1、 我们的宗旨是：致力于成为医务工作者晋升、考试的心灵导师；RPHPLC 法测定散瘀软膏中盐酸小檗碱的含量作者：尹华 章建华 周爱珍 许丛辉 作者单位：1.浙江中医药大学药学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学第一附属医院【摘要】 目的建立散瘀软膏中盐酸小檗碱的 HPLC 含量测定方法。 方法采用反相离子对高效液相色谱法。色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C8 （4.6150mm ，5m ） ；流动相：乙腈0.1 %磷酸溶液=5050（每 100 mL 流动相加入十二烷基硫酸钠 0.1 g） ；检测波长：265 nm；流速：1.0 mLmin-1；室温：20 ；
2、进样量： 20L。 结果盐酸小檗碱在39.40394.0 ng 的范围内线性关系良好，回归方程为：Y=4.073103x2.248103 （ r=0.9992） ；加样回收率在 97.9100.9 %，平均回收率为 99.4 %，RSD 为 1.5 %。 结论所采用的定量方法简便、可靠，结果准确，重复性良好，可用于散瘀软膏的质量控制。【关键词】 散瘀软膏；盐酸小檗碱；反相高效液相色谱法；含量测定Determination of Berberine Hydrochloride in San Yu Ointment by HPLCYin Hua，Zhang Jianghua，Zou Aizhen，
3、et al1.College of Pharmacy，Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou(310053) ，China 2.Zhejiang Medical University First Affiliated HospitalAbstract：Objective To establish a content determination method of Berberine hydrochloride in San Yu Ointment by HPLC.Methods RPHPLC was performed to determin
4、e Berberine hydrochloride on a column of Agilent Zorbax Eclipse XDBC8（4.6150mm，5m）at 20; Acetonitrile-0.1 % H3PO4 （5050） （Adding 0.1 g C12H25NaO4S to every 100 mL）was used as mobile phase，the flow rate was 1.0 mLmin-1.The detection wavelength was at 265 nm.Results A good linearity can be found in th
5、e range of 39.40 394.0 ng，and the regression equation was Y = 4.073103x2.248 103 （r=0.9992）.The recovery was between 97.9 %100.9 %，and the average recovery rate was 99.4 %，RSD was 1.5 %.ConclusionThe method is simple，rapid，accurate and available，which can be used to control the quality of San Yu Oin
6、tment.Key words：San Yu Ointment; berberine hydrochloride; RPHPLC; quantitative determination散瘀软膏是以浙江省中医院的医院制剂散瘀膏为基础，由大黄、黄芩、黄柏、玄明粉加乳剂型基质制成的水包油型（O/W）乳膏剂，属局部外用药膏，具有活血化瘀，消肿止痛的作用。 12 为保证临床用药疗效稳定、安全可靠，及各批产品间质量的稳定可控，我们建立了反相离子对高效液相色谱法测定散瘀软膏中盐酸小檗碱的含量。1 仪器与试药1.1 仪器Agilent 1100 Series 高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司） ；PL51
7、24 型纯水机；S Sartorius BD211D 电子天平（德国塞多利斯 十万分之一） ；artorius BS110S 电子天平（德国塞多利斯 万分之一） ； KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） ；DHG9123A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司） ；PHS3TC （0.01 级）精密数显酸度计（上海天达仪器有限公司） 。1.2 试药盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号 110713200208） ；乙腈（色谱纯，Merck） ；水为过 0.2m 滤膜的纯水；十二烷基硫酸钠位离子对试剂；甲醇、乙醇、磷酸等其余试剂均为分析纯；散
