PDA TR 01 湿热灭菌的验证 灭菌程序的设计-开发-确认和日常监控.pdf

1、 1Validation of Moist Heat Sterilization Processes: Cycle Design, Development, Qualification and Ongoing Control Technical Report N01 (Revised 2007) Supplement Vol. 61, N0S-1 c 2007 by PDA P D A Parenteral Drug Association 湿热灭菌的验证： 灭菌程序的设计，开发，确认和日常监控 2007年增补，第一卷 N0.S-1 美国注射剂协会 制药科学及技术杂志 编写委员：中国医药设备工

2、程协会技术委员会 发行单位：中国医药设备工程协会 2湿热灭菌程序的验证：灭菌程序的设计、开发、确认以及日常控制 目录 1.0 引言 .4 1.1 范围 4 2.0 术语 .5 3.0 灭菌科学 .11 3.1 灭菌模式 .12 3.1.1 耐热参数（ DT） .13 3.1.2 温度系数（ z值） .15 3.1.3 灭菌率（ Lethal Rate）和累计杀灭时间（ lethality， F） 16 3.2 灭菌指示剂 20 3.2.1 生物指示剂（ BIs） 20 3.2.2 化学监测器 .21 3.3 热力学和蒸汽质量 22 3.3.1 温度和热量 .22 3.3.2 蒸汽 .28 3.

3、3.3 纯蒸汽质量的测试 .28 4.0 灭菌程序的开发 30 4.1 设计方法 .30 4.1.1 灭菌程序设计方法中残存曲线的应用 .31 4.2 装载类型 .34 4.2.1 多孔 /坚硬装载的定义 34 4.2.2 液体装载的定义 .34 4.3 灭菌程序 .35 4.3.1 饱和蒸汽灭菌程序 .35 4.3.2 空气加压程序 .38 4.4 灭菌程序的开发 .40 4.4.1 多孔 /坚硬装载灭菌程序的开发 40 4.4.2 液体装载灭菌程序的建立 .45 4.5 稳定性研究 .48 5.0 灭菌程序的性能确认 48 5.1 物理确认 .49 5.1.1 热分布 .49 5.1.2

4、热穿透 .49 5.2 生物指示剂确认 .50 5.2.1 生物指示剂挑战系统 .50 5.2.2 生物指示剂的使用和放置 .51 5.3 灭菌程序性能确认合格标准 .52 5.4 等效灭菌器 53 5.5 分组法 .54 5.5.1 典型产品法 .54 5.5.2 典型容器规格 /装量法 54 35.5.3 典型物品法 .54 5.5.4 典型装载法 .54 6.0 日常工艺控制 55 6.1 常规放行 .55 6.2 灭菌器系统的适用性试验 .55 6.3 变更控制 .55 6.4 灭菌程序定期再确认 .56 7.0 参考文献 56 41.0 引言 PDA 的原始技术报告第一期 “蒸汽灭菌

5、程序的验证 ”于 1978 年出版，它为一代制药科学家和工程师介绍了蒸汽灭菌的原理。原文的重点是湿热灭菌的微生物学和工程设计，本修订版仍以此为中心，并通过更新以包括近代出现的课题。本报告参考了最新的科技出版物、国际法规文件、期刊文章、技术论文和书籍，从中可查得更多详细并有说服力的数据和资料。 特别工作小组的主要目的是编写一个湿热灭菌的科学技术报告， 它可在所有监管的法规环境中加以应用。报告并不立足于阐述区域性法规的要求，而是向工业和监管部门提供最新的科学建议。应将本报告看作一个指南。本文无意确立湿热灭菌验证的标准，它只是对现有参考文献 作系统的 回顾和总结。 特别工作组由欧洲和北美工业界和监管

6、方面的专家组成，以保证所述方法、术语和做法具有良好的科学性，以致可以在全球范围内加以应用。本技术报告曾以草案的形式，在公开征求意见后出版，以保证其作为一个有价值的资料，能够指导工业界的蒸汽灭菌。 本技术报告总体目标是提供理解湿热灭菌科学所需的必要信息及技术细节， 为制订灭菌方针提供方便。 1.1 范围 新的标题“湿热灭菌的验证 -灭菌程序的设计 、 开发、确认和日常监控”反映了本技术报告的重点放在生产上。 报告按逻辑次序编排，从灭菌科学的原理 /要素开始，然后是灭菌程序的开发和灭菌程序的确认，见图 1.1-1。 图 1.1-1 灭菌科学的应用 5为便于理解报告的内容，本文开头就列出了技术性术语

