1、中国组织工程研究 第 17 卷 第 53 期 20131231 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 31, 2013 Vol.17, No.53doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.010 http:/www.crter.org张洋，刘春霞，王亮，张莉，刘伟，赵伟，李治 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤 J.中国组织工程研究， 2013， 17(53):9157-9163.ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9157www.
2、CRTER.org张洋，男，1981 年生，辽宁省沈阳市人，汉 族，2011 年中国医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱外科疾病的诊断及治疗。通讯作者：李治，主任医 师，在读博士，沈阳医学院附属中心医院，辽宁省沈阳市 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2013)53-09157-07修回日期：2013-11-24(201311021/MW)Zhang Yang, Master, Attending physician, Central Hospital Attached to Shenyang Medical College, Shenyang 110024
3、, Liaoning Province, CCorresponding author: Li Zhi, Studying for doctorate, Chief physician, Central Hospital Attached to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, CAccepted: 2013-11-24人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤 *张 洋，刘春霞，王 亮，张 莉，刘 伟，赵 伟，李 治(沈阳医学院附属中心医院， 辽宁省沈阳市 110024)文章亮点：1 人羊膜上皮细胞是克隆原细胞
4、，与胚胎干细胞一样均是全能干细胞，经培养有分化成 3 个胚层细胞的潜能，而且还保持神经干细胞的特性。2 实 验 特 点 即 在 于 采 用 体 外 培 养 的 人 羊 膜 上 皮 细 胞 ， 进 行 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 后 移 植 到 新 西 兰 大 白 兔 臂 丛 神经 损 伤 区 ， 经 苏 木 精 -伊 红 染 色 及 荧 光 显 微 镜 观 察 ， 客 观 的 证 实 了 羊 膜 上 皮 细 胞 对 兔 臂 丛 神 经 损 伤 的 修 复 作 用 。关键词：器官移植；细胞移植；臂丛神经损伤；人羊膜上皮细胞；绿色荧光蛋白；兔；其他基金主题词：臂丛神经炎；羊膜；上皮细胞；绿色荧
5、光蛋白质类基金资助：沈阳医学院科研基金资助项目(20111031)*摘要背景：目前人们把目光多集中在干细胞修复脊髓损伤方面，而对于干细胞移植治疗周围神经损伤的研究却不多，尤其人羊膜上皮细胞修复治疗周围神经损伤的研究和报道更少。目的：探讨人羊膜上皮细胞对臂丛神经的修复作用。方法：应 用 测 力 神 经 根 拉 钩 水 平 牵 拉 臂 丛 神 经 根 的 方 法 制 备 大 白 兔 臂 丛 损 伤 模 型 ， 提 取 人 羊 膜 上 皮 细 胞 并 扩 增培 养 ， 扫 描 电 子 显 微 镜 下 观 察 人 羊 膜 组 织 及 羊 膜 上 皮 细 胞 的 超 微 结 构 ， 人 羊 膜 上 皮
6、细 胞 转 染 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记并 注 射 入 臂 丛 神 经 损 伤 区 ， 苏 木 精 -伊 红 染 色 及 荧 光 显 微 镜 观 察 羊 膜 上 皮 细 胞 对 兔 臂 丛 神 经 损 伤 的 修 复 作 用 。结果与结论：分离得到的人羊膜上皮细胞表达上皮细胞标志物角蛋白 CK19，不表达间充质细胞标志物波形蛋白，不同程度表达 CD29，CD73。扫描电子显微镜观察到人羊膜上皮细胞胞体饱满，连接紧密，细胞状态良好。人羊膜上皮细胞移植到新西兰大白兔臂丛神经损伤模型后 18 周，免疫荧光检测到神经损伤区可见有表达绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞。术后 6 周实验组大白兔前爪功能开始
