1、MicroRNAs 沉默技术 Silencing of microRNAs,14335181 巫赛彬 生物工程 报告日期：2016.06.25,1.microRNAs的背景知识介绍,4.microRNAs沉默技术应用例子,2.microRNAs沉默技术的意义,3.microRNAs沉默技术,5.人文哲理及致谢,1,microRNAs 背景知识介绍,microRNAs的背景知识介绍,大家庭,mRNA：信使RNA，转录的模板 tRNA ：转运RNA rRNA：核糖体RNA microRNA：微小RNA，起基因调控作用。 hnRNA：不均一核RNA，多为mRNA的前体 snRNA：小核RNA ,对R
2、NA加工方面起作用。 ssRNA:作为病毒的线状单链遗传物质 dsRNA：作为病毒的线状双链遗传物质 siRNA：小干扰RNA Sat-RNA：卫星RNA TR：端粒酶RNA，组成端粒酶的成分之一 核酶RNA：起催化反应的RNA。 。,尊重下彼此的智商 这些大家都懂的。,microRNAs的背景知识介绍,microRNA的简介,microRNA前体模型,非编码RNA，不翻译蛋 白质 分子量小，仅有18-25个核苷酸构成 广泛存在于果蝇，线虫，植物，人体等真核生物中 高度保守 具有组织特异性和时效性 对转录后基因调控起作用,microRNAs的背景知识介绍,microRNAs的转录与加工,miR
3、NA基因,Pri-miRNA,Pre-miRNA,microRNA,靶mRNA,2,microRNA 沉默技术意义,microRNAs沉默技术的意义,microRNAs参与的生理过程,脂肪代谢,细胞凋亡,激素分泌,时序发育,病毒复制,细胞分化,神经元发育,肿瘤发生发展,microRNAs沉默技术的意义,在许多疾病中，microRNA的表达均有显著变化,高血压病人的microRNA表达变化,microRNAs沉默技术的意义,科研上，利用microRNA沉默技术可以研究microRNAs的功能，并以此研究基因的调控机制。（看上图）,在医疗上，microRNAs沉默技术可以用作基因治疗，调控代谢，治
4、疗疾病（没有图）,所以这技术到底有什么用？,3,microRNAs 沉默技术,microRNAs沉默技术,microRNAs的转录与加工,无效或低效沉默,高效沉默,microRNAs沉默技术,早期研究面临的主要问题,用单纯的反义寡核苷酸抑制miRNA 效果差！,原因,反义寡核苷酸链与miRNA之间 亲和力低！稳定性差！,解决方法,分子改造！,目标,1.提高亲和力！ 2.延长细胞内滞留时间！,microRNAs沉默技术,以下是一些经常用于沉默miRNA的改造分子，接下来会一一为您介绍。,microRNAs沉默技术,Antagomir寡核苷酸,改造内容：,1.每个核苷酸的呋喃糖2碳上加甲基。 2.
5、两端用磷硫酰修饰。,效果,1.提高了对核酸酶的耐受性。 2.延长了在胞内的半衰期。,microRNAs沉默技术,锁核酸（LNA）,改造内容：,1.一个亚甲基桥连接核糖的2氧和4碳。,效果,1.锁定内部构象，降低可塑性，增强骨架稳定性。 2.与miRNA亲和力显著提高。 3.有良好的错配识别能力。 4.没有毒副作用。 5.在体内的代谢稳定性也较强。,microRNAs沉默技术,肽核酸（PNA）,Morpholino寡核苷酸,改 造,人工合成的以吗啉环为骨架的DNA类似物。,以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代DNA中的戊糖磷酸二酯键的DNA类似物。,效 果,1.靶向于miRNA的溶核加工位点
6、，抑制miRNA的成熟。 2.微量而高效性。,1.不带电，与miRNA结合没有静电排斥，也不受盐浓度影响。稳定性与特异性也大幅提升。,此处无图 自行脑补,microRNAs沉默技术,提呈系统,所谓“提呈系统”，就是把刚才说过的“miRNA沉默”分子导入到特定的细胞中与特定miRNA起作用的机制，懂了吗？,从化学性质上讲，miRNA沉默分子与miRNA，siRNA是非常相似的。常见的提呈系统有胆固醇偶联法，高密度脂蛋白偶联法，低密度脂蛋白偶联法，抗体偶联法等。,miRNA 沉默分子,靶向作用 分子,具有靶向作用的 miRNA沉默分子,4,microRNAs 沉默技术例证,microRNAs沉默技
7、术例证,实验动物：小鼠,沉默分子：antagomir-122,提呈系统：胆固醇偶联,注射方式：尾静脉注射,靶分子：miR-122（肝脏）,实验进程1,就 是 我 啦！,microRNAs沉默技术例证,northern biot分析,1.多因素对照分析,提示： pS：部分改变修饰成分 fS：全部改变修饰成分 Mm：有4个位点突变,沉默效果好,序列特异性强,稳定性好,效果持久（23天）,microRNAs沉默技术例证,实验动物：小鼠,沉默分子：antagomir-16,提呈系统：无,注射方式：尾静脉注射,靶分子：miR-16（全身）,实验进程,怎 么 还 是 我 ！,microRNAs沉默技术例证
8、,northern biot分析,1.能实现大范围的miRNA抑制效果。 2.对脑的miRNA抑制效果不明显。 3.对在骨髓中的pre-miRNA无明显抑制效果。,microRNAs沉默技术例证,实验进程3,正反对照试验,目的：对基因表达量的影响,沉默分子：antigomir-122,强化因子： 腺病毒转导mir-122,试验动物：小鼠,试验动物：小鼠,一直都是我咯！,microRNAs沉默技术例证,全RNA提取，进行微阵列数据分析基因表达强度,沉 默 组,强 化 组,至少11个基因的表达水平下降。,部分相同的基因表达强化。,（大部分是与胆固醇生化合成相关的基因）,microRNAs沉默技术例
9、证,表型分析,Hmgcr（3羟基3甲基戊二酰辅酶A还原酶，胆固醇合成途径的限速酶）活性下降约45%。,血浆胆固醇含量下降44%。,结论：miR-122能血浆胆固醇含量起正调控作用,5,人文哲理 及致谢,人文哲理及致谢,mRNA,沉默分子,miRNA,配对结合,配对结合,抑制,抑制,人文哲理及致谢,哲理思考,事物之间的联系的普遍的， 万物相生相克，牵一发而动全身,马克思（1818-1883）,致谢,谢谢观赏！ 祝大家暑假快乐。,参考文献： Joshi SR, McLendon JM, Comer BS, Gerthoffer WT. MicroRNAs-control of essential
10、genes: Implications for pulmonary vascular disease. Pulmonary circulation. 2011 ;1:357-64. Jan Krutzfeldt1, Nikolaus Rajewsky3, Ravi Braich, Kallanthottathil G. Rajeev, Thomas Tuschl,Muthiah Manoharan 夏新，张小敏，宋鹏飞，王爽.反义寡核苷酸介导的miRNA沉默研究.安徽农业科学.2011.39(24):14545-14547 Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355,