7、（包括同义词） 。围绕 “验证 ”这一总的主题，按图 1.1-1 的程序讨论了 包括热力学（ 第 3.0 节 ）在内的 微生物学、灭菌科学和灭菌程序， 因为 它们本指南 图 1.1-1 所述 内容的 基础。 工艺开发（ 第 4.0 节 ） - 介绍了药品生产中实际应用的灭菌程序（过度杀灭和按具体产品特点来确定程序）的设计理论。可用决策树来指导怎样选择各类产品最恰当的灭菌程序。为了方便评估灭菌工艺不同阶段的风险，列出了液体和多孔 /坚硬1装载灭菌工艺参数示例表。本节指导产品或物品的湿热灭菌法的使用者，如何将灭菌科 科 学的理论应用于实际。 灭菌工艺的性能确认 （ 第 5.0 节 ） - 是灭菌程

8、序验证的核心。 采用物理和生物指示剂 （下文中有时会采用 BI 表述）二种方法来阐述一个生产企业或其他设施灭菌程序的性能确认。它在讨论中包括了必要的实践和科学理论，以证明灭菌系统达到了所要求的杀灭效果（ lethality） 。 日常监控（ 第 6.0 节 ） - 阐述日常性能监控的要求，以保持灭菌程序的受控状态。本节还包括变更控制、系统适用性及定期再确认的内容。 并不要求将本技术报告中所述概念，应用于包括医院在内的实验室或者其他 无 cGMP要求 的单位。本技术报告中没有包括其他一些重要因素，如设施、设备、维护保养、公用工程和分析方法的确认。 2.0 术语 每个公司对术语的使用不尽相同，有一

9、些术语将来可能会发生变化。然而，在一个公司内，验证方案中所采用的术语必须清晰、明确，易于理解。监管部门的指南可能会采用另一些定义， 应考虑这种情况。 本技术报告采用以下术语并同时附上相应的定义及必要的同义词。 空气检测器 Air Detector 安装于饱和蒸汽灭菌器上用以检测灭菌器腔室中空气的装置。 空气增压灭菌程序 Air Overpressure Sterilization Process 指在大于饱和蒸汽压的控制压力下运行的湿热灭菌程序， 通常用压缩空气使灭菌腔室达到所需的压力 空气去除试验 Air Removal Test 用于评估灭菌器空载条件下空气去除和蒸汽穿透的一种试验（例如，

10、 Bowie-Dick 测试法，DART， Lantor Cube， Browns 测试法） ，此类灭菌器用于多孔 /坚硬物品类装载的灭菌。 生物指示剂挑战系统 Biological Indicator Challenge System 一个含有纯的特定的菌株的活的微生物测试系统，此系统对某一灭菌程序具有规定的耐受性。 (1) 同义词： BI Challenge System-生物指示剂挑战系统， Microbial Challenge-微生物挑战， Microbiological Challenge System-微生物挑战系统 1译注：原文为 Porous/hard goods loads

11、，曾考虑译成多孔 /固体装载，但在本指南中，这类装载包括过滤器、胶塞、软管、拖把、工作服、塞子、清洁器具或设备的更换部件， hard goods loads 可指设备的更换部件，如灌装针头等，故译为坚硬装载。 6生物指示剂确认 Biological Qualification 采用生物指示剂来证明整个装载（被灭菌品）始终能达到所规定生物杀灭时间（ FBIO值 ）的试验。它是性能确认的组成部分。 分组 法 Bracketing Approach 将待试验的产品和（或）装载按其特性（如粘度、容器规格、装量、物品大小、装载方式）在上和（或）下限进行确认及验证的科学方法 仪器的校准 Calibrati

12、on 采用与相关标准或者源于国内或国际的标准进行比较， 以证明一项仪器或设备所得结果符合规定限度标准的活动。 灭菌器腔室 Chamber 灭菌器用以放置被灭菌物品的主要组成部分。灭菌器腔室是一个有额定压力的容器。 灭菌器腔室的冷点 Chamber Cold Spot 在灭菌程序中，装载区域中被灭菌品 F0值最低和 /或热分布试验中温度最低的位置。 灭菌器腔室的升温时间 Chamber Heat-Up Time 从蒸汽进入灭菌器腔室 开始 至加热介质达到设定灭菌温度的时间。 腔室检漏试验 Chamber Leak Test 为评估真空条件下灭菌器腔室中是否有空气渗入而进行的试验。 同义词： Va

13、cuum Leak Test真空检漏试验 。 化学指示剂 Chemical Indicator 系指根据受热导致物理或化学变化的原理，显示一个或多个预定变量的试验系统（ 2）2。 多变量 化学指示剂 Chemical Integrator 能定量地反映灭菌程序中多个变量（尤其是时间、温度和某些情况下的湿度）累计变化的系统3冷却阶段 Cool-Down Phase 指灭菌程序中灭菌完成之后的阶段。通常须定义冷却阶段的参数，以符合有些用户对被灭菌品冷却和干燥的技术要求。 容器的冷点 Container Cold Spot 指灭菌程序中，密封液体容器中 F0最低的位置。 蒸汽干度 Dryness F

