1、表面活性剂在蛋白药物中的应用一、引言表面活性剂是由两种截然不同的粒子形成的分子，一种粒子具有极强的亲油性，另一种则具有极强的亲水性。 溶解于水中以后，表面活性剂能降低水的表面张力，并提高有机化合物的可溶性。传统观念上认为，表面活性剂是一类即使在很低浓度时也能显著降低表（界）面张力的物质。随着对表面活性剂研究的深入，目前一般认为只要在较低浓度下能显著改变表（界）面性质。表面活性剂或与此相关、由此派生的性质的物质，都可以划归表面活性剂范畴。随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现。目前已有 35 种重要治疗药物上市，生物技术与生物制药企业的发展也日益全球化。生物技术药物研究的重点是应用
2、DNA 重组技术开发可应用于临床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等。据 Parexls Pharmaceutical R&D Statistical Source Book 报道，目前已有 723 种生物技术药物正在接受 FDA 审评(包括 期临床及 FDA 评估)，700 种药物处于早期研究阶段(研究与临床前)，还有 200 种以上药物已进入最后批准阶段(期临床与 FDA 评估) 。但是由于蛋白本身的不稳定性和难口服吸收的性质，研究表面活性剂在蛋白药物中的作用有着重要的意义和实际效益。本文主要关注于生产中的应用和微凝胶的研究。二、药物生产中应用的表面活性剂表面活性剂是两
3、性的，易于吸附聚集在界面。表面活性剂可以依据极性端分类为阳离子型，阴离子型非离子型和两性型。一个很好的阴离子型表面活性剂是十二烷基磺酸钠（SDS ） 。表面活性剂有很广泛的应用，在制药和生物工业在很多情况中应用非离子表面活性剂，包括稳定蛋白治疗活性。下面介绍两种生产过程中常用的表面活性剂。2.1 聚山梨醇酯聚山梨醇酯有一个通用结构，包含一个山梨聚糖环，并且在羟基处有聚合的环氧乙烷，只有在脂肪酸链有区别。 （见图 1）图 1. 聚山梨醇酯表面活性剂的化学结构。脂肪酸链的长度和不饱和度的区别导致聚山梨醇酯与蛋白的结合能力有了区别。 1最常使用的非离子型表面活性剂是聚山梨醇酯 20 和聚山梨醇酯 8
4、0，商品名为 Tween 20和 Tween 80。聚山梨醇酯 80 比聚山梨醇酯 20 有更好的表面活性，更低的临界胶束浓度，因为它有更长的单不饱和脂肪烃长链。 2聚山梨醇酯 80 也因为长脂肪酸链表现出比聚山梨醇酯 20 和人类血清白蛋白低相互作用的性质。 1,3聚山梨醇酯 80 和 20 与促红细胞生成素的亲和力和相互作用也有了报道。促红细胞生成素与聚山梨醇酯 80 结合时的三维结构有最小的性能，和聚山梨醇酯 20 结合时，蛋白有部分展开。 4聚山梨醇酯在蛋白药物生产过程中，如搅拌、晃动、冷冻干燥和冻融时，可以抑制蛋白聚合，并且在很大程度上阻止蛋白吸附在固体表面上 3,5-9。然而效力取
5、决于实际情况。一个研究中报道，抗体悬浮液在聚山梨醇酯 20 浓度高于0.0025%(w/v)时摇晃，聚合会被抑制。但是表面活性剂浓度低的时候，蛋白就不再稳定。搅拌的时候也需要更多表面活性剂来稳定蛋白。 10聚山梨醇酯在中等温度下容易自身氧化，基本是 PEO 和烯烃不饱和位点的自由基反应。并且在高温时，水解也是很明显的机制。 11还有的研究是，聚山梨醇酯 80可以在摇晃时抑制 IL-2 突变体的聚合，而在储存时，温度依赖的加速聚合。聚山梨醇酯的降解氧化物的过氧化物，会加速蛋白氧化速率，从而降低了蛋白药物的稳定性。 122.2 泊洛沙姆泊洛沙姆是聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯的三嵌段共聚合物（PEO
6、-PPO-PEO） ，商品名为 Pluronics 或者 SynperonicsTM，也是药物工业中常用的一中表面活性剂。泊洛沙姆在美国和英国药典中列入赋形剂。 13(实例见图 2)图 2、poloxamer188 的化学结构泊洛沙姆表现出强温度、浓度依赖性的复杂的聚合活性，包括单聚体、低聚体、各种几何结构的微粒和更大的簇。各种不同分子量和 PPO/PEO 比值的三嵌段共聚合物的临界胶束温度和浓度值用不同的方法预测。 14-18总的来说，有着大的疏水基团（PPO）的复合物可以在低浓度下形成胶束，或者在同样地体积摩尔浓度下，有着低的临界胶束温度。给一个固定的 PPO:PEO 比值，有着更大分子量
