1、Welcome to DXY.CN Forum 论坛首页 | 全文搜索 | 电子期刊 | 个人属性 | 注销登陆 标记已读 | 我的论坛 | 我的简历 | 我要招聘 | 帖子收藏 | 论坛帮助 Welcome to DXY.CN Forum 蛋白质技术讨论版 蛋白质技术讨论 打印话题 寄给朋友 原创菌体/细胞裂解法汇总 精华 KILLUAHUNTER发贴: 35 积分: 2 得票: 2005-12-06 23:11 由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。菌体/细胞裂解法汇总一、反复冻融法：1、将细胞在-20 度以下冰冻，室温
2、融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。http:/ 3 次以上冻溶。http:/ 推荐法：收集细胞悬液，4低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量 PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻 30 min，370C 解冻，如此反复 3 次，可形成细胞裂解液。http:/ 37 度水浴，溶解后震荡，再冻http:/ 状态: 离线 二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过 5 秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间 5 秒、间隙时间 10 秒、工作次数 20 次。ht
3、tp:/ 5 秒,每个间隔 5 秒,粉碎 5 次。http:/ 菌液离心，用 8ml 缓冲液悬浮，加 8mg 溶菌酶，冰浴 30min，然后超声处理。750W 40功率。 5 秒超声， 9 秒间隔。超声至少 90min。http:/ 离心，弃除上清。冰上，用小体积 PBS 重悬细胞。将重悬液集中，1500g 离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约 5 倍体积的 PBS 缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4下超声破碎细胞。加入终浓度为 0.25M 的 KCl，15mM 的 DTT。4 下 111500g60min 离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Pr
4、oteins from E. coli-Alternate Protocol三、渗透法：冰冷的 20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA 处理，冰浴放置 10min。精编分子生物学实验指南四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS 是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。http:/ loading buffer 加 SDS， 100 度 5 分钟，是变性方法。SDS 与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。
5、http:/ PAGE 胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白 loading buffer 煮沸 5 分钟即可，需注意的是上样前要离心 12000rpm 至少 5 分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。http:/ 毫升细胞裂解液配方:40 L 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。http:/ 1ml 菌离心弃上清，留大概 50ul，再加 50ul 2上样缓冲液，煮 10min，取 20ul 上样，就可以了。http:/ 1ml，12000g1min 离心。将沉淀重悬于 100ul 1SDS 上样缓冲
6、液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2SDS，0.1溴酚蓝，10甘油）中，100加热 3min，然后 12000g1min 离心。上样 15ul，6 SDS-PAGE 电泳。分子克隆P8268、5-10 秒离心，弃除上清，用 50ul 蒸馏水重悬沉淀。加入 1ul PMSF，再加入 50ul热的 2SDS 上样缓冲液（100加热）。迅速混匀后 100加热 3-5min。将样品冰上放置（或-20 放置），然后再溶解，煮沸 1min。离心 30 秒。上样 5ul 进行 SDS-PAGE 电泳。2SDS 上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2（w/v）DTT ，8
7、SDS，0.002（w/v ）溴酚蓝，40甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.59.0) ，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml 溶菌酶。http:/ NP40（NP40 ：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加 DTT 和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放 3060min，然后 13000rpm 离心15min，取上清定量。http:/ Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0.
