1、第九章 基因的检测核酸（nucleic acid）是一类重要的生物大分子，担负着生生命信息的储存和传递，是生命化学研究的一个重要领域。核酸是一种线性多聚体（linear polymer）, 其基本结构单元是核苷酸（nucleotide）。核苷酸由含氮有机碱、糖和磷酸三部分构成。 根据所含糖种类不同，核酸可分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）两大类。,核酸基础一、碱基,二、戊糖,一般情况下C1-O-C4在一个平面而C2和/或C3通常偏离平面,内式构象中C2和/或C3偏离平面的方向与C5相同；外式构象中C2
2、和/或C3偏离平面的方向与C5则相反,三、核苷核苷由戊糖和碱基缩合而成，戊糖C1与嘌呤的N9或嘧啶的N1以糖苷键相连接。常见的核苷及名称见下图。核苷中的碱基平面可绕N糖苷键旋转，形成不同的构象，这种构象由扭转角不同产生。,核苷由戊糖和碱基缩合而成，戊糖C1与嘌呤的N9或嘧啶的N1以糖苷键相连接。,四、核苷酸,核苷酸是核苷的磷酸酯，磷酸以酯键连在C5上。一磷酸核苷可简写成NMP（N为碱基）或dNMP；二磷酸核苷有一个焦磷酸键，以酯键连接在C5上，可简写成NDP或dNDP；三磷酸核苷简写成NTP或dNTP。核苷三磷酸和核苷二磷酸是富含高能键的化合物，参与核酸合成及供能反应等。,生物体内存在的游离核
3、苷酸多是5-核苷酸。但用碱水解RNA时，可得到2-和3-核糖核苷酸的混合物。生物体内还存在环核苷酸，如cGMP、cAMP，它们参与细胞内信息传递。,五 DNA 和RNA,五 DNA 和RNA单核苷酸通过磷酸二酯键共价连接形成的线性多核苷酸聚合物即DNA和RNA。在DNA和RNA分子中一个核苷的5-OH与另一个核苷的3-OH通过磷酸二酯键连接。因此，核酸骨架是由磷酸和戊糖连接而成的磷酸酯。碱基则可看作是这一核苷上的连接基团。DNA和RNA链有两个不同的末端；分别称为5和3末端，因此空们具有方向性。5指5端缺少一个核苷酸，3指3端缺少一个核苷酸,DNA和RNA中磷酸基的pKa接近0，因此在pH7时
4、可被电离，使核酸带有负电荷并呈酸性。DNA和RNA中的戊糖对其稳定性影响较大，RNA中的2-OH使其磷酸二酯键对碱敏感，而DNA中的2-脱氧核糖使其对碱不敏感。这一性质可用于除去DNA中的RNA分子及碱变性制备单链DNA。,七、核酸成分的表示方法1、碱基碱基可用单字符号（A、G、C、T、U）表示，也可用三字符号即英文名称前三个字母表示，如腺嘌呤（adenine）为Ade。2、核苷核苷用单字符号（A、G、C、U）表示，脱氧核苷则在单字符号前加一小写的d（dA、dG、dC、dT）。修饰核苷的取代基团用英文小写字母表示，碱基的取代基团符号在核苷单字符号的左下角或右上角或上面。核糖的取代基团符号写在右
5、下角或下面。取代基团的位置和数目则在取代基团符号的右上角和右下角分别注明。例如，N6-二甲基腺苷可表示为m62A或m62或mA2。,3、核苷酸在核苷符号左侧加小写字母p表示5磷酸酯，如pA为5腺苷酸。右侧加p表示3磷酸酯，Cp为3胞苷酸。核苷多磷酸的表示法如ppU表示5尿苷二磷酸，ppGpp表示鸟苷四磷酸，其中两个磷酸根在鸟苷的5位，另两个在3位。3, 5环化核苷酸一般写为cNMP，如cAMP、cGMP等。,4、多核苷酸链多核苷酸链通常是从5端到3端由左向右表示，如(5)pApGpCpUpC(3)。为了简便，核酸链中的p通常被省略，写作(5)pA.G.CU.C(3)，也可写作(5)pAGCUC
6、(3)。在书写一条互补双链核酸分子时，由于两条链反向互补，故在末端写上5和3必不可少。对于25连接和55连接则应在小写字母p的左和右上角注明，如ppp5A2p5A2p5A。,第三节 脱氧核糖核酸DNA是由脱氧核糖核酸线性聚合而成的大分子聚合物，是遗传学的物质基础。不同生物DNA分子大小差异很大。从数千碱基到数十亿碱基不等。不同生物DNA分子的存在形式也不相同，多数生物基因组DNA呈双链线状。尽管DNA分子的大小不同，形状各异，但作为决定生物性状的遗传学物质，其基本结构有许多相同或相似的特点。,一、DNA的一级结构 DNA为两条反向平行的多核苷酸依据碱基互补配对原则（A与T配对形成两个氢键，G与