8、瘀软膏及缺黄柏的阴性制剂由浙江中医药大学中药我们的宗旨是：致力于成为医务工作者晋升、考试的心灵导师；标准化研究实验室制备，批号：20071019、20071102、20071125。2 方法和结果2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C8（4.6150mm，5m） ；流动相：乙腈0.1磷酸溶液=50 50（每 100ml 流动相加入十二烷基硫酸钠 0.1g） ；检测波长：265nm ；流速：1.0 mlmin-1；室温：20 ；进样量：20l；理论塔板数以盐酸小檗碱峰计不低于 4000。2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品适量
9、，精密称定，加甲醇制成每 1 ml 含 0.985 mg 的溶液；精密量取上述对照品溶液 0.40 ml 置 10 ml 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得盐酸小檗碱浓度为 39.40gml-1 的对照品储备液；再精密量取该储备液 2.0 ml 置 10 ml 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得浓度为 7.88gml-1 的盐酸小檗碱对照品溶液。2.2.2 供试品溶液的制备取散瘀软膏制剂 1.5 g，精密称定，加入 60 %乙醇溶液 20 ml，回流 30min，放冷，转移至冰水浴中放置 5min，过滤，用少量 60 %乙醇溶液多次洗涤滤纸和滤器，合并滤液和洗液置 50 ml 棕色量瓶中，加 60
10、 %乙醇溶液稀释至刻度，密塞，摇匀。精密量取上述溶液1 ml，蒸干，残渣用流动相溶解并稀释至 10 ml，过 0.45m 滤膜，取续滤液，即得。2.2.3 缺黄柏阴性对照溶液的制备按处方比例称得除黄柏的其他药味，按散瘀软膏的制备方法制成缺黄柏的阴性制剂，再按“2.2.2 供试品溶液的制备”项下的方法制成缺黄柏的阴性对照溶液。2.3 空白试验精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液、缺黄柏的阴性对照溶液各 20l，在上述色谱条件下进样测定，记录色谱图。盐酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液、缺黄柏阴性对照溶液色谱图如图 1A、B、C 所示，散瘀软膏供试品色谱图中，在与盐酸小檗碱对照品色谱图相同保留时间
11、处，有相应的色谱峰；而缺黄柏的阴性对照溶液在此保留时间处无相应的色谱峰，说明散瘀软膏制剂中其他药味对盐酸小檗碱的测定不产生干扰。2.4 线性关系考察精密吸取浓度为 39.40gml-1 的盐酸小檗碱对照品储备液各 0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.0 ml 置 2 ml 棕色量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，得 5 个浓度系列的对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样 20l，测定，以盐酸小檗碱对照品溶液的进样量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程为：Y = 4.073103x2.248103（r=0.9992） ，表明盐酸小檗碱在 39.40 ng394.0 ng
12、范围内具有良好的线性关系。2.5 精密度试验精密吸取浓度为 7.88gml-1 的盐酸小檗碱对照品溶液 20l，在上述色谱条件下连续重复进样 6 次；取上述对照品溶液在第 1、2、3、4、5 天分别进样，结果盐酸小檗碱对照品溶液的日内精密度峰面积的 RSD 为 1.3 %，日间精密度峰面积的 RSD 为 1.3 %，表明盐酸小檗碱对照品溶液日内精密度和日间精密度均符合要求。2.6 稳定性试验取散瘀软膏制剂（批号：20071019）1.5 g，精密称定，按 “2.2.2 供试品溶液的制备” 项下方法制备供试品溶液，分别于 0、1、2、4、8、12、24、48 h 进样 20l，在上述色谱条件下进
13、样测定，盐酸小檗碱峰面积的 RSD 为 1.8 %，表明供试品溶液中盐酸小檗碱在 48 h内稳定。我们的宗旨是：致力于成为医务工作者晋升、考试的心灵导师；2.7 重复性试验取同一批号散瘀软膏制剂（批号：20071019）5 份，每份 1.5 g，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，结果制剂中盐酸小檗碱的平均含量为 3.546 mgg-1，RSD 为 0.4 %，表明重复性良好。2.8 加样回收率试验取已测含量的散瘀软膏制剂（批号 20071019）5 份，每份 0.75 g，分别精密加入浓度为 1.106 mgml-1 的盐酸小檗碱对照品