8、02% 叠氮钠，100g/ml PMSF，1g/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。http:/ Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100g/ml PMSF、1g/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。http:/ ）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。推荐 RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系）， 150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （
9、强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 g/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂）， 5 g/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂）， 1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。http:/ buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（还原剂），7M 尿素，2M 硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金属鏊合剂），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/m
10、l pepstatin(蛋白酶抑制剂）， 50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3VO4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine（inhibitor of trypsin）。http:/ 0.5ml 诱导的细胞并离心 2min。弃除上清，用 100ul 1SDS 上样缓冲液重悬，冰上放置。6000rpm10min 离心培养物。弃除上清，用 10ml 预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15 秒、4 次超声处理细胞。冰浴降温。 4，9000g30min 离
11、心。取上清。裂解液：5 mM DTT，15 mM KCl，5 mM MgCl2，50 mM HEPES, pH 7.9，1 mM EDTA，10 mg/ml 溶菌酶（临用前加上 DTT 和溶菌酶）。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的 PBS 缓冲液悬浮沉淀。用 100 g/ml 溶菌酶处理并在冰上孵育 15 min。加上 10% N-laurylsarcosine (终浓度 1.5%)，然后超声波破碎。16000 rpm30 min 离心。取上清
12、然后加入 Triton X-100 至终浓度为 2.0%。过 Ni-NTA琼脂糖柱层析。 20021108 edited on 2007-07-15 23:43 有没有中级没过的啊？ biosepq大白龙 丁香园荣誉版主 发贴: 3194 积分: 262 得票: 5 状态: 隐身 2005-12-06 23:54 支持整理！ 欢迎来到蛋白质技术讨论版！ 【原创】兄弟们中级成绩可以查了 峨嵋九九2005-12-07 19:45 很好,非常感谢有心人 【原创 】脊柱微创介入治疗 发贴: 30 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 ahui107发贴: 35 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2
13、005-12-10 14:10 非常不错 【每周一问 】 NO.91-Epidural anesthesia（part1） ai 2005-12-10 21:53 kido发贴: 33 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 我想问一个问题，我想得到细胞膜上的蛋白该用什么裂解的方法？ 【help 】请教 DS-156 的一些问题,谢谢 caca214发贴: 3 积分: 0 2007-04-26 09:40 非常有用啊感谢楼主！辛苦辛苦！ 【 】是不是最后一门的分数大多 6264 居多？ 得票: 0 状态: 离线 wlln2006发贴: 2 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-04-2
14、6 10:52 佩服楼主！非常有用！谢谢哦！ 成绩大家都知道了,但是分数线呢?50?60?70? yxx442007-05-01 14:06 楼主，辛苦了，谢谢 【讨论 】中科院女博士论文造假被曝光 发贴: 31 积分: 4 得票: 0 状态: 离线 amberly我心本无乡，心安是归处 丁香园版主 发贴: 2316 积分: 303 得票: 75 状态: 在线 2007-05-01 17:32aikido wrote:我想问一个问题，我想得到细胞膜上的蛋白该用什么裂解的方法？是细菌的吗？破碎使用 French Press，1000 psi 过 3 遍（或以上）如果没有 French Press
15、，就用超声，效果没那么好。然后细胞低速离心（3000 g）去掉未破碎细胞，超高速（200 000g）离心得到膜碎片。然后用合适的 detergent 将膜蛋白从膜上释放出来。 论文版欢迎您 【共享 】一例胆战心惊的麻醉 muyx 2007-05-02 23:23【引 LZ 言】“由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料”楼主真可谓是性情中人也，佩服，佩服！八珍豆腐*人穷脸丑 发贴: 274 积分: 13 得票: 3 状态: 离线 【建议】园子里也可以搞 “定期悬赏” 来弄某一方面的总结吧，毕竟整理整理这么多的帖子不容易啊，那可是要阅贴无数的呀，加 1、2 分太寒碜了！ 不学则无术-)* 【社会人