7、恢复，术后 12，18 周实验组大白兔前爪功能得到明显改善，功能评分明显提高，对照组几乎没有恢复。以上结果可见人羊膜上皮细胞参与了臂丛神经损伤的修复。Human amniotic epithelial cell transplantation for repair of brachial plexus injury in rabbits Zhang Yang, Liu Chun-xia, Wang Liang, Zhang Li, Liu Wei, Zhao Wei, Li Zhi (Central Hospital Attached to Shenyang Medical College,
8、Shenyang 110024, Liaoning Province, China)AbstractBACKGROUND: A great deal of attention has been given to stem cell transplantation for repair of spinal cord injury, while there are few studies concerning stem cell transplantation for repair of peripheral nerve injuries, especially transplantation o
9、f human amniotic epithelial cells used to repair peripheral nerve injuries.OBJECTIVE: To discuss the effects of human amniotic epithelial cells in brachial plexus nerve repairing.METHODS: We established rabbit models of brachial plexus injuries and extracted human amniotic epithelial cells for expan
10、ding culture followed by ultrastructural observation of human amniotic membrane tissue and amniotic epithelial cells under a scanning electron microscope. Then, human amniotic epithelial cells were transfected with green fluorescent protein markers and injected into the injury site. Hematoxylin-eosi
11、n staining and fluorescence microscope were employed to observe the effects of human amniotic epithelial cells in the repair of brachial plexus injuries in rabbits. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Successfully isolated human amniotic epithelial cells expressed cytokeratin 19 rather than vimentin, and al
12、so expressed CD29 and CD73 to different extent. Scanning electron microscope observation showed human amniotic epithelial cells had filled cell bodies and were closed interconnected in good condition. (2) After 18 weeks of successful modeling, human amniotic epithelial cells labeled with green fluor