7、的泊洛沙姆可以在更低的浓度和温度下形成胶束。亲水性 PEO 基团的大小在形成胶束的时候扮演了不是那么重要的角色。 Alexandridis 等人 16对许多三嵌段共聚合物胶束的形成进行了热力学分析，得到胶束化的标准自由能、焓和熵。他们发现所有检测的三嵌段共聚合物胶束化的焓都是正值，表明单聚体从溶解态变成胶束是吸热过程。胶束化的驱动力是负熵。泊洛沙姆 188（BASF Pluronic F68，图 3）广泛用于哺乳动物细胞培养产品。生物反应器正越来越多地用于放大细胞数量，它作为赋形剂在搅拌培养时提高细胞产量，在静止培养时减少细胞粘附。 19文献中报道了两种泊洛沙姆188 保护功能的机理。一个说它
8、抑制了细胞-气泡相互作用引起的损伤，改变了培养基的特性， 例如，当气泡在气-水界面破坏时。另一种说的是细胞在三嵌段共聚合物的存在下表现出更强的对剪应力压力的抵抗。泊洛沙姆 188 也被报道有促进热变性蛋白的重构和抑制聚合的作用。 20在产物回收时去除泊洛沙姆188 会降低产率，还抑制了某些细胞株的生长。 212.3 表面活性剂对蛋白的吸附和聚合的保护表面活性剂稳定蛋白有两条重要途径：（a）表面活性剂优先在界面吸附，由此阻碍蛋白的吸附， （b）在溶液中与蛋白结合，阻碍蛋白相互接近抑制聚合来稳定蛋白。有些表面活性剂只有一个机理，其余的两个作用都包含。 22图 3 表面活性剂稳定蛋白的机理。 （a）
9、占据界面阻止蛋白吸附（ b）优先结合蛋白，阻止蛋白接近和聚合三、给药时使用的微凝胶随着对人类蛋白组的深入研究，高通量分析技术的发展，生物大分子药物特别是蛋白和多肽类在药物发展中越来越重要。对于这些药物，给药系统会提供很大的有点，包括稳定构象，维持生物活性，阻止化学和酶降解，控制药物释放速度，降低药物毒性、免疫性和其他生物副作用 23,24有很多种基于高分子聚合物的生物大分子给药系统，例如生物科降解乳胶 25，藻朊酸盐和其他多聚糖胶囊 26,27嵌段共聚物胶体 28,29聚合电解质复合物 30,31微凝胶和微囊 32，每种都有自己的长处和短处。这里主要介绍的是微凝胶。微凝胶是可溶性交联大分子是.
10、它的立体结构决定了其性质与线型、支化型等平面型大分子有着很大的不同,因此具有许多不同于平面型大分子的独特性能。微凝胶在不同的环境中会彻底改变自己的体积，如 PH、离子强度、温度、特殊离子和其他化合物的存在，特殊离子和其他化合物的氧化还原条件，或者通过外磁场等。这些使得微凝胶可以以响应的方式包裹和释放分子，有可能应用于蛋白、多肽和其他生物大分子的给药系统中。当然，对于一个给定的化合物或者给药规格，在给药时有很多基本需求需要同时考虑。然而，考虑到微凝胶领域研究的相对初期的阶段，很少有文章探寻微凝胶广泛的给药问题，或者对特别的化合物或者给药条件比较不同的微凝胶，相反的是，现在的文献大部分重点在控制药
11、物装载和释放和明显的变化触发点的各种条件。因此，这里主要讨论触发方面。不管是微观还是宏观的凝胶，交联都是由短暂的物理化学相互作用或者共价键产生的，各自都有刺激控制药物释放机制。例如，多元酸在低 PH（比如在胃部）情况下会去电荷，抑制网状膨胀，减缓药物释放，阻止酸催化的药物水解。在高 PH 情况，如在小肠中，酸解导致网状膨胀，促进药物在胃肠道药物吸收的地方释放，并且这里酸解程度低。 24,25虽然高分子聚合物凝胶缺少疏水区，在携带溶解度低的药物时使用有限，但是生物大分子药物通常不需要疏水增溶，因为它们本身有电荷和亲水性。正相反，因为蛋白和多肽的构象改变和聚合在疏水面更容易发生。 33,34水凝胶