14、raction4一个蒸汽样品 中， 实际潜热与饱和蒸汽理论潜热之比。 2括号内均指参考文献 3译注：参见 USP STERILIZATIONCHEMICAL AND PHYSICOCHEMICAL INDICATORS AND INTEGRATORS 4所谓干度，是指每千克蒸汽中含有干蒸汽质量的百分数。 Dryness Fraction 与 Dryness Value 为同意词。 7干度值 Dryness Value 近似蒸汽干度且无单位的测试值。 DT值 DT-Value 耐热参数5在规定的灭菌条件下，使所用生物指示剂的数量下降一个对数单位，或杀灭 90%所需的时间。在湿热灭菌中， D 值总

15、需注明参照温度，即以 DT表示。例如，一个 D121=1.4 分钟的生物指示剂系统，表示在 121下，杀灭 90%的芽孢需要 1.4 分钟。 平衡时间 Equilibration Time 指灭菌器的参照测试点（通常是排水口）达到最低灭菌温度开始，到装载中所有点均达到灭菌温度之间的时间间隔。 它 体现了 灭菌器去除装载中 空气 并对其加热的 能力 。 通常要求将热穿透探头放置在多孔 /坚硬 装载中才能对此进行评估。 灭菌保温阶段 Exposure Phase 系指灭菌程序中，为获得 设定 杀灭效果，保持设定灭菌温度的持续时间（保 温时间或保温 阶段）。 F 值 F-Value (lethali

16、ty Factor) 累计杀灭时间 系灭菌效力的度量值。 F(T，Z)是在规定的 Z值下，一个灭菌程 序 赋予一被灭菌物品在参照温度T下的等效灭菌时间，简称 T灭菌时间。 Fphy系指以灭菌程序的物理参数计算的物理杀灭时间。 Fphysical- 是灭菌率 L对时间的积分值 。 L（灭菌率）用公式： L=10（T-Trefe)/Z计算。 注意 ：参照温度 121.1在数学 上 近似 250F，为简化计算，本文此后将采用 121。 F0值（标准灭菌时间），是指 Z取 10时，一个湿热灭菌程序赋予被灭菌品 121.1下灭菌的等效灭菌时间。例如，当生物指示剂的 z取 10， F（ T=121.1，

17、z=10）赋 予 产品 8分钟 的 程序，或 F0为 8，与一个 116灭菌 25.9分钟方形灭菌波是等效的， F0均为 8。 FBIO系指灭菌程序的生物杀灭时间。它 是生物 指示剂挑战试验 系统中微生物 实际杀灭 效果的量度 。生物杀灭时间可以 DTLR计算获得，这里， DT是生物指示剂系统以 T度为参照温度 下的 D值 ， LR是 灭菌过程中生物指示剂 实际 的 对数单位下降值 （ logLgN0-Lg NF） 。 阴性分数法 Fraction-Negative Methods 阴性分数法是指根据生物指示剂的 初始菌 数（ N0）以及 有效暴热时间 建立二点 存活曲线获得的数据 并依此确定

18、 DT值的方法。 有效暴热时间 是 指 试样 灭菌 的时间范围， 在此范围内被灭菌的 一组 试 样， 应得到 两 个相反 的结果 ， 即一些样品为阳性，另一些样品则为阴性。 重力置换程序 Gravity Displacement Process 以 冷空气比进入腔室的蒸汽重而沉降在腔室底部 的 原理 而运行 的灭菌程序。 当蒸汽进入腔室时，将冷空气及冷凝水通过疏水器从底部排出。 5在 ISPE的工业蒸汽灭菌的文献中， D=Decimal Reduction，下降一个十进制的级别（对数单位）。 8半周期灭菌 程序 的确认 Half-Cycle Qualification 用灭菌时间的 50%来证

19、明灭菌程序效率的确认方法。 将 半周期灭菌 程序达到的物理和生物杀灭时间乘以 2，即 可获得 整个灭菌程序的杀灭 时间 。 热量 Heat 物体和其环境之间因温差而转移的能量。 热穿透 Heat Penetration 为评价灭菌器腔室内 传递给 被灭菌品能量而进行的温度测试。热穿透测试时，探头应放置在被灭菌品上或被灭菌品中。 加热阶段 Heat-Up Phase 指灭菌程序达到灭菌温度前的阶段。 应制订这个阶段的工艺参数（如排除空气及预热） ，以满足用户 具体 装载方式的要求。 泄漏率 Leak Rate 在腔室检漏测试时，测得的进入灭菌器腔室空气的量的速率。泄漏速率不 得 超过一定限度，否