13、escent protein were visible in the injury site under the fluorescence microscope. (3) In the experimental group, functional recovery of the rabbit forelegs was found at postoperative 6 weeks and dramatically improved at 12 and 18 weeks after surgery. Functional scores were also significantly increas
14、ed in the experimental group. However, there was no improvement in the control group. These findings indicate that human amniotic epithelial cells are 张洋，等 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org9158www.CRTER.orginvolvedin the repair of brachial plexus injury.Subject heading
15、s: brachial plexus neuritis; amnion; epithelial cells; green fluorescent proteinsFunding: the Scientific Research Fund of Shenyang Medical College, No. 20111031*Zhang Y, Liu CX, Wang L, Zhang L, Liu W, Zhao W, Li Z. Human amniotic epithelial cell transplantation for repair of brachial plexus injury
16、in rabbits. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9157-9163.0 引言 Introduction臂丛神经是由第5至8 颈神经和第1 胸神经前支组成的；有时C 5接受 C4的部分神经纤维， T1接受部分T 2的神经纤维，凡是组成臂丛的神经受损伤均称为臂丛神经损伤 1，造成臂丛神经损伤的主要原因是车祸、运动、重物撞击造成的牵拉；同时新生儿在分娩中造成的臂丛神经损伤也占很大比例 2-3。臂丛神经损伤是一种比较难处理的周围神经损伤，若得不到及时正确的诊治，将导致上肢的严重功能障碍，造成患者终身残疾，并产生严重的社会经济影响 4。目
17、前临床对其手术治疗的最佳时机是伤后3 个月内，如果错过最佳治疗时间，可供移位的神经数量有限，质量欠佳，术后功能恢复较差。随着显微外科、基因治疗等先进技术的研究应用，传统的中医药技术和规范的康复理疗技术不断发展进步 5-6，臂丛神经损伤的诊治水平进一步提高，但是由于臂丛神经解剖结构比较复杂、变异多样，损伤类型和平面的不同，其所支配的神经、肌肉组织病理退变与再生速度和程度亦有所不同，因此此类损伤的治疗效果和预后仍不理想 7-8。国内外的相关研究结果显示9-11：臂丛损伤患者的生活质量并不令人满意，且生活质量与许多因素相关 12。因此，许多研究开始积极寻找更为有效的治疗方案。目前，干细胞移植作为神经
18、系统新的治疗手段受到广泛关注。国内外干细胞移植在神经系统方面的研究多集中在胚胎干细胞 13-14、多能诱导干细胞 15、神经干细胞等方面 16-17，但是这些干细胞都面临着来源限制、伦理限制、安全性限制、免疫排斥限制等问题。面对这些问题，越来越多的研究关注于人羊膜细胞，人羊膜细胞目前已成为寻找人类干/祖细胞新来源的研究热点。羊膜存在于胎儿绒毛膜的表面，是一个光滑、无神经、无血管、无淋巴的透明膜。羊膜组织主要由羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞组成。羊膜上皮细胞表达许多干细胞的标志物如：SSEA-4、SOX-2、TRA-1-60、 TRA-1-81、FGF-4 和 Rex-1等；表达多潜能干细胞特定的
