1、医药论坛243BIOTECHWORLD 生物技术世界生物技术世界药品生产质量管理规范(2010年修订版)附录1中对无菌药品的生产的洁净环境要求和环境监测更多强调在线监测和动态监测1。无菌药品生产中,尤其是无菌灌装过程,均大量使用动态沉降菌监测无菌生产过程,在层流区域,沉降碟具操作方便、对空气环境破坏较小、不会干扰气流方向、成本较低等优点,被广泛应用2。医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法(GB/T 16294-2010)中规定,动态测试时,培养皿的暴露时间为不大于4h3,药品生产质量管理规范(2010年修订版)中也规定动态沉降菌监测时间为4h,但单个培养皿暴露时间可以小于4h1,即考虑到培养皿
2、随着放置时间的延长其培养基会因为失水等原因影响微生物正常生长。我公司为确定合理的沉降菌监测时菌碟更换的时间,以及确认沉降菌暴露时间与培养基微生物回收率的关系,进行了试验。1 沉降菌暴露时间影响因素分析1.1 采样区域洁净室气流组织分为乱流和层流,根据药品生产质量管理规范(2010年修订版)附录1关于层流风速的要求,A级区的风速为0.36-0.54m/s(指导值),A级层流风速要求均高于其他级别的乱流洁净室,而风速是影响培养基失水量的重要因素,风速越高,培养基脱水速度越快,为在试验中挑战最差条件,试验区域选在A级区层流下,并将风速调节至标准上限。1.2 采样环境不同的生产操作步骤,洁净室的湿度控
3、制标准不同,一般日常湿度控制范围为45-65%,温度控制在18-26,环境湿度越低、温度越高,培养基脱水越快,对最终培养的微生物回收率影响也越大。为挑战最差条件,将试验条件控制在湿度45%或以下,温度在26或以上,尽量达到或超出标准要求上限,并在试验全程采用无线温湿度记录仪进行过程监控,确保全程能够满足挑战试验环境要求。1.3 培养基浇注量我公司沉降菌监测使用的为外购的一次性90mm平皿培养基,培养基为TSA,灌注量为25ml。外购成品平皿培养基配方和灌注量有规定的质量标准和专用设备浇注,故培养基浇注量影响不做考虑。在微生物回收率试验中,为了考察不同批次培养基的结果重现性,选择三个批号的一次性
4、90mm平皿培养基进行试验。2 试验材料2.1 材料90mm预灌装平皿(TSA培养基,上海诺狄生物科技有限公司,批号8309141008-3、8309141014-8、8309141022-6)、风速仪、无线温湿度记录仪、万分之一电子天平、三角烧瓶、刻度吸管等。试验菌株:枯草芽抱杆菌(CMCC(B)63501)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、白色念珠菌(CMCC(B)98001)。菌悬液配制:取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基内,33培养24小时,取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基内,25培养48小时。取上述培养液用0.9%的无菌氯化钠溶液制成
5、每1ml含菌数小于1000cfu的菌悬液。2.2 方法2.2.1 失水率测定培养基的微生物回收率与其含水量密切相关,在沉降菌监测时,培养基暴露于空气中,水分不断蒸发流失。为了考察暴露时间与失水率的关系,对暴露不同时间的沉降碟测量重量变化情况,以估计其失水率情况。沉降菌测试暴露时间与培养基失水率和微生物回收率的考察与研究李天翥 齐岩(哈尔滨珍宝制药有限公司 黑龙江哈尔滨 150060)摘要:针对洁净区动态沉降菌监测,对上海诺狄生物科技有限公司生产的一次性90mm平皿TSA培养基,在最差温湿度条件下考察了暴露30min、60min、90min、180min的失水率和暴露后对金黄色葡萄球菌、大肠埃希
6、菌、白色念珠菌的回收率,结果表明,在温度在30,湿度在40%,层流送风风速达0.54m/s条件下,暴露180min的一次性90mm平皿TSA培养基能保证各实验菌种培养需要。关键词:沉降菌 暴露时间 失水率 回收率中图分类号:R91 文献标识码:A 文章编号:1674-2060(2016)04-0243-02图1 预灌装平皿失水率试验温湿度记录曲线 图2 预灌装平皿回收率试验温湿度记录曲线作者简介:李天翥(1978),女,黑龙江省哈尔滨人,硕士,从事制药企业技术和质量管理工作。医药论坛244 生物技术世界 BIOTECHWORLD生物技术世界在A级区域送风风速调节至标准上限,高效过滤器送风口处用
7、风速仪测定,确认风速达到约0.54m/s左右。在操作台面上放置一台无线温度记录仪,设定为每5分钟记录一次,静置30分钟左右,待风速和温湿度平衡。将90mm预灌装平皿,共10块,均匀铺设在层流下方操作台表面,打开各个碟盖,按沉降菌监测方法操作,开始计时。分别在第30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟将沉降碟各取出2块,加盖、倒置密封备用。同时预留2块沉降碟不经暴露作为空白对照。将各沉降碟培养基挖出,用精确到0.01g的电子天平称重,操作时应迅速,以免培养基失水影响结果准确性。按以下公式计算不同暴露时间的沉降碟的失水率。2.2.2 微生物回收率测定根据我公司工作经验,培养基失水率超