20、则，在去除空气或真空干燥阶段会妨碍灭菌程序的 正常运行 。 液体装载 Liquid load 指密闭在容器的液体产品。能量透过容器传递给药液从而实现产品的灭菌。 装载区 Load Zone 指灭菌腔室内可放置被灭菌物品的区域。 最大装载 Maximum load 一个灭菌器内允许的最大装载量。 最小装载 Minimum Load 一个灭菌器内允许的最小装载量。 最低可接受程序 Minimum Acceptable Cycle (MAC) 在操作规程中规定装载获得最低 F0的程序。 混合装载 Mixed Load 指对灭菌 有不同挑战要求的多类装载。例如有些装载需挑战去除空气的能力，另一些则需挑

21、战其数量。 湿热 Moist Heat 指用于灭菌的蒸汽、蒸汽 -空气混合物以及过热水。 不凝性气体 Non-condensable Gases 系指不能 凝结 成液态并在灭菌条件下不会释放潜热的空气和其他气体。 9运行参数 Operating Parameters 用来定义每一个灭菌阶段（如加热、灭菌和冷却）且需要加以控制和正确测试的参数（如时间、温度和压力） 。 关键参数 Critical Parameters 需要控制和 /或测量且与产品的安全和功效相关的参数。关键参数不合格时，被灭菌产品不得放行。 重要参数 Key Parameters 需控制 /和测试以保证灭菌在 “受控状态 ”正常

22、运 行 的参数。重要参数不合格时，需进行调查并有说明合理处理装载的文件和记录。 过度杀灭程序设计法 Overkill Design Approach 只需要很少产品 生物负荷 信息的灭菌程序设计法 -在假设 生物负荷 最差情况下，来确定使被灭菌品达到微生物存活概率 10-6的杀灭时间。使用本设计法时，性能确认方案必须能够证明FBIO和 FPHY均大于 12 分钟。 参数放行 Parametric release 根据有效的控制、监测以及灭菌工艺验证的数据资料，对产品的无菌保证进行评价，以替代根据成品无菌检查结果的无菌放行系统。 热穿透测温探头 Penetration Probe 与装载接触或放

23、入液体容器内，用以测试装载或液体温度的探头。 物理确认 Physical Qualification 性能确认中用以证明达到预定物理要求的那部分内容， 包括全部装载始终如一地达到热分布和热穿透的要求。 多孔 /坚硬 装载 Porous/Hard Goods Loads（ P/HG） 系指通过与饱和蒸汽直接接触而杀灭其中微生物的被灭菌物品。多孔 /坚硬 装载包括过滤器、胶塞、软管、拖把、工作服、塞子、清洁器具或设备的更换部件。 预真空程序 Pre-vacuum process 一个需要用真空泵或其它机械系统去除空气后才开始灭菌的灭菌程序。 此方法尤其适用于夹带空气的物品，如胶管、过滤器和灌装机的

24、部件。 非无菌单元的概率 Probability of a Non-Sterile Unit（ PNSU） 描述灭菌后非无菌单元 /产品出现概率的数字。在制药工业中，预期的设计终点是非无菌单元出现的概率 百万分之一，即 PNSU10-6或更优。 同义词：无菌保证水平（ SAL） 灭菌程序的性能确认 Process Performance Qualification6指有文件及记录的确认，以证明一个系统，根据书面的预先确定的技术标准并在规定的运行环境中运行时，能够始终如一地完成或控制所要求的灭菌活动。 6本指南 1.1 表中只有 灭菌 工艺 ，如 不提灭菌 ，易误解成整个生产过程 （ 包括 称

25、量、配液、 过滤、 灭 菌 、包装 等）了 ，因此加 了“灭菌” 二字。 10按产品特性设计灭菌程序的方法 Product-specific Design Approach 根据 装载上或装载中 生物负荷 的特性和产品的耐热性设计灭菌程序的方法， 产品的灭菌程序所 规定 的灭 菌 时间，可使产品达到 10-6的非无菌概率。 纯蒸汽 /清洁蒸汽 Pure Steam 其冷凝水符合美国药典专论 “注射用水 ”（ WFI）要求的蒸汽。 （ 4） 耐热性测试仪 Resistometer 一个设计用以确定一个灭菌程序物理和 /或化学变量的设备。它以前的正式名称为生物指示剂耐热性评估 仪 （ biolog