19、转录因子Oct-4和Nanog；且具有多向分化潜能，更具有神经生物学的特性 18-19。有研究证明，羊膜上皮细胞中存在神经组织特异性蛋白的表达 20，如：MAP-2、GFAP、Neural tubulin等，体外诱导的羊膜上皮细胞可以产生不同比例的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞 21。因此羊膜上 皮 细 胞已 经 用 于 治 疗 中 枢 神 经 系 统 疾 病 的 研 究 中 。 最 重 要 的 是 ，羊 膜 是 产 后 “废 弃 ”组 织 ， 来 源 广 泛 、 取 材 方 便 、 且 满足 伦 理 学 要 求 。 虽 然 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 研 究 还 处 于 起 步阶 段
20、 ， 但 是 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 多 向 分 化 潜 能 以 及 免 疫 原性 很 低 的 特 性 使 其 具 有 广 泛 的 临 床 应 用 前 景 。目前人们把目光多集中在干细胞修复脊髓损伤方面，而对于干细胞移植治疗周围神经损伤的研究却不多，尤其人羊膜上皮细胞修复治疗周围神经损伤的研究和报道更少，因此本实验将羊膜上皮细胞移植到受损伤的臂丛神经，探讨羊膜上皮细胞对臂丛神经损伤的修复作用。1 材料和方法 Materials and methods 设计：随机对照动物实验。时间及地点：实验于2012年5月至2013年5月在沈阳医学院附属中心医院实验室完成。材料：实验动物：清洁健康的1
21、8周龄新西兰大白兔30只，雌雄不限，体质量3.5 kg左右，由辽宁长生生物技术有限公司提供(实验动物质量合格证号0009760)。羊膜组织：在征得产妇书面同意后，取沈阳医学院附属中心医院妇产科健康产妇剖腹产后的胎盘，分离胎盘表面的羊膜获取羊膜上皮细胞。羊膜上皮细胞对臂丛神经损伤修复实验所用主要试剂和仪器：试剂及仪器 来源RPMI1640胎牛血清胰蛋白酶、二甲基亚砜FITC 标记的鼠抗人 CD29、CD73单克隆抗体鼠抗人 CK19、波形蛋白单克隆抗体山羊抗小鼠 FITC 标记的 IgG 二抗青霉素、链霉素倒置相差显微镜、荧光显微镜、数字成像系统CO2 细胞培养箱台式低温超速离心机BDFACSC
22、alibur 流式细胞仪恒温冷冻切片机培养皿、培养板超净工作台深低温冰箱 Gibco 公司美国 Hyclone 公司美国 Sigma 公司美国 BD 公司Santa Cruz北京中山生物技术公司Gibco/BRL日本 Olympus美国 Forma scientific 公司德国 Sigma 公司美国 Becton-Dickinson 公司德国 Leica美国 Corning 公司苏州安泰公司SANYO Corporation张洋，等 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9159www.CRTER.org细
23、胞数/mL=(4 个大格细胞数之和/4)10 4实验方法：人羊膜上皮细胞的分离、培养、传代：选用剖腹产后的人羊膜，去除残留的绒毛膜，放入含青、链霉素双抗的PBS 中洗净后，将羊膜剪碎成直径约1 mm的小组织块，加入0.25% 胰蛋白酶消化液在37 下消化七八分钟，滴加含体积分数为5%胎牛血清的培养液终止消化，用移液管不断吹打，同时200目滤网进行过滤，滤液装入50 mL离心管中1 000 r/min离心5 min，小心弃掉上清，收集细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为1109 L-1，接种到25 cm2培养瓶，加入含1%青、链霉素双抗、 10 g/L碱性成纤维细胞生长因子和体积分数为10%胎牛血
24、清的RPMI1640培养基，于37 、体积分数为5%CO 2培养箱内培养。隔天换液，倒置显微镜下观察，细胞状态良好，覆盖培养瓶底80%左右时进行传代。弃去原瓶中的旧培养液，PBS洗3 遍，以除去残留的血清。加入0.25%胰蛋白酶消化液1 mL(以浸没细胞表面为宜)后，置于显微镜下观察，当细胞的突起消失，细胞变圆时，立即弃去消化液，用含有体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液终止消化。然后用吸管将贴壁的细胞吹打成单细胞悬液，按适当比例分瓶传代，置于37 、体积分数为5%CO 2的恒温培养箱中培养。次日更换1次培养液，继续培养。人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 冻 存 ： 选 择 第 7代