7、C配对形成三个氢键）构成的双链分子。DNA中的嘌呤和嘧啶碱基携带遗传信息，糖和磷酸为结构基团。DNA分子的骨架是由磷酸二酯键连接的许多脱氧核糖组成的，并在整个分子中保持不变。一个脱氧核糖核苷酸中糖部分的3羟基通过一个磷酸二酯键与邻接的糖的5羟基相连。DNA的可变部分是它的碱基的排列顺序，这即是DNA的一级结构。,二、DNA的二级结构DNA二级结构是指由Watson和Crick建立的DNA双螺旋结构模型（double helix），这一结构模式的建立不仅高度概括了此前近一个世纪核酸结构、性质及功能的研究成果，而且为此后分子生物学的研究奠定了坚实的理论依据。,DNA双螺旋结构模型的特征1953年W
8、atson和Crick综合了DNA中碱基的理化性质、组成以及DNA纤维的X线衍射分析结果，提出了DNA的双螺旋结构模型，该模型有以下特点。（1）主链（backbone）：两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与核糖在外侧，彼此通过3, 5磷酸二酯键相连接，形成DNA分子的主链。碱基平面与纵轴垂直，糖环的平面则与纵轴平行。多核苷酸链的方向取决于核苷酸间磷酸二酯键的走向。习惯上以C3C5为正向，两条链均为右手螺旋。,（2）碱基配对（basepair）：两条核苷链依靠彼此碱基之间形成的氢键而结合在一起。根据对碱基构象研究的结果，A只能与T相配对，形成两个氢
9、键；G与C相配对，形成三个氢键。所以GC之间的连接较为稳定。DNA复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基配对。双螺旋的平均直径为2nm，两个相邻的碱基对之间相距的高度，即碱基堆积距离为0.34nm，两个核苷酸之间的夹角为36o，因此，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸，螺距为3.4nm。,（3）大沟和小沟（major groove, minor groove）：双螺旋结构上有两条螺形凹沟，一条较深，一条较浅。较深的沟称大沟（major groove），较浅的称小沟（minor groove）。大沟的宽度为1.2nm，深度为0.85nm。小沟的宽度为0.6nm，深度为0.75nm。,三、DNA的三
10、级结构细胞内的双螺旋DNA分子并不是以细长的链状存在，周围的离子环境和DNA结合蛋白的性质决定了它具有更高级的结构形式。DNA的三级结构就是指双螺旋基础上的进一步扭曲，包括线状双链中的纽结、超螺旋、多重螺旋、分子内局部单链环及环状DNA中的超螺旋、结及连环等拓扑学状态。,其中超螺旋是最常见也是研究最多的三级结构。环型DNA有三种构象：构弛环形DNA、解链环形DNA及超螺旋DNA。,四、变性和复性变性维持双螺旋的力是由氢键和疏水键提供的，因此，凡是破坏氢键和疏水键的因素都能导致双螺旋的破坏，如加热、极端的pH、有机溶剂、尿素、甲酰胺等试剂。DNA双螺旋的破坏称为变性。,DNA的变性不仅受外部条件
11、影响，而且也取决于DNA分子本身的稳定性。G-C含量高的DNA比较稳定，这是因为G-C间有三对氢键，而A-T间只有两对氢键。由于拓扑学的原因，环状双链DNA比相应的线状DNA稳定，使得双螺旋不容易解开。双螺旋DNA分子具有一定的刚性，而变性之后就成为无规则线团，伴随变性过程DNA溶液的流体力学性质也发生变化，如溶液的粘度大大降低，沉降速度增加，浮力密度上升等。,天然DNA的发色基团藏在双螺旋的里面，变性后碱基都暴露出来，因此变性过程也伴随着DNA光学性质的变化。核苷酸的碱基杂环在紫外区有很强的光吸收（在260nm有最大光吸收），双链DNA因碱基紧密堆积，相互作用，吸光率低于相同组分的单链DNA