8、过20%会对沉降碟的微生物回收率产生明显的影响。根据失水率测定结果,选择失水率达到20%左右的时间段作为控制时间。选择三个批号的90mm预灌装平皿,每个批号6块,在与失水率测定相同环境下,沉降碟暴露在控制时间、和上下各30分钟,共三个时间段后,每个时段回收每个批号的沉降碟2块。全程用无线温度记录仪监测温湿度。将暴露的样品沉降碟每个批号接种每个菌种菌悬液0.1ml,涂布均匀,另每个批号每个菌种做两个空白对照。另取菌悬液每个菌种接种两个新的沉降碟0.1ml,涂布均匀,测定本底菌数。接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌沉降碟置30-35培养72小时,接种白色念珠菌的沉降碟置20-25培养5天后观察结果。按
9、以下公式计算菌落回收率。3 结果暴露时间 失水率（%） 30min 1.79 60min 2.90 120min 6.86 180min 14.56 240min 22.02 回收率（%） 暴露时间 批号1 批号2 批号3 180min 77.2 79.8 77.7 210min 66.6 67.8 66.6 240min 57.2 62.1 51.6 回收率（%） 暴露时间 批号1 批号2 批号3 180min 78.6 75.0 74.4 210min 66.8 63.8 63.3 240min 57.8 57.2 52.1 回收率（%） 暴露时间 批号1 批号2 批号3 180min 7
10、8.9 78.1 68.5 210min 69.8 67.9 58.0 240min 59.1 53.9 53.0 表1 预灌装平皿失水率试验结果表2 金黄色葡萄球菌回收率试验结果表3 大肠埃希菌回收率试验结果表4 白色念珠菌回收率试验结果3.1 失水率测定结果试验温度在30左右,湿度略高于40%,暴露180min失水率达到14.56%,在暴露240min时失水率超过20%达到22.02%。估算在210min左右,培养基失水率可达到20%,故选择180min、210min和240min三个时间段进行下一步试验。3.2 微生物回收率测定结果试验温度在30左右,湿度略高于40%,三种菌种分别以三个
11、批号的预灌装培养皿作为平行组,从结果可见,暴露180min组三个菌种除白色念珠菌在批号8309141022-6样品中回收率为68.5%外,其他样品均能保证回收率达到70%以上,符合中国合中国药典二部(2010版)附录XIJ微生物限度检查法中关于试验菌回收率的要求。4 结论本试验创新性地纳入了失水率的考察,并将失水率和培养回收率建立了一定关联关系。本试验采用的环境为模拟最差条件,温湿度均超出标准,本公司使用的预灌装培养皿除去白色念珠菌的一组异常数据外,暴露180min能够满足沉降菌培养的需要。证明在最差条件下,培养基失水率控制在15%之内能够满足菌落生长的需要,在生产条件下,每3h更换动态沉降菌
12、监测培养皿能够满足环境监测需要。参考文献1药品生产质量管理规范(2010年修订版)附录一无菌药品.2王秀梅.浅析新版GMP无菌药品生产环境监测J.山东化工,2013,09:186-188.3中国国家标准化委员会.GB/T16294-2010医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法S.北京:中国标准出版社,2010.功能与抗病能力。此种方法的优点在于不用频繁按摩挤压睑板腺对腺管口造成机械性的破坏,能够长期起到自动梳理睑板腺口的作用,以促进睑板腺体及睑板腺管口的自我修复,以上治疗方法中需要注意的是,由于激素长期应用可引起激素性青光眼,也可诱发白内障,所以典必殊眼膏使用时间尽量控制在3周之内,艾灸仪由于
13、有热效应每次治疗控制到10钟内。由于对病例观察时间缺乏更长期的结论,以上浅见恳请同道给予指导。参考文献1钟刘学颖,李莹.导致睑板腺功能障碍的相关因素及治疗.国际眼科纵览,2006年10月第30卷第5期.2高莹莹.睑板腺功能异常研究进展.国外医学眼科学分册,2013年01期.3钟刘学颖,李莹.导致睑板腺功能障碍的相关因素及治疗.国际眼科纵览,2006年10月第30卷第5期.4刘泽源,李才锐.睑板腺功能障碍所致干眼的治疗.国际眼科杂志,2014年2月第14卷第二期.5朱依谆等.药理学第七版.人民卫生出版社,2011-08.6薛凤蕊.睑板腺功能障碍的临床治疗观察.基层医学论坛,2015年05期.7徐东,陈国孝,马纲,俞萍萍,张玲.睑板腺功能障碍的中医证候研究,浙江中西医结合杂志,2015(10):905-907.上接第242页