25、 或 第 8代 处 于 对 数生 长 期 的 细 胞 ， 在 冻 存 前 1 d换 液 ， 用 0.25%胰 蛋 白 酶 消化 液 消 化 细 胞 ； 制 成 单 细 胞 悬 液 ， 移 入 离 心 管 中 ， 1 000 r/min离心5 min；弃去培养液，加入 1.5 mL 4 预冷的冻存液(1 mL二甲基亚砜+9 mL血清)，吹打均匀后移入冻存管，用封口膜和胶布密封管口，做好标记后依次放入4 30 min，-20 30 min，-80 过夜，如长期保存移入液氮中。人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 复 苏 ： 从 液 氮 容 器 中 取 出 冻 存 管 ，迅 速 放 入 37 水 浴 中
26、， 并 不 时 摇 动 令 其 尽 快 融 化 ； 1 000 r/min离心 5 min弃去冻存液，加入1.5 mL含有体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液，吹打均匀后移入培养瓶内，置于37 、体积分数为5%CO 2的恒温培养箱中培养；次日更换1次培养液，继续培养。细胞计数方法：取第7代或第8 代对数生长期的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液制成单细胞悬液，微量加于血细胞计数板，显微镜下计数四角大方格中的细胞数，代入以下公式得到细胞密度。重复计数2次，取平均值。羊膜组织和羊膜上皮细胞的超微结构观察：将羊膜组织冰冻切片或者羊膜上皮细
27、胞铺片取出浸入PBS中，轻轻漂洗表面。然后将切片或铺片放入预冷的3%戊二醛于 4 过夜，吸出固定剂，用PBS浸洗2次，每次10 min；再用预冷的1% 锇酸于 4 固定1 h，然后用PBS浸洗 2次，每次10 min；脱水：丙酮/醋酸异戊酯(11)脱水10 min，再用醋酸异戊酯脱水30 min；样品经上述处理后，进行干燥，扫描电镜下观察。免疫荧光鉴定羊膜上皮细胞角蛋白19和波形蛋白的表达：铺板：载玻片裁成1 cm1 cm，1%明胶在24孔板中铺板，将明胶吸出，紫外下照射30 min，待明胶变干，收在孵箱备用；收获第5代处于对数生长期的人羊膜上皮细胞，每孔加入210 4个细胞于24 孔板，待细
28、胞长满，将小载玻片取出，放在湿盒上，用预温的PBS洗3 次，每次5 min， 40 g/L多 聚 甲 醛 固 定 20 min， PBS洗 3次 ，0.2%Triton X-100通 透 10 min， PBS洗 3次 ， 5%BSA封闭 30 min， PBS洗 3次 ， 一 抗 4 湿 盒 过 夜 ， 第 2天 PBS洗 3次 ， 二 抗 和 DAPI室 温 30 min， 95%甘 油 封 固 ， 上 镜观 察 。流式细胞技术鉴定羊膜上皮细胞CD73和CD29 的表达：取第5 代对数生长期的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液制成单细胞悬液
29、，将单细胞悬液加入2 mL圆底离心管中， 1 500 r/min离心 5 min，弃上清液。以冷PBS 1 mL，离心洗涤，弃上清液。加入用PBS稀释的荧光素标记的抗体200 L。用微量移液器轻轻吹打混匀， 4 或置冰上孵育30-60 min。离心弃上清液。加入预冷的PBS 1 mL，离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。向细胞中加入冷PBS 500 L，吹打混匀，置流式管中，4 避光保存，待测。转染绿色荧光蛋白载体：收获第8代处于对数生长期的细胞，以510 4个/孔转种于 6孔培养板中，37 ，体积分数为5%CO 2环境中培养24 h，细胞长至80%融合。转染前三四个小时换2 mL无血清
30、 RPMI1640培养基培养。在无菌1.5 mL试管中制备下述溶液：溶液A：将4 g的pIRES2-AcGFP1质粒溶于 250 L无血清RPMI1640培养基中，轻微摇晃混匀5 min；溶液B：将10 L Lipofectamine 2000加入250 L无血清RPMI1640培养基中，轻微摇晃混匀5 min；溶液C：合并溶液A 和溶液B，轻轻混匀，室温下孵育20 min。弃去细胞培养基，用无血清RPMI1640培养基洗细胞2次备用。将溶液C加入6孔板要转染的细胞中，前后轻微摇晃培养板，37 ，体积分数为5%CO 2环境中培养五六个小时，换为含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基