12、和游离核苷酸，当双链DNA吸光值,A260nm=1.00时，相应的单链DNA的A260nm=1.37，相应的游离核苷酸A260nm=1.60。利用这种变性后的增色效应跟踪升温下DNA的变性过程，以紫外吸收值对温度作图，可得到一条S型融解曲线（图816），A260nm值达到最大值的1/2时的温度称为融解温度或融点（Tm）。在近似生理条件下的溶液中，Tm一般在8595之间。Tm值与DNA分子中的GC含量相关，可用下列经验式表示：,%(G+C)=(Tm-69.3)2.44。在变性过程中，通过电镜可以直接观察到AT和GC区域所在的部位、长短和先后顺序。环状双链DNA比相应的线状DNA稳定，这是因为拓扑
13、学的原因，使得环状双螺旋不易解开。在活细胞内，当DNA进行复制和转录时，也要解开双螺旋链，因此也是一个变性过程，这是一些称做螺旋去稳定蛋白的作用。,复性：DNA的变性是可逆的，在适宜的条件下，分开的两条互补链可以重新恢复双螺旋结构。例如用加热方法破坏双螺旋结构，待缓慢冷却后，双螺旋结构便可重新形成。这个过程称为复性或退火。当参与复性的核酸来源不同时，称为杂交，杂交可发生在DNADNA同源之间，也可发生在DNARNA同源序列之间。,影响复性速度的因素有DNA分子的复杂性、DNA的浓度、复性温度、溶液的离子强度。简单顺序的DNA分子，如多聚d（G）多聚d（C）彼此发现互补顺序在与互补链相碰撞之前，
14、必然会碰到很多非互补链，因此在同样条件下，顺序复杂的DNA比顺序简单的DNA所需的复性时间要长工些。同一种DNA，当浓度高时，互补顺序相碰撞的机会增加，复性速度也快。,DNA片段的大小：也影响复性的速度，因为大的线状单链扩散速度受到妨碍，减少了发现互补顺序的机会，因此在复性实验中，往往把DNA用机械剪力切成一定大小的片段。温度：也影响复性的速度，低温不仅减少了互补链的碰撞机会，而且使已经误配的片段再解开寻找正确的互补链变得困难。,因此复性温度不能过低，一般比融点低25左右是最佳温度。溶液的离子强度也影响到复性的速度，两条带同样电荷的DNA链会相互排斥，因此，在复性溶液中必须有一定浓度的盐以中和
15、电荷。一般来讲，盐浓度高时复性速度快。,核酸分子杂交（hybridization）应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成双链分子（heteroduplex），双链可以在DNA与DNA之间，也可以在RNA链与DNA链之间形成。由复性原理而设计的分子杂交技术是分子生物学中一项重要技术，它可用于显示异源DNA的相似程度，鉴定DNA或RNA，测定特定顺序的频率，进行基因定位等。,基因检测： 意义医学检测技术的发展，经历了三个阶段，即生化指标检查，免疫学或血清学检测和基因检测。基因检测优于传统的生化检测和免疫学检测，体现在：灵敏度高，可达fg水平，在某些场
16、合可以检测单个基因；因在基因水平上反映异常，如点突变的检测，可以对疾病作出早期珍断；,对传染性疾病而言，免疫学检测往往只能反映接触史或感染史，而基因检测则能反映病原体的复制能力和数量，即有无传染性。另外，基因检测不受临床上抗生素应用的影响。二、基因检测的基础和内容 核酸中碱基序列是编码它所表达的酶和蛋白质分子中氨基酸的品种和排列顺序。,对各种生物来说，核酸序列是严格遵循孟德尔遗传定律并具有显著的种属特异性和个体特异性。在两股核酸链间的碱基以严格的互补规律（A=T，C=G）由氢键缔合。在某些理化因素的作用下，如加热、改变DNA溶液的pH、或加入有机溶剂，使其氢键断裂、形成单链，称之为变性。消除变