12、提供的亲水基在大多数多肽和蛋白药物中显示出优势。类比它们的宏观类似物，微凝胶可能设计出对一系列刺激响应，包括 pH、离子强度、特殊离子和代谢分子、温度和外界因素（光、磁场和超声） 。 35-44由于它们的尺寸，可以用于注射剂，并且由于快速响应可以用于其他给药途径。因为它们的亲水性，微凝胶可以包裹适度构象变化的多肽和蛋白药物，和有限的聚合（尽管依赖于相互作用强度） ，由此更好的稳定生物大分子的生物活性。39事实上，甚至有蛋白包裹于微凝胶中提高了生物活性，Welsch 等人通过 -D-在 PNIPAM 微凝胶中的催化活性证明了这点。 40温度低的时候，微凝胶高度膨胀，包裹进大量的酶，并且没有损失胶
13、体性质。温度逐渐升高，酶因为温度引起的构象变化逐渐降低活性，由于微凝胶稳定了酶，减少构象变化，从而明显提高了 PNIPAM 微凝胶装载的 -D-葡萄糖苷酶的热稳定性。3.1 温度触发一些高分子类别表现出温度依赖相反的膨胀/消胀转变，包括 PNIPAM 的衍生物和包含聚乙二醇片段的聚合物。 42-47这些系统表现为温度升高时溶解性降低并且有明显的膨胀。依赖于微凝胶和药物性质，后者也许会导致也增加了“挤释放”的药物，或降低由于药物释放的门槛，都可能触发使用药物释放。举一个例子，Nolan 等人就注意到了，随着温度升高，也就是微凝胶膨胀，胰岛素从 PNIPAM 微凝胶中的释放速度增加了。 453.2
14、 电触发电触发是生物大分子微凝胶剂释放的第二种主要途径。例如 Eichenbaum 等人发现聚甲基丙酸烯微凝胶可以在羧酸基团电解时响应膨胀，一种可以用电解质筛选的功能。 46-48通过微凝胶电子密度的变化，可以证明质子的装载能力和药物装载能力有着相关性。更多的关注这些相互作用功能性，LaVan 等人 49报道了微凝胶由 pH 触发了释放药物以及产生的巨噬细胞吸收。相似的， Das 等人利用 pH 响应的 PNIPAM 和聚（N-异丙基丙烯酰胺丙烯酸）构成的微凝胶进行运载，基于癌症靶向，能够证明可以明确的运送到 HaLa 细胞 503.3 特殊化合物触发微凝胶也可以设计出来对某些特定浓度化合物响
15、应，特别是在胰岛素的研究中。60-62例如，四价的凝集素 Concavalin A (Con A)可以作为葡聚糖和其他聚合糖的交联剂。因此，在高浓度的 Con A 条件下，胰岛素因为有效地高交联度密度，可以包裹于粒子中，限制释放。在葡萄糖存在时，溶液中的葡萄糖围绕在微凝胶外围，形成自由糖和葡聚糖竞争 Con A 的情况，导致交联破裂，从而释放胰岛素。 （图 4）图 4. (A) .图解葡萄糖响应的基于 Con A 和葡聚糖衍生物胶束系统 (B) 在外部葡萄糖浓度重复变化的情况下，葡萄糖诱导胰岛素从这个系统中释放523.4. 外场触发、微凝胶系统可以被外场触发，如超声、光和磁场。例如，尽管关注于
16、低分子量而不是生物大分子药物，Patnaik 等人发现药物从含偶氮键葡聚糖水凝胶中释放是光依赖性的，是基于在微凝胶交联偶氮苯顺反异构化的调控。 54在这个系统中，当偶氮部分是反式构象，若丹明和阿司匹林的释放会慢于顺式构象。另外,金属纳米粒子可以用于光学或磁加热，当与温度响应的微凝胶结合时，这种外场引发的加热会导致膨胀变化，挤碎微凝胶释放出药物。Wong 等人通过这种方法，研究了含铁的 PNIPAM 微凝胶，由磁震荡场进行局部加热，相应的使得温度升高，微凝胶响应膨胀。 553.5. 降解触发这种系统一般是基于生物可降解微凝胶，有些时候，药物被不透水的壳包裹。对于后一种体系，微凝胶降解会导致渗透压
17、增加，最后导致壳破裂，药物释放。这个领域的一个例子是， De Geest 等人研究葡聚糖微凝胶包裹不同的聚合电解质多层系统 56，而 Kraft 等人 57和 Kiser 等人 58研究的是脂质体包裹的微凝胶。此外，Murthy 等人制备丙烯酰胺/双丙烯酰胺微凝胶，包含乙缩醛连接点，从而通过酸催化乙缩醛水解，低 pH 触发生物降解和白蛋白释放。 59 . 四 展望生物大分子的给药系统，特别是蛋白和多肽，在未来的几年里会越来越引起人们关注。表面活性剂在生产和给药时，稳定蛋白的二级和三级结构提供了可能性，同时还可以抑制聚合，减少吸附，除去化学和酶降解。为了实现这些目标，我们仍然需要做更多的工作。参
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