26、ical indicator evaluator resistometerBIER vessel） 。主要用于实验室对 D 值和 z 值 的测试 。 （ 5） 常规运行的程序 Routine Operating Cycle 指日常灭菌运行的各种参数。 为了 获得 更高的无菌保证 水平 ，日常运行的灭菌程序的灭 菌 时间要 大于 最低可接受的灭菌程序 。 饱和蒸汽 Saturated Steam 指 处于 水蒸发曲线对应点压力及温度的蒸汽。它是蒸汽中不夹带液态水，处于汽液平衡状态的蒸汽。 同义词：干饱和蒸汽 饱和蒸汽程序 Saturated Steam Process 指采用饱和蒸汽为灭菌介质，

27、主要用于多孔 /坚硬装载的灭菌程序。 蒸汽 -空气混合气体的灭菌程序 Steam-Air Mixture（ SAM） process 一个 以 空气和蒸汽混合物 为加热介质 的灭菌程序，它通常用于液体灭菌。 引 入空气的 结果 是造成空气 加 压的 条件 。 灭菌 Sterilization 指用以使一个产品达到规定微生物存活概率的工艺过程。 无菌保证水平 Sterility Assurance Level（ SAL） 指灭菌后，一 个 被灭菌品 中（或上） 单个活菌存在的概率。 同义词： PNSU 说明 ： SAL 取的量值通常为 10-6或 10-3。用这个量值来评价无菌保证时， 10-6

28、比 10-3的灭菌保证水平要好得多。 （ 6） 灭菌程序 Sterilization Cycle 指使物体成为无菌的一系列运行参数（例如时间、温度、压力）和条件组成的程序。 灭菌运行 Sterilization Run 指灭菌程序的运行7过热蒸气 Superheated Steam 在一定压力下，其温度高于水蒸发曲线所指示温度的蒸汽。 7译注：也可理解为灭菌的次数。 11过热水 Superheated Water 指在 100以上并需一定压力才能保持液态的水。 过热水程序 Superheated Steam Process 指在空气加压条件下，以过热水为加热介质持续循环的灭菌程序。这个程序 中

29、， 加压是为了保持水的液体状态。 同义词：水喷淋、水浸 没 、水淋、蒸汽 -空气 -水循环程序 存活曲线 Survivor Curve 在设定的条件下，微生物存活数随暴露于灭菌剂时间的增加而减少的曲线图 。 系统适用性评估 System Suitability Evaluation 证明灭菌系统日常运行受控而定期频繁地进行的各种物理评价 （如腔室的完整性或空气的去除） 。 温度 Temperature 温度是热能的度量。 热分布 Temperature Distribution 指对腔室中整个装载区域加热介质温度的测试。 最终灭菌 Terminal Sterilization 系指产品在其无菌

30、密封系统中的灭菌。 （ 8） 验证 Validation 一个能够科学地确保生产工艺生产出合格产品的有文件和记录证明的程序。 验证的证据应通过验证方案的合理设计并对数据资料进行科学、全面评估获得，这些数据资料最好始于工艺的开发阶段，直至商业化生产。 最难灭菌的装载 Worst-Case Load 系指经确认为最难灭菌的装载方式。 它是灭菌程序控制策略及装载特性的函数 （如装载数量、装载方式、或去除空气） 。对于多孔 /坚硬装载而言，最难灭菌的装载未必是最小或者最大装载 。 z 值 z-value 使 D 值变更一个对数单位温度需调节的度数。它可用 于 累计一个灭菌程序 在 加热和冷却阶段随温度

31、变化的杀灭时间。 3.0 灭菌 科学 本节阐述灭菌程序的设计、开发和确认所采用的各种科学手段。 123.1 灭菌模式 实验 表明 ，在恒定的热力灭菌条件下，同一种微生物的死亡遵循一级动力学规则（也叫存活曲线） （ 9） 。微生物死亡速率是微生物的耐热参数 D 和杀灭时间的函数，它与灭菌程序中微生物的数量无关。存活曲线可以用下面的半对数一级动力模式来表示： Lg NF=-F(T,z)/DT Lg N0等式 1 式中： NF灭菌 F 分钟后微生物存活的数量 F(T,z)灭菌程序在确定 的 温度系数 z 下的 T 等效 灭菌时间 DT微生物以分钟为单位的 T 耐热参数。说明：该特定温度必须与 F值计

32、算中所采用的温度相一致 N0初始微生物的数量 图 3.1-1 系生物指示剂的上述半对数存活曲线的图解。 图 3.1-1 半对数模型的微生物存活曲线 N0=10N0=10NF=N30min=10 6N0=105N0=104N0=103N0=102N0=101N0=100N0=10-1N0=10-2N0=10-3N0=10-4N0=10-5N0=10-6-66909999.999.9999.99999.9999杀灭的百分率残存数概率区51015202530DT 为2.5分 钟 每个单元中存活数量(N)T 灭菌时间 F T,Z 值 在图 3.1-1 中， DT是存活曲线斜率的负倒数；因此，它体现了微