17、性条件，使两条互补链重新缔合，恢复原来的双螺旋结构，称之为复性。,如果选择一段特定序列的核酸标记上显示物质（如放射性核素、生物素或酶等）制备成探针。再与变性的单链待检核酸样品变性退火（杂交）的核酸作为引物，在4种碱基的存在下和DNA聚合酶的作用下用以检测样品中有无与之互补的碱基序列存在，此即分子杂交技术。如果在待测核酸的两条链的5端各选择一段特定序列和一定长度（一般为1625bp ），沿53方向延伸，合成互补链，则一条链就变成了两条链。,经多步（一般30个）周尔复始的变性、退火、延伸，使原始的靶序列（模板）成百上千万倍的扩增、放大，再用电流或转印杂交等方法检测，此即聚合酶链反应（PCR）技术。
18、任何疾病的发生，不外乎内、外因素的综合作用，而任何疾病的发生基础和早期病变乃是基因的变化，即内源基因的变异和外源基因的侵入。内源基因的变异包括扩增（如脆性X综合症）、转位（如慢性髓性白血症的癌基因C-abl及BCR的转位）和点突变（如p53基因点突变与某些肿瘤发生的关系）等等。,各种病原体感染人体，造成特异的外源基因的侵入并在体内增殖，引起各种传染性疾病。某些病毒核酸可以与宿主染色体基因组整合或激活癌基因、封闭抑癌基因而导致肿瘤的发生，如HBV与肝细胞癌、EBV与鼻咽癌等。通过基因检测寻找内源基因的异常变化和发现外源基因的存在，从而达到对有关疾病快速敏感和特异的诊断，这就是基因检测的内容和目的
19、。,三、基因检测的种类和方法基因检测包括目的基因的分离、探测，信号的显示和放大等步骤。虽然其种类和方法不断扩大和发展，但比较实用的仍然是以分子杂交和PCR技术为主干，以电泳、转印、限制性酶切、DNA测序和基因拼接等项技术为辅助。发展趋势为各种方法的组合联用、自动化和多能化，如阵列杂交、芯片式DNA扩增仪等等。对于临床应用而言，简便、快速、敏感和特异为其努力方向。,如： DNA一级结构的测定DNA的测序工作迟于蛋白质和RNA。原因: 用于蛋白质和RNA顺序测定的策略都是建立在小片段重叠的原理上，即把待测分子用专一性水解酶水解成很小的片段，测定每个小片段的顺序，找出能把这些小片段连接起来的重叠片段
20、，然后推断整个分子的顺序。,但这个战略不完全适用于DNA的顺序测定。存在的问题是：没有相应的碱基专一的脱氧核糖核酸酶，故要获得稳定的片段十分困难；DNA分子量一般都很大，获得重叠片段的困难随分子量的增加而增加。,70年代后期突破了上述难关，F Sanger和W Gilbert分别提出了两种全新的DNA序列分析方法，即酶法和化学法。F Sanger和W Gilbert的发现与核酸分子生物学的以下几方面的研究进展密切相关。首先是限制性核酸内切酶的发现和广泛应用，其次是因为建立了一种在凝胶电泳板上直接而快速地分离相差一个碱基大小的DNA片段方法；第三是分子克隆技术的建立。,（2）化学法：A Maxa
21、m和W Gilbert所建立的化学法从某种意义上与酶法类似，都是要获得一系列相差一个碱基的DNA片段。不同的是化学法是通过特殊的化学试剂将DNA模板直接裂解而获得上述片段。首先，制备末端以32P标记的单链DNA，通常用多核苷酸激酶将32P引进5羟基末端。然后选择性地将此标记DNA在四个核苷酸中之一处断开，必须选定一个合适的条件使每一链上平均只有一个断裂。在每一个碱基处的部分切割产生了一套从32P标记原子到该碱基每个位置处的不同放射性片段。,例如，如果顺序是532PGCTACGTA3，那么在四个碱基中的每个特异切割产生的放射性片段有：在A处切割：32PGCT 32PGCTACGT在G处切割：32
22、PGCTAC在C处切割：32PG 32PGCTA在T处切割：32PGC 32PGCTACG上述片段电泳分离并放射自显影后即可读出核酸序列,图示在四个碱基（A，G，C和T道）的每个碱基处对于532PGCTACGTA3进行特异性切割所产生的放射性片段。片段中含有的核苷酸数（n）示于右。自下而上可直接读出碱基顺序。与酶法比较，化学法有以下特点：可不经克隆直接测定寡核苷酸序列；测序反应不受DNA链中多聚G/C的影响；制备一次模板可供测定10kb长的DNA片段，减少了克隆次数。鉴于化学法的上述特点，目前仍为一些实验室所偏爱。,（3）自动测序：无论化学法还是酶法，最终序列的测读均需经同位素放射自显影和人工