31、继续培养。配制G418，进行转染细胞的G418 的梯度筛选，筛选质量浓度分别为200，300，400，500 mg/L。按此浓度，依次加入各张洋，等 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org9160www.CRTER.org质粒转染组。挑取单克隆，采用有限稀释法。继续应用400 mg/L的G418扩大培养，维持转染效率。扩大培养，传代，冻存，进行后续实验。动物模型的制备：待麻醉平稳后，将大白兔俯卧固定于手术台上，皮肤消毒，进行手术。首先，将C 5至C8左侧半椎板切除，显露硬膜囊，由肩胛上缘向前探查，张洋，等
32、 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9161www.CRTER.org显露臂丛神经股部，向神经根追溯至根孔，确定C5，C 6，C 7，C 8，咬除C 5，6 和C 6，7 小关节，在神经孔处，神经根出硬膜囊外0.5 cm用测力神经根拉钩水平牵拉左侧神经根，以0.9 N的拉力持续牵拉神经根10 min，10 min后去除牵拉，进行缝合。根据grooming实验评价标准确定造模成功 22-23。动物分组与人羊膜上皮细胞移植：18周龄新西兰大白兔30 只，随机分为实验组和对照组。通过立体定位仪，用微量注射器接无
33、菌玻璃拉丝针头将含荧光标记的人羊膜上皮细胞悬液缓慢注入到实验组大白兔距臂丛神经损伤区头、尾侧各4.0 mm处，注射深度为1.25 mm。每点3 L(75 000个细胞 )，分两点注射，注射时间5 min，为防止细胞倒流留针5 min。对照组同样方法建模，注入与人羊膜上皮细胞相同的培养液。在术后2 ，6，12，18周检测移植羊膜上皮细胞的实验组大白兔肢体前爪运动功能、以及对大白兔损伤的臂丛神经内及相应节段颈髓内羊膜细胞进行示踪。运动功能评分：待大白兔苏醒后观察，给予运动功能评分，采用grooming 实验评价标准 22-23：0分，实验侧肢体前爪瘫痪；1分，实验侧肢体前爪可触及嘴部；2分，实验侧
34、肢体前爪可触及嘴与眼之间；3分，实验侧肢体前爪可触及眼；4分，实验侧肢体前爪可触及耳前部；5分，实验侧肢体前爪可触及耳后部。苏木精-伊红染色：羊膜上皮细胞移植18周后取大白兔股部臂丛神经进行冰冻切片，切片用40 g/L多聚甲醛固定5 min，自来水洗涤，滴加苏木精覆盖标本，染色2-5 min，自来水洗涤，盐酸乙醇分色(1份盐酸+99份无水乙醇) ，自来水洗涤，碱水返蓝，自来水洗涤，滴加伊红20 s-3 min，自来水洗涤，脱水：体积分数为70%乙醇5 min；体积分数为85%乙醇5 min；体积分数为100%乙醇 5 min，透明：二甲苯 10 min；二甲苯10 min，中性树脂封固。主要观
35、察指标：扫描电镜观察羊膜组织及羊膜上皮细胞形态。免疫荧光染色和流式细胞术鉴定羊膜上皮细胞标记蛋白的表达。荧光显微镜观察羊膜上皮细胞在臂丛神经损伤区的示踪情况。2 结果 Results2.1 扫描电镜观察羊膜组织及羊膜细胞的超微结构 扫描电镜观察到羊膜组织为无神经、无血管、无淋巴的致密透明膜。分离提取的羊膜上皮细胞胞体饱满，连接紧密，细胞状态良好，见图1。2.2 免疫荧光染色和流式细胞术对所提取的羊膜上皮细胞进行鉴定 所分离的人羊膜上皮细胞明显表达上皮细胞标志物角蛋白CK19，不表达间充质细胞标志物波形蛋白，见图2；不同程度地表达CD29 、CD73，见图3，以上结果证实实验所提取的细胞为羊膜上
36、皮细胞。图 1 扫描电镜观察羊膜组织及羊膜上皮细胞形态Figure 1 Morphology of human amniotic membrane tissue and amniotic epithelial cells under scanning electron microscopeA：羊膜组织(200) C：羊膜上皮细胞(5 000)注：羊膜组织无血管、无神经、无淋巴，羊膜上皮细胞状态良好，形态饱满，连接紧密。B：羊膜上皮细胞(2 000) 图 2 羊膜上皮细胞内标记蛋白的表达情况(免疫荧光，40)Figure 2 Expression of protein markers in th
37、e amniotic epithelial cells (Immunofluorescence, 40)A：角蛋白 19(CK19) 注：羊膜上皮细胞表达 CK19，而不表达波形蛋白。B：波形蛋白 图 3 流式细胞技术鉴定羊膜上皮细胞标记的表达Figure 3 Expression of protein markers in the amniotic epithelial cells detected by flow cytometryA：CD73 注：羊膜上皮细胞高表达 CD73 和 CD29。B：CD29 张洋，等 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤P.O. Box 1200, Sh