33、生物存活数与灭菌时间（ F 值）之间的关系。 F 值是该模式中用以表示湿热灭菌时间的参数。根据定义， F 值以参照温度表示， 因此， 它真实代表了灭 菌 程序在该灭菌温度下的杀灭时间 （ T 等效灭菌时间） 。由于常规的灭菌程序一般不会是方形波（即在灭菌程序中，被灭菌品不可能瞬间达到设定的灭菌温度，精确保持此温度，然后瞬间完成冷却） ，因此，在半对数模式中，需要用 z 值（温度系数）来计算不同温度下的灭菌率。本文将在 3.1.1-3.1.3 节中，对这些术语（ DT、 z、 F13值、 L）作详细介绍。 为了将半对数存活曲线科学地应用到灭菌中去，试验必须采用同类菌株，并在恒定的 F值 （或能计

34、算等效灭菌时间 F 值） 下进行。 半对数模式并不能精确地与所有微生物灭菌试验的结果相吻合； （ 10）但是迄今为止，并没有发现其他的模式能够与所有微生物灭菌的试验数据完全吻合。 一种模式或数学关系式之所以实用，一般应具备三个条件（ a）对系统（灭菌程序）有代表性； （ b）能预示系统的功能； （ c）有一定道理，易于理解和应用。 微生物存活曲线的图示，恰当地以示例方式描述了存活曲线等式（ 等 式 1）的应用。可直接用半对数存活曲线模式或用作图方法来分析实验数据，设计灭菌程序。此半对数模式符合上述要求，可用于湿热灭菌实验数据的分析及设计。利用它，可进行双向计算 从微生物灭菌的实验数据的来推算物

35、理参数，从物理参数来计算预期的微生物存活数据。 该模式在灭菌程序设计中的应用将 在 4.1 节 中讨论。此模式在灭菌程序生物指示剂验证中的应用将 在 5.2 节中 介绍。 3.1.1 耐热参数（ DT） 湿热灭菌中，在规定的灭菌条件（如 T）下，使生物指示剂的数量下降一个对数单位，或杀灭 90%所需的时间。 DT是图 3.1-1 中所示存活曲线斜率的负倒数。 y 轴上一个对数单位的变化表示微生物存活数 10 倍的变化； 因此， DT值是存活曲线微生物变化一个对数单位时，x 轴上位移的时间或 F 值（等效灭菌时间） 。 应当注意，严格说来， DT值并不是任何一种微生物的遗传特 性。当用一级动力学

36、存活曲线模式来描述生物指示剂对某一灭菌剂的耐受特性时，才获得 DT的经验数值。参阅 3.2.1节，该节将对可能影响生物指示剂耐热性的各种因素进行讨论。 有二种方法可从存活曲线确定 D 值： 1）直接计数法； 2）利用二点数据法（ N0及 由 阴性分数法 在 额定灭菌时间 范围内计算而得的另 一个点） 。 3.1.1.1 直接计数法 此法要求在灭菌时，不要将生物指示剂全部杀灭，灭菌后，即对残存的芽孢计数。然后，在半对数曲线上将结果以存活数对灭菌时间（等效 暴 热时间）作图，再根据曲线的斜率确定DT。 DT值即是最佳数据点所组成直线的负倒数。必要时，可通过线性回归分析，来确定最佳曲线的斜率。 微生

37、物残存曲线示例 用图 3.1-1 的数据，可得到以下生物指示剂（ BI）残存曲线的等式： Lg NF = -F(T,z)/DT Lg N0Lg NF = -F/2.5 Lg10614还可用此等式来计算灭菌 F 分钟后，预计的孢子数 NF 。如果灭菌时间的物理参数是 30 分钟， NF为 10-6，也就是说，灭菌 30 分钟后，孢子存活的概率为一百万分之一，计算式如下： Lg NF = -F/2.5+ Lg106Lg NF = -30/2.5+ Lg106Lg NF = -12+6 Lg NF = -6 NF = 10-6也可将此等式重排，根据灭菌后生物指示剂的测得的残存数来计算灭菌时间 F（杀