23、分析。这有三方面的不足：放射性危害；费时；易造成人为误差。针对同位素测读的上述问题，最近发展了一种以荧光素标记为基础集激光检测和计算机技术于一体的非放射性自动核酸序列分析方法。它采用四种发射波长不同的荧光物质分别标记同一引物或不同的双脱氧核苷，经延伸/终止反应后四管反应物可在同一泳道进行电泳，通过激光扫描器将电泳信号收集起来并送入计算机进行处理，处理后的信号可以序列的形,器将电泳信号收集起来并送入计算机进行处理，处理后的信号可以序列的形式直接通过打印机打印出来。自动核酸序列分析技术的发展大大加快了核酸序列分析研究的步伐，相信不久的将来这一技术将把人类的全部遗传学秘密呈现在自己面前。,.,核酸探
24、针制备概念:核酸探针是一类具有特异顺序的DNA或RNA克隆片段。 它们能专一性地与受检目标DNA互补结合（分子杂交），检测核酸的质和量。它具备两个基本功能要素：（1）示踪：探针依据自己特有的碱基顺序，从茫茫DNA和RNA的大分子群体中，通过碱基互补的原则，跟踪和发现与自己同源的核酸顺序；,（2）显示性：核酸探针在捕捉到目标DNA后，通过自己的显示器，显现目标DNA的存在及其性质。探针制备就是将其示踪性和显示性融入一体的过程。运用分子生物学方法,体外人工操作一段特异顺序核酸,借助载体和宿主菌,大量扩增和纯化这段DNA,为它们装上强大的识别标记,去完成其核酸研究的探测作用.分类：分为DNA、RNA
25、和人工合成核酸三大类。,它们有着不同的来源和制备方法、根据不同的检测目的和示踪要求，可以选择和应用不同类型的核酸探针。,一、载体（vector） 载体是一类独立于基因组之外，可以自身复制的DNA分子。可以装载外源DNA的载体有四类，包括质粒（Plasmid）、噬菌体（Phage）、粘粒（Cosmid）和病毒（Virus）。 1.质粒 是一类存在于细菌染色体外的遗传单元。它们是双链、闭环的DNA分子，其大小范围从1200kb左右。（1）pUC18、pUC19 ；（2）pTZ18、pTZ19,2、噬菌体 （1）gt10、gt11 ；（2）M13噬菌体3、粘粒 粘粒是一种人工改造的DNA载体，它具有
26、噬体菌和质粒的双重特性。4、病毒 用病毒做载体将外源DNA导入哺乳类细胞内，它能感染每一个活的细胞，通过整合或非整合状态，在受体细胞内高效表达外源基因。,二、重组DNA 为了分析和显示基因的结构和功能以及其它的基因组区域DNA，首先需要提取、分离、克隆这些DNA片段，然后选择合适的载体，将它们分别插入和连接到载体分子中，这些重组的DNA分子经转化和转染等途径，在宿主细胞中大量繁殖和扩增，由此获得大量的单一克隆基因DNA片段，最终用于基因DNA分析、示踪作用的探针，基因的表达以及基因的改造或基因治疗。这一复杂的DNA操作过程便称为重组DNA技术。,三、核酸的纯化和分离 核酸必须高度纯化，才能进行
27、不同核酸示踪的操作，包括核酸探针标记、核酸杂交，核酸的酶操作，核酸转移、体外表达及序列分析等。根据不同的研究目的，核酸纯化包括以下几层含义：（1）核酸与蛋白质等有机大分子分离；（2）DNA与RNA分离，或RNA与DNA分离；（3）一段特异顺序DNA与DNA群体分离；（4）核酸与小分子有机和无机盐分离等。,第二节 核酸标记 重组DNA技术发展往往依赖于新的检测手段的出现，使我们能检出和分析从克（g）到微微克（10-12g，即pg皮克）水平的DNA，能操作十分之一微升（0.1l）体积的DNA。 目前实际可以应用的三个基本检测和示踪DNA的手段，它们是：（1）用紫外分光光度仪测量核酸，定量和检出每毫