38、enyang 110004 www.CRTER.org9162www.CRTER.org张洋，等 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9163www.CRTER.org图 4 对 照 组 HE染 色 （ A） 和 羊 膜 上 皮 细 胞 示 踪 （ B）注 ： 图 A可 见 损 伤 的 臂 丛 神 经 纵 切 面 （ 10） 损 伤 处 (a点 )神 经 纤 维 排 列 紊 乱 ,b点 区 域 为 正 常 神 经 纤 维 。 图 B 在 相 同 位 置 无 荧 光 羊 膜 上 皮 细 胞Figure4 Th
39、e control group brachial plexus HE staining(A) and tracer amniotic epithelial cels(B)A Baabb aabb图 5 实 验 组 臂 丛 神 经 HE染 色 （ A） 和 羊 膜 上 皮 细 胞 示 踪 （ B）注 ： 臂 丛 神 经 横 断 面 上 , 图 A与 图 B中 神 经 标 本 的 相 同 位 置 不 仅 神 经 外 膜 以 及 束膜 (a点 ） 表 达 带 有 GFP的 羊 膜 上 皮 细 胞 ， 在 神 经 横 断 面 内 部 即 神 经 纤 维 内 (b点 ）也 可 见 散 在 的 带 有 G
40、FP的 羊 膜 上 皮 细 胞Figure5 The experimental group brachial plexus HE staining(A) and tracer amniotic epithelial cels(B)A Baa aaaaa aaab bbbbb bb2.3 羊膜上皮细胞转染绿色荧光蛋白结果 羊膜上皮细胞转染携带绿色荧光蛋白的质粒，从而使羊膜上皮细胞标记绿色荧光蛋白，转染效率达到80%以上，绝大多数羊膜上皮细胞都表达绿色荧光蛋白，见图4。2.4 动物模型建立情况 通过手术造成大白兔臂丛神经损伤，其中对照组15只大白兔grooming评分1分有2只，2分有5只，3分有
41、4 只，4分有1只，其中麻醉过量死亡1只，手术诱发炎症脓肿2只，退出实验；实验组15只大白兔grooming评分1 分有2 只，2分有6只，3分有3只，4分有2只，其中手术诱发炎症脓肿1只，过度牵拉导致瘫痪1只，退出实验。2.5 羊膜上皮细胞移植后新西兰大白兔的前爪运动功能 术后2周实验组大白兔较对照组大白兔前爪运动功能有微弱的恢复；术后6周实验组大白兔前爪功能开始恢复，其中损伤越轻，恢复越好；术后12，18周实验组大白兔前爪功能得到明显改善，功能评分明显提高，对照组只有轻微恢复。表1为具体评分结果。2.6 羊膜上皮细胞在大白兔臂丛神经内的示踪 植入细胞为绿色荧光蛋白标记过的羊膜上皮细胞，因此
42、在荧光显微镜下，表达绿色荧光蛋白。实验结果显示，羊膜上皮细胞移植18周后，与对照组相比实验组大白兔臂丛神经局部表达带有绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞，证实羊膜上皮细胞参与臂丛神经修复，见图5，6。3 讨论 Discussion随着现代交通的日益发展，交通事故导致了臂丛神经损伤的患者日益增多，由于手术时机较晚，已错过最佳治疗时间，而且由于臂丛神经解剖结构复杂，因此手术后效果不甚理想，致残率很高，严重影响患者生活质量，同时给家庭和社会也造成一定的负担。臂丛神经损伤的治疗方式、方法多样，且疗效不一，应结合临床采用综合治疗，促进患肢功能康复 24。在本实验中，成功建立了大白兔臂丛神经损伤模型，以表 1 羊
43、膜上皮细胞移植后新西兰大白兔的前爪运动功能grooming 评分Table 1 Grooming scoring on motor function of rabbits forelegs after transplantation of human amniotic epithelial cells注：实验组大白兔前爪功能得到明显改善，对照组只有轻微恢复。时间 组别 1 分(只) 2 分(只) 3 分(只) 4 分(只) 5 分(只)0 周 对照组 2 5 4 1 0实验组 2 6 3 2 02 周 对照组 2 5 3 2 0实验组 2 5 3 3 06 周 对照组 2 5 3 2 0实验组