38、灭时间） F = （ Lg N0-LgNF） DTF = （ Lg 106-Lg2103）2.5 分钟 F = （ 6-3.3）2.5 F = 6.75 分钟 3.1.1.2 阴性分数法 阴性分数法采用 N0及 额定灭菌时间 范围 中的一个点组成一条线，由此确定 DT值。 额定灭菌时间范围 是指在灭菌的某个时间区域内，一组平行的试样会呈现两种结果的区域，即一些为阳性结果，另一些为阴性结果。有两个主要的方法可用以分析阴性分数法的数据，以确定残存曲线二点的 NF值： y Holcomb-Spearman-Karber 法。在此方法中，将 额定灭菌时间范围 所有的数据通过加权平均法合并起来，得到与每

39、个生物指示剂 NF平均存活数为 0.56 相对应的平均时间（ 11， 12， 13） y Stumbo-Murphy-Cochran 法 （ 14） 。 此法要用 Halvorson-Ziegler 的最大可能数法 （ 15）对 额定灭菌时间 区域中的每个数据逐个分析，来确定每一组数据的 NF，然后确定DT值。再对这些 DT值求平均值，以确定测试的 DT值。 Holcomb-Spearman-Karber 法能够计算 DT值可信度的范围， 供评估试验数据的质量和可靠性参考。 需要特别注意的是，应用统计学方法计算 DT值时，需严格遵循统计分析的规则。试验中采用的生物指示剂应是平行试样，且必须来

40、自 同一生物指示剂的批号。如果是企业自己制备试样，则试样应该取自同一批生物指示剂的悬浮液，且制备方式完全相同。试验中的培养计数 步骤应完全一致。唯一的变量只是蒸汽灭菌的时间。 此外，对每组某一灭菌时间平行试验的样品而言，试验必须保证每个试样的灭菌时间相似。通常用耐热性测试仪在实验室中完成此试验。当样品不是实际的平行试样时，不宜采用这类测试方法。例如，当生物指示剂分布在整个灭菌腔室时，不应当用这些方法来评价生产用灭菌器中 BI 的杀灭情况。在此种情况下，因整个灭菌器中灭菌率的均一性难以保证，因此，不能将这些生物指示剂试样看成平行样品。 在 DT值测试中，保证每个灭菌试验条件的一致性是至关重要的。

41、一个正常运行的耐热性测试仪是实现一致性理想的机械装置，因为它可以产生近似于脉冲的方形波，加热和冷却时间极短（见 图 3.1.1.2-1） 。 图 3.1.1.2-1 耐热性测试仪的典型温度曲线带格式的: 德语(德国)15温度9095100105110115120125130121时间(分钟)在以下情况下，通常有必要测试 DT值： y 按产品特性设计灭菌程序需要确定产品分离菌的耐热特性时 （产品分离菌通过热休克8获得） ； y 评价处方变更对 耐热性 的影响时； y 在常规生产中，需要确定从生产环境分离出耐热菌的耐热特性时； y 当需要确定 作为生物指示剂 用 的 直接接种到物料或产品 中的耐热

42、孢子 的 D 值时。 3.1.2 温度系数（ z 值） 孢子耐热性随温度变化而变化的特性可用 z 来表示。 z 值是 DT值变更一个对数单位时，温度需调节的度数。它类似于半对数模式中的温度系数。在比较不同温度下对孢子的灭菌率时，需要用 z 来计算 F 值。 例如， 生物指示剂挑战系统的 z=8， 即温度每变化 8， DT值将会改变一个对数单位。如果生物指示剂挑战系统的 D121为 1.6 分钟， 那么 D129即为 0.16 分钟， D113为 16.0 分钟。温差的正确测量单位是开氏温度， 在任何情况下， 开氏 （ Kelvin） 温度变化 1与摄氏 （ Celsius）温度变化 1是完全一

43、致的。为了简化起见，本文将全文采用摄氏温度。 湿热灭菌通常总 设定在 一个小的温度范围以内，例如 110-135之间，因此，在实际使用中， 通常将经验测试值 z 看作一个常量 （ 16） 。 常规灭菌程序设计和评估中 z 取 10或 18F。在对比平衡灭菌赋予产品的物理杀灭时间和生物杀灭时间 F 值的试验中，必须使用实际的生物指示剂的 z 值来计算物理杀灭时间 FT。 z 值可由几种方法确定；然而，采用得最多的方法还是通过 D 值的测试来确定 z 值。在不同温度下测得一组 D 值，取对数，然后以 y 轴为 D， x轴为温度作图。将数据点连成一条直线。 z 值是 D 值改变一个对数单位所对应温度

44、变化的度数，例如由 2.0 分钟变为 0.2 分钟，或者由 0.3 分钟变为 3.0 分钟。与 D 值类似， z 值是此直线斜率的负倒数，参见耐热性曲线（ 图 3.1.2-1） 。 （ 17）在应用 z 值时，要根据预期的用途，采用摄氏温度（开氏）或华氏温度（ Fahrenheit）来表述，并考虑好温度的数值范围。 8译注： 指 80-100下加热 10-15 分钟， 指南 后文中有说明 。 16图 3.1.2-1 耐热性曲线 生物指示剂耐热性分钟10-1100温度(T), 110 120 130101102Z-值=10 D120 =1.0分钟D110 =10分钟(DT值)3.1.3 灭菌率（