28、升微克水平（g/ml）的DNA；（2）用溴乙锭（E.B）染核酸的荧光紫外分析定量（10ngDNA）；,（3）同位素（如32P）标记核酸的定量和检定（pgDNA）。许多核酸分析工作都是在非常小的体积中进行的，这有利于一些酶促反应的完成（如限制性酶解，DNA连接与克隆、cDNA合成和DNA的体外合成等）。应用32P等同位素做为示踪剂，可以使我们很容易监测到DNA的存在及工作状态，并进行定量分析。,一、核酸标记示踪剂放射性核素标记到核酸分子内的放射性核素示踪剂可以通过两个途径进行准确的分析和测量，即放射性探测仪和放射性自显影。放射性探测仪是指-液闪、手提式、袖珍式探测器等仪器，用每分钟探测计数（cp
29、m）测量标记核酸的放射活度，参入比及定量分析。（详细情况请见有关章节）。,放射性自显影的含义是放射线在X光片的感光过程，其中也包括放射性颗粒的相互作用激发的荧光在X光片上的感光。放射性自显影的绝对敏感性在于全黑状态下24h形成的X光片感光程度，但一般想获得理想的自显影图象，标记核酸活度要超过这绝对敏感性的10-100倍。32P在水和塑料中释放射线距离为6mm，能激发表面荧光，因而在自显影时可用增感屏，可以加倍使X光感光。,核酸标记是通过酶促反应将放射性核素（如32P等）参入到DNA或RNA分子中。由于不同研究的目的所应用的核酸分子性质不同。如RNA与DNA，大分子（1-10kb）与小分子（10
30、-100bp），单链与双链，环状与线状分子等，核酸分子的标记方法也各不相同，但有一点是共同的，即它们都是用含同位素的NTP或dNTP为标记构件分子，通过DNA合成反应参入到核酸分子内部或酶促将其连接到核酸分子两端。,二、缺口平移缺口平移是指对有缺口的线状或环状双链DNA分子在DNA聚合酶I的作用下，在单链缺口的3羟基端以53的方向继续合成一条新的含有32PdNTP的DNA分子子链，缺口下游的DNA单链被DNA聚合酶I的53核酸外切酶亚基逐一分解。一般缺口的形成是DNA酶完成的，其浓度高低决定DNA分子的缺口多少，缺口的位置是随机的，合成的DNA链之间是有交叉的。通常缺口平移合成的DNA片段为5
31、00-1500bp长，用于固相杂交，可以提高信噪比。,目前缺口平移均有商业化的试剂套盒，如BR2，Promega，Amashena等公司，国产试剂盒也已问世，只要按照厂家要求操作使用，大都能得到良好的标记效果。标记DNA的参入比应达到50-80%，放射活性可达108cpm/gDNA。如果标记不佳，最常见的原因是标记DNA的纯度不好。32P-dCTP参入的效率应以最少的,DNA分子数获得最大的32P-dCTP参入率。缺口平移对较长的DNA分子标记效果好，短分子（500bp)不宜用此方法。,三、随机引物标记本方法可以获得更高放射比活性的32P-dCTP参入DNA探针（活性可达109cpm/gDNA
32、），它适用于200bpDNA片段的标记，因此可以事先从载体分子中用RE分离出来插入序列DNA（Instert DNA），32P-dCTP参入率可达70-80%，反应条件易于控制，因而现在已被广泛应用。随机引物为人工合成的6碱基脱氧核苷，其顺序是计算机分析生物基因组中DNA组成顺序的多种可能性设计合成的，它们在标记过程中充当引物；,四、末端标记多数人工合成的寡聚DNA（oligoDNA）片段长度仅20-50bp左右，缺口平移和随机引物标记都不能将32P-dCTP有效地参入到DNA分子；另外，RNA做为探针也需要有适当的方法以非核酸合成的方式将32P标记到RNA上。末端标记是应用T4核苷酸激酶在D
33、NA或RNA分子的3和5末端连接上32P-dNTP或32P-NTP。基于标记方法的需要，末端标记只能选用-32P-dNTP或-32P-NTP（而参入标记使用的位的32P-dNTP）。在端标之前，首先要用碱性磷酸酶将RNA或DNA5端的磷酸基团（Pi）水解掉，由32P-dNTP取代。,五、PCR（多聚酶链反应）DNA标记 PCR操作不但可以扩增特异DNA片段，也同时可以通过其DNA合成作用将32P-dNTP参入到DNA分子中，达到DNA的标记作用。 从示踪角度看，PCR标记核酸可以进行一些特殊的设计以达到不同示踪要求。,PCR技术的原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性