16、文 】 丁香视点：2007 年度“全美最佳医院“ chrissqloo发贴: 100 积分: 2 得票: 0 状态: 离线 2007-05-04 01:09 谢谢楼主的的整理 中级考试可以查分了 zh 2007-05-05 12:55 aowantong发贴: 8 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 非常感谢！ 【准分子讨论】近视手术？医学界的一个阴谋 (转载.chenxi1965)- 是这样吗？ cdwmomo发2007-05-16 19:58 非常感谢啊 ！收藏 【眼底病讨论】男 .69 岁。视力右眼 0.6。左眼指数/30cm.左眼视力下降半年 贴: 22 积分: 0 得票: 0 状态
17、: 离线 Zhangyuxin521发贴: 12 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-05-16 20:45 谢谢!最近也一直没有找到很好的裂解方法,真是雪中送碳. 【分享 】精心总结的 28 号令与 17 号令对比申报流程！（ 17 号令与 28 号令讨论专贴，请勿另开新贴） qin02007-05-20 22:48 718发贴: 62 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 非常感谢！ 【活动 】北京战友丁香园七周年庆典活动图文报道（有关资料将陆续上传。） wdna圣斗士 发贴: 638 积分: 13 得票: 0 状态: 离线 2007-05-22 16:14 大家都感谢楼主付出
18、的努力啊，享受中 ing 北京金叶天翔公司授权淘宝网专卖店！以会员价专卖新编全医药学大词典医学文献王新编临床用药参考 http:/ 【活动 】北京战友丁香园七周年庆典活动图文报道（有关资料将陆续上传。） SK 2007-05-22 22:51 SRF发贴: 12 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 佩服楼主！非常有用！谢谢哦！ 【社会人文 】 丁香视点：2007 年度“全美最佳医院“ dujiaoshou脚气太厉害了 发贴: 284 积分: 10 得票: 0 状态: 离线 2007-05-23 08:56感谢楼主的辛苦劳动,为人民服务 ,无私奉献最光荣. 【准分子讨论】近视手术？医学界的一个
19、阴谋 (转载.chenxi1965)-是这样吗？ downsup2007-05-24 15:57 发贴: 6 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 想问个问题,丝状真菌细胞怎么裂解啊 ? 【活动 】有多少爱可以重来？从学生到医生 lympin喜欢丁香花 发贴: 195 积分: 11 得票: 0 状态: 离线 2007-05-26 15:17 aikido wrote:我想问一个问题，我想得到细胞膜上的蛋白该用什么裂解的方法？我们实验室用 pierce 公司的 Mem-PER 裂解液抽提细胞膜蛋白，效果很好 【help 】请教 DS-156 的一些问题,谢谢 meihaixiangguo2007
20、-05-26 19:37 昨天我师姐带我做过一次大肠杆菌的裂解，在超声之前加了眯唑，我不知这是否属于裂解液啊？ 中级考试可以查分了 发贴: 23 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 learnholic发贴: 69 积分: 1 得票: 0 状2007-07-15 20:57 哈哈,佩服 【讨论 】中科院女博士论文造假被曝光 态: 离线 aliao_cmu发贴: 6 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-07-16 14:52 辛苦了，楼主，谢谢 成绩大家都知道了,但是分数线呢?50?60?70? platinumbio2007-07-20 10:59 辛苦了 给楼主加分啊 【准分子
21、讨论】近视手术？医学界的一个阴谋 (转载.chenxi1965)- 是这样吗？ 发贴: 16 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 bingyezi发贴: 6 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-07-20 18:02 谢谢啦，非常有用 【原创 】麻醉科主任不会麻醉可以吗？ silen2007-07-23 11:07 cemomodog发贴: 52 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 RIPA 是提细胞总蛋白的裂解液，我用它来制细胞质蛋白，会不会把所有蛋白都提出俩啊，线粒体蛋白会被提出来嘛？我是想分别制备细胞质和线粒体蛋白做 western 有没有中级没过的啊？ hxj19发贴:
22、 17 2007-07-23 12:49 真是个好东西,谢谢! 【help 】请教 DS-156 的一些问题,谢谢 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 无影无踪发贴: 47 积分: 4 得票: 0 状态: 在线 2007-07-23 20:57 楼主辛苦了 【活动 】有多少爱可以重来？从学生到医生 快速回复标题内容 HTML 标记 笑脸标记 Jute 标记 用 Ctrl+Enter 可以快速发布图片标记 选项保存帖子内容到系统剪贴版，避免文章丢失。(此功能只在 IE 下有效)Email 通知：如果有回复就通知您禁止在这个帖子中使用 Jute 标记禁止在这个帖子中使用笑脸标记显示个人签名 加密
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