45、 Lethal Rate）和累计杀灭时间（ lethality， F）9在湿热灭菌中，所有生物学的测量，无非是将参照温度下（ Tref）的等效灭菌时间与该温度下对微生物的杀灭时间相关联。采用 z 来计算灭菌率，测试时间 -温度并将获得的数据累计，这样也就获得了灭菌工艺的模式。 各种灭菌器是设定在特定温度下运行的，然而，实际温度可能会在目标值上下一定的范围内波动。这个波动有时可能并不体现在灭菌程序的记录上，它取决于记录设备的精密度和灵敏度。尽管这个波动通常不大，但对 F 值的可能会有明显的影响，尤其是灭菌温度大部偏在目标值的一侧时，影响更为明显。 F 值的计算考虑了所有偏离目标温度的波动情况，以

46、减少单个温度观察值对杀灭时间（ delivered lethality，总等效灭菌时间）的影响。杀灭时间是灭菌程序中灭菌率的累计值（积分值） 。 3.1.3.1 灭菌率（ L， Lethal Rate） 9因 讨论的对象 是灭菌，所以考虑取 “ 灭菌率 ”的提法 。 Lethality 原拟译作 杀灭力 ，但中文中率与力的音相似，难以区分，故考虑译作“杀灭 时间 ” 。累计杀灭时间这种提法 有助于理解原意 。如果是 121下灭菌， z 取 10，则 可理解 为标 准的灭菌条件 ，与 Fo 相呼应 并称 Fo 为 标准灭菌时间，与中国药典一致， 它 已 包括 了“累计”的内涵。需要指出另一个问题

47、是 121 是饱和蒸汽压为 2 个大气压时所相应的温度 。 当取 其它灭菌温度 时 ，则应标出 具体的灭菌 温度。 17为了理解如何确定一个灭菌程序的杀灭时间（ F 值） ，有必要首先理解灭菌率（ L） 。灭菌率可以通过以下等式计算得到： （ 18， 19， 20） L(Tref,z)=10(T-Tref)/z等式 2 式中： T = 被加热的物体的实际温度 Tref = 参照温度 z = 试验生物指示剂的 z 值（如未知，则取 10） 灭菌率是一个指数函数，因此，很小的温度变化就会对灭菌率产生明显的影响。例如，一个 z=10的生物指示剂系统中，温度降低 1，会使灭菌率减少大约 20%。这可采

48、用以下方法计算： L=10(120-121 )/10=10-0.1=0.79 因此， z 值 =10的生物指示剂系统，如以灭菌率来表示的话， 120下灭菌 1 分钟相当于 121下灭菌 0.79 分钟。 3.1.3.2 Fphysical值（ F物理 ） -物理灭菌时间10F 值是一个灭菌程序杀灭时间的量度。 F(Tref,z)是参照温度 TRef和温度系数 z 下以灭菌率计算，被灭菌物品获得 的 等效灭菌时间。由物理数据（时间和温度）计算得到 F 值也可以 F 物理 来表示。 F 值是整个灭菌程序中灭菌率的积分值。说得实际一点，这个积分值是通过对梯形模式的数字累计而得： FTref=d(L)

49、 等式 3 式中： d=每次温度读数之间的间隔时间 L=经计算的各个温度下的灭菌率 时间 -温度示例表阐述了分步计算灭菌率和 杀灭时间 F 值的方法。市 售 的数据采集设备中有程序，可自动完成计算并报告灭菌程序的 F 的增值和累计值。因用以确定灭菌率 L 的 z本身准确性不高，可规定积分开始和结束的最低温度（例如 100） 。在灭菌阶段，灭菌实际温度应接近所用的参照温度（ Tref） ，这点十分重要。 时间 -温度示例 表 3.1.3.2-1 时间 -温度、相应的灭菌率 L 及累计值 F（ T灭菌时间） 灭菌时间 (t) 物品温度 (T) 灭菌率 (L) 标准灭菌时间 (FPhysical) d=时间间隔 =1 分钟 腔室设定温度 =122 z=10 Tref=121F=Ld 10在表 3.13.2-1 中，物理灭菌时间即标准灭菌时间。 18分钟 T每分钟所相当T121下的分钟数 分钟 0 30.0 0.000 0.000 1 30. 0.000 0.000 2 30.0 0.000 0.000 3 60. 0.000 0