34、、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温（95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（3755）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。,这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA人子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使使两条人工合成的引物间的DNA特异区段拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形成迅速扩大，经过
35、2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。,（1）不对称PCR标记反应是通过加入不同比例的A、B两端引物，有选择的过剩合成某一DNA单链（可以是正链，也可以是负链），这些均一标记的DNA单链能进行DNA的序列分析（35S标记），,或DNA-RNA、DNA-DNA的递减杂交以及其它有选择单链DNA的检测和分析工作；（2）加入特异载体插入位点两边引物和32PdNTP，直接标记插入序列DNA，其探针可用于各种杂交目的；（3）PCR反应中加入少许32P-dNTP，帮助我们直接观察和分析PCR工作状况，目标DNA的可操作性和变化情况。 PCR技术最初由PerkinE
36、lmer Cetus（简称PE）公司推出，目前应用范围甚广，其基本操作条件是一台电脑控制的热循环仪和一套PCR反应的试剂和引物。,(4)PCR制备点突变探针 许多基因突变源于基因内部单一碱基改变形成的点突变，用PCR制备的Oligo DNA探针，在一个引物的3端可以设计一个错配（mismatch）碱基，经斑点杂交可以检出突变基因位点。本方法制备的探针长度应80bp，便于斑点杂交法检出突变位点，设计引物时要靠近；错配的碱基在PCR反应中的效果是T-GG-GA-G。,(5)PCR标记点突变基因片段进行单链构成多态分析（Singlestrand conformation polymorphism，S
37、SCP）该方法应该说并非标记探针，而是用正常或异常患者DNA，在32P示踪下，仅仅特异扩增含突变的一段基因片段，在变性情况下，形成单链电泳、单一碱基改变DNA的电泳迁移率与正常有差别，通过序列胶和放射自显影、可以将突变DNA识别出来。(6)PCR标记不对称单链的序列分析 该方法结合两种技术原理以达到示踪和测序目的。,用不对称PCR方法过剩合成某一条单链； 以这条过剩单链为模板，在有35S-dATP以及双脱氧核苷酸（ddNTP）存在下，不完全合成DNA达到序列分析(7)PCR扩增的受检DNA直接进行RFLP分析（限制性片段长度多态分析）和PCR斑点杂交,六、35S-dCTP标记DNA-DNA测序
38、核酸标记大都选用32P-dNTP为示踪剂，它半衰期短（仅14天），放射信号强（硬射线）、照射距离适中（6mm），广泛适用于核酸分子杂交。然而，用于核酸标记的DNA序列分析，要求分辨的放射性自显影带常常3-5mm，如果仍选用32P，势必会造成邻近两条带的重叠，给分析带来困难。35S放射范围仅2mm，同样是射线、是DNA序列分析最理想的示踪剂。,DNA测序是最重要的基因分析技术，DNA的序顺构成（一级结构）是一切生物的遗传基础；基因突变和遗传性状的变异都源于DNA顺序的改变。通过DNA测序，不但揭示基因的构成，而且可以发现突变位点，为开展遗传病病因研究，基因诊断乃至基因治疗奠定基础。任何一个分子生