14、溶液 2.5 ml，按“2.2.2 供试品溶液的制备”项下方法处理，在上述色谱条件下进样 20l，测定，结果盐酸小檗碱的加样回收率在 97.9 %100.9 %之间，平均加样回收率为 99.4 %，RSD 为 1.5 %，符合要求。见表 1。表 1 加样回收率试验结果 （略）2.9 样品测定取 3 个批号的散瘀软膏制剂（批号：20071019，20071102，20071125） ，每批各 2 份，每份 1.5g，精密称定，按“2.2.2 供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样 20l，采用外标二点法测定，计算制剂中盐酸小檗碱的含量，结果见表 2。表2 样品测定结果（略
15、）3 分析与讨论3.1 基质去除方法的考察中药制剂含量测定是否准确关键在于前处理工艺的合理性，既要尽可能完全地提取相应的被测成分，又要尽可能的减少测定干扰。而散瘀软膏为（O/W）型乳膏剂，含有硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林、羊毛脂等油性基质，不仅会干扰指标成分的测定，同时也会对色谱柱造成损伤，因此，去除基质的干扰显得尤为重要。在实验中，我们结合盐酸小檗碱的理化性质，考虑硬脂酸（溶于乙醚、氯仿、丙酮，不溶于水） 、单硬脂酸甘油酯（溶于乙醚、氯仿、异丙醇等，不溶于水） 、液体石蜡（溶于乙醚、氯仿，不溶于水或醇） 、白凡士林（溶于乙醚或汽油中，几乎不溶于乙醇或水） 、羊毛脂（溶于乙醚、氯
16、仿、丙酮，不溶于水、微溶于冷乙醇）等基质的溶解性3 ，考察常用的油性基质去除方法：有机溶剂（氯仿、乙醚）萃取法，冰水浴法。结果发现：样品用蒸馏水溶解后，以氯仿萃取，由于氯仿的密度比水大，处于下层，而油性基质的密度相对比水小，仍有油滴浮于水层上，基质去除不完全；样品用蒸馏水溶解后，用乙醚萃取，乙醚的密度虽然比水小，但其沸点较低，萃取时乙醚蒸汽易喷出，影响含量测定的准确性，尤其是在夏天，温度较高，影响更为明显；样品用 60%乙醇溶液回流提取后，放冷，置冰水浴中，滤过以去除基质，效果较为理想。以 60%乙醇溶液作为提取溶剂，与散瘀软膏提取工艺研究中的药材提取溶剂一致，有助于盐酸小檗碱的提取完全；同时
17、通过在冰水浴中放置，促进各油性基质的凝固，再滤过以去除基质的干扰。采用此方法处理，得到的各指标成分的色谱峰干扰较小，且加样回收试验均符合要求。3.2 含量测定方法的确定小檗碱属季铵型生物碱，碱性很强（pKa=11.5 ） ，易发生离解，影响色谱峰的峰形和含量测定的准确度。故本实验采用反相离子对色谱法，即在合适的 pH 下，使小檗碱完全离解成共轭酸的形式，并在流动相中加入低浓度的离子对试剂（十二烷基硫酸钠） ，使小檗碱的共轭酸与离子对试剂的反离子 RSO-3 结合形成中性离子对化合物，增加其在 C8 反相柱中的保留而实现分离分析。3.3 色谱柱的确定本实验分别考察了不同型号的色谱柱 Zorbax
18、 Eclipse XDBC18 （4.6mm 150mm，5m）和 Zorbax Eclipse XDBC8 （4.6mm150mm，5m） ，发现采用 Zorbax 我们的宗旨是：致力于成为医务工作者晋升、考试的心灵导师；Eclipse XDBC8 色谱柱时色谱峰的峰形较好，且分离度、理论塔板数等参数均符合系统适用性要求，所以确定采用 Zorbax Eclipse XDBC8（4.6mm150mm ，5m）为色谱柱。3.4 流动相的优化本实验分别考察了流动相乙腈-0.1磷酸溶液的不同配比（4555，50 50，5248 等） ，发现当流动相为乙腈-0.1磷酸溶液（ 5050）时，色谱峰峰形较
19、好，分离度、理论塔板数、拖尾因子等参数均符合系统适用性试验要求，故确定采用乙腈-0.1磷酸溶液=5050（每100 ml 加入十二烷基硫酸钠 0.1g）作为流动相。4 结论本实验采用反相离子对高效液相色谱法，以乙腈0.1% 磷酸（5050） （每 100 ml 加入十二烷基硫酸钠 0.1 g）为流动相，建立了散瘀软膏中盐酸小檗碱的含量测定方法。该方法灵敏度高、精密度和重复性良好、结果准确可靠，可用于散瘀软膏中盐酸小檗碱的质量控制。（晋升网（http:/）是目前国内收录中文最多最权威医学杂志、医学杂志；网罗和甄选海量优秀医学论文，提供免费全文阅读。网站可以实现文章内容的全文检索，可以提供医学论文的免费查询、阅读、下载以及提供最及时的医学信息，最丰富的医学文献 ，最权威的期刊杂志，最有效的学习方法） 。【参考文献】1国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部） S.北京：化学化工出版社，2005：214.2王跃华，徐文俊，何俊蓉，等.川黄柏离体培养及药用成分的抑菌试验研究J.中国中药杂志,2004，29（10）：10021003.3张兆旺.中药药剂学M.北京：中国中医药出版社，2006：706743.申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。