44、 1 4 3 4 112周对照组 2 5 2 2 1实验组 0 3 3 5 218周对照组 2 4 3 2 1实验组 0 3 2 4 3图 4 绿色荧光蛋白标记羊膜上皮细胞(40)Figure 4 Amniotic epithelia cells labeled with green fluorescent protein (40)注：绝大多数羊膜上皮细胞都表达绿色荧光蛋白，转染效率达80%以上。图 5 对 照 组 臂 丛 神 经 苏 木 精 -伊 红 染 色 和 羊 膜 上 皮 细 胞 示 踪Figure 5 Hematoxylin-eosin staining of the brachia
45、l plexus and tracing of amniotic epithelial cells in the control group注：图 A 可见损伤的臂丛神经纵切面(10)损伤处(a 点)神经纤维排列紊乱，b 点区域为正常神经纤维。图 B 在相同位置无荧光羊膜上皮细胞。图 6 实验组臂丛神经苏木精-伊红染色和羊膜上皮细胞示踪 Figure 6 Hematoxylin-eosin staining of the brachial plexus and tracing of amniotic epithelial cells in the experimental group注：臂丛神
46、经横断面上，图 A 与图 B 中神经标本的相同位置，不仅神经外膜以及束膜(a 点)表达带有绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞，在神经横断面内部即神经纤维内(b 点) 也可见散在的带有绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞。A BA B张洋，等 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org9164www.CRTER.org用于对臂丛神经损伤治疗方法的进一步研究。张洋，等 . 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9165www.CRTER.org近几年
47、，细胞治疗成为了最热门的领域，其中，胚胎干细胞、多能诱导干细胞、神经干细胞等已经开始广泛应用于临床，而羊膜细胞也作为人类干细胞新来源得到广泛关注。羊膜是覆盖在羊膜腔内表面的一层薄膜，是从细胞滋养层演化而来的，是人类两层胎膜的内层，其厚度为0.02-0.05 mm，是人体中最厚的基底膜；羊膜是由羊膜上皮细胞、基底膜、实质层、纤维母细胞层、海绵层5层结构组成的。虽然羊膜细胞仍处于研究的初始阶段，但是目前已经发现其治疗帕金森病 25-27、脊髓损伤等中枢神经系统疾病 28，并取得了一定的修复效果。在一些生长因子的作用下，羊膜细胞还可以分化为肝、胰腺、心肌和神经细胞等 29。同时，羊膜细胞具有一定的免
48、疫豁免性，这使它成为细胞治疗的良好潜在供体。羊膜细胞包括羊膜上皮细胞及羊膜间充质细胞，其中人羊膜上皮细胞位于羊膜的最内层，羊膜上皮细胞在受精后第8天从外胚叶发育而来，使其可能维持原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性。Okawa等 30发现人羊膜上皮细胞表达神经干细胞标记物Nestin，也有研究证明羊膜上皮细胞体外诱导可分化为神经干细胞 31，这些研究证明人羊膜上皮细胞具有神经干细胞特性。还有一些研究证实羊膜上皮细胞也可以向神经细胞分化 32-33。这些研究为羊膜上皮细胞用于细胞移植治疗神经损伤提供了有力的依据。作者借鉴其他研究的方法成功提取了羊膜上皮细胞并对其进行鉴定。所提取的羊膜上皮细胞生长状态
49、良好，可进行传代、冻存、复苏培养，而且细胞特性没有发生重大改变。所提取的羊膜细胞普遍表达CK19，而不表达波形蛋白，证明提取的细胞为羊膜上皮细胞而不是羊膜间充质细胞，同时表达CD73和CD29 ，说明提取的羊膜上皮细胞具有干细胞特性。随后，对羊膜上皮细胞进行了绿色荧光蛋白标记，注入已建立的大白兔臂丛神经损伤模型，进行修复治疗，在治疗后18周，臂丛神经局部表达绿色荧光蛋白，即羊膜上皮细胞对臂丛神经进行了修复。有研究报道人羊膜上皮细胞已经进行移植修复尺神经损伤的研究 34，也进一步证实了人羊膜上皮细胞对周围神经系统具有修复作用，且应用前景广泛。虽然目前人羊膜上皮细胞还没有得到广泛应用，但人羊膜上皮细胞是克隆原细胞，与胚胎干细胞一样均是全能干细胞 35-37，经培养有分化成3 个胚层细胞的潜能，而且还保持神经干细胞