39、物学家，当他们发现或克隆某一基因或有特殊意义的DNA片段，都无一例外地要进行DNA测序工作，再以正向或反向遗传学途径，去探明遗传结构与功能的关系。,目前积累起来的数十万个基因和有功能DNA片段的序列成为我们研究生命的发生及构成的宝贵资料（均收载到了Gene Band Data Base），目前进行的人类基因组物理图谱和测序战略，是一部人类遗传组成的活字典，在不远的将来，人们也许会从这部字典中查找人类十万个表达基因的位置和结构。除了研究基因本身的特性，DNA测序是PCR操作的基础，无论出于什么目的，选择PCR技术都必须探明扩增区域DNA的序列组成，然后合成引物。,尽管目前已有DNA序列分析的自动
40、化仪器，但多数实验室中，仍然沿用化学法（Maxam-Gilbert法）和双脱氧DNA合成法（Singer法）的DNA测序。Singer法 是选择4种双脱氧三磷酸核苷（dd NTP），在DNA合成过程中有选择地在某一碱基处由ddNTP取代而中止DNA延长。,该测序的基本原理是：将待测DNA片段首先克隆到特定载体分子中（一般选用M13，它可以生产出单链DNA分子），合成一段（17-20nt）长的载体引物，它紧靠待测插入DNA的3端，分四管分别在DNA聚合酶I作用下完成引物延伸，每管中加入4种dNTP，其中一种核苷酸带有35S，以便以后自显影时显示延伸链的位置。在每一反应管中，分别加入不同的一种双脱
41、氧核苷酸（ddNTP），即ddATP（A管）ddGTP（G管）ddCTP（C管）和ddTTP（T管）。,ddNTP浓度较低，在引物延伸过程中，任意一点遇到相同碱基的ddNTP便会少部分比例的DNA链停止延伸（因ddNTP的3，OH已不存在）、其它链的延伸反应将继续，直到出现ddNTP为止。因此，在4个反应管中，每一双脱氧核苷均会形成不同长度顺序DNA混合体，它们起始于引物，终止在标志管中每个该碱基出现的位置上。,当将这4管同时用高分辨凝胶电泳分离这些DNA片段，它们就会有规律地出现由小片段到大片段DNA的序列带，通过放射自显影，我们便可读出待测插入序列DNA的碱基排序。,七、3H dNTP标记
42、探针与染色体原位杂交染色体原位杂交（Chromosome In Situ Hybridization, CISH）是在亚微水平检测某一基因在染色体区域分布的方法，即将标记的单一拷贝DNA探针与载玻片上固定的中期染色体进行原位杂交，这是目前较广泛应用的基因定位（Gene Mapping）方法。,由于CISH在单一DNA分子（每个染色单体仅包含有一条DNA）上检测和识别同源DNA的存在和区域分布，它必须具备以下几个条件：（1）需要特殊制备染色体，既要保留中期染色体的基本形态，又要让染色体中的DNA分子暴露出来，并完全变性,（2）染色体单体直径在0.4m左右、其分辨率必须借助光学显微镜放大100-1
43、000倍。因此，用于CISH的探针不能选择放射距离较大的硬射线的32P为示踪剂，而要采用放射距离很短的射线的3H为示踪剂，以保证观察到的杂交斑点足够小,（3）感光材料选用核乳胶涂膜，而非X光片；（4）一条染色单体只能结合一个标记的探针分子，标记探针的放射活性要足够大，通常用2-3种3H标记的dNTP为标记构件分子。 CISH方法较复杂，包括中期染色体制备，探针标记，原位杂交和放射自显影四个步骤。,八、实验室中几种简便核酸标记检测法核酸标记方法很多、标记试剂大多商品化、标记方法也已基本标准化。尽管如此，由于标记工作环节多、核酸与试剂的质量以及操作的准确性等诸多因素影响，核酸标记完成以后，仍需对标记核酸的结果进行定性和定量的检测。检测包括两个参数:,核酸分子中放射性核素（32P、35S或3H等）的参入比参入核酸分子的32P-dNTP除以标记反应中总体32P-dNTP；标记核酸的比活性以每微克核酸中的放射活性计数总和（cpm/g DNA），如果再除以仪器的计数效率，则为dpm/g DNA。这两个参数即有联系，又有区别，参入比高的标记核酸其比活性也强，但后者又与标记同位素的衰变情况有关.,
