I 是一组同尾酶。注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。（五）限制性核酸内切酶的消化反应一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为 37）下，1h 内中完全降解 1
19、 g DNA 所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有： DNA 的纯度 DNA 的甲基化程度 酶切反应的温度（通常为 37 ） DNA 的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液 在“非最适的” 反应条件下 ,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动” ，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割 DNA 分子，这种现象叫星号活性。用*表示。 二、 DNA 连接酶及其应用（一）DNA 连接酶的发现环形 DNA 分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。首个 DNA 连接酶(ligase)大肠杆菌 DNA 连接酶，是 1967 年发现的，是大肠杆菌基因编码。1970 年，发现了
20、 T4DNA 连接酶，由大肠杆菌 T4 噬菌体基因编码的。（二） DNA 连接酶作用特点1. 连接的两条链必须分别具有自由 3OH 和 5P，而且这两个基团彼此相邻；2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coli DNA 连接酶 连接具互补碱基黏性末端 (最初研究表明） ，现在研究可连接平末端；需 NAD+辅助因子，活性低，不常用。T 4DNA 连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端，需 ATP 辅助因子，活性高，常用。（三） DNA 连接酶的反应条件影响连接效率的因素有：1. 温度（通常在 4-15 ）2. ATP 的浓度(10ML - 1M L )3. 连接酶浓度（一般平
21、末端大约需 12U，黏性末端仅需 0.1U）4. 反应时间（通常连接过夜）5. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1151） （四）T4 DNA 连接酶对目的 DNA 片段和载体连接的一般方案1连接反应一般在灭菌的 0.5ml 离心管中进行。210l 体积反应体系中：取载体 50-100ng，加入一定比例的外源 DNA 分子（一般线性载体 DNA 分子与外源 DNA 分子摩尔数为 1151） ，补足 ddH2O 至 8l。3轻轻混匀，稍加离心，56水浴 5min 后，迅速转入冰浴。4加入含 ATP 的 10Buffer 1l，T4 DNA 连接酶合适单位， 用 ddH2O 补至 10l，稍加离心，
22、在适当温度（一般 14-16）连接 8-14hr。三、DNA 聚合酶及其应用（一）大肠杆菌 DNA 聚合酶 I是 Kornberg A. 1956 年首先从大肠杆菌 E。 Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3 种不同的酶活力：A. 5 3聚合酶活性（模板， 带 3OH 游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ） 。B. 双链特异性的 53核酸外切酶活性。C. 35 核酸外切酶活性。从游离的双链或单链 DNA 的 3端降解。不过对于双链的降解可被 5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的三种用途1.利用缺口转移法制备高比活度的 DNA 探针
23、 利用其 5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。2.用于 DNA 连接前的大缺口填充 利用 5-3的聚合酶活性。3.用于 DNA 的序列分析 利用 5-3的聚合酶活性。（二）Klenow 片段酶Klenow 片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为 76KD 。酶催活性：5 3 的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性Klenow 片段的主要用途（利用 5 3 的聚合酶活性）：修补限制性酶消化 DNA 形成的 3隐蔽末端标记 DNA 片段的末端底物用32PdNTPs cDNA 克隆中第二链 cDNA 的合成DNA 序列的测定（三）T4 DNA 聚合酶T4DNA
24、聚合酶是从 T4 噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，1.酶催活性：53的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高 200 倍。比 Klenow 片段酶强 1001,000 倍。 因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如果反应体系中仅存在一种 dNTP 或没有底物时，这时 T4DNA 聚合酶就会表现出 3 5 外切酶活力，从双链 DNA的 3开始降解，直到露出底物 dNTP 相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。2.T4DNA 聚合酶的用途(1)利用取代合成反应制备探针(2)标记具有平末端的或具有 3隐蔽末端的 DNA 片段利用较强的 3
25、 5 外切酶活性和 53聚合活性(3)用于 DNA 序列分析（四）逆转录酶（反转录酶）逆转录酶 是一种依赖 RNA 的 DNA 聚合酶。此酶首先是 1970 年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的Nature杂志上。最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）分离出来的。活性：一种可以有效地将 mRNA 反转录成 DNA 的酶，其产物称为 cDNA(complementary DNA).主要用途是 将 mRNA 转录成 cDNA 以制备基因片段。四、修饰性工具酶（一）末端转移酶（terminal transferase） 末端转移酶是一类不依赖于 DNA 模
26、板的 DNA 聚合酶。 特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到 dsDNA 或 ssDNA 的在 3OH。特别是对于平末端的双链 DNA 末端加尾十分有用。 最常见的用途：给外源 DNA 片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。（二） SI 核酸酶（ SI nuclease）这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离的高度单链特异的外切酶。活性：可以降解单链 DNA 或 RNA 或双链的单链区。其主要用途有： 在 cDNA 合成过程中，切开 cDNA 的发夹末端； 载体构建过程中，切去 DNA 片段的单链尾巴，形成平末端结构。（三）碱性磷酸酶从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphatase）简称 BAP。 从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（ Calf Intestinal Alkaline Phosphatase） ，简称 CIP，用的广泛。酶催功能：脱磷酸作用，将单链或双链 DNA 或 RNA5P 转化成 5OH。其主要用途有：在用 32P 标记 DNA 5端之前，去除 5端的磷；在 DNA 重组技术中，去除 DNA 片段的 5磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。
