1、基因芯片技术的应用概述：随着功能基因组学研究的不断深入，迫切需要能同时检测大量靶基因表达的手段，迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。基因芯片（gene chip）,又称 DNA 微列阵（DNA microarray）技术就是在这种情况下应运而生的。本文介绍基因芯片的历史和应用。一、 认识基因芯片技术（一）基因芯片技术发展历史俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室（ANL）的科学家们最早在文献中提出了用杂交法测定核酸序列（SBH）新技术的想法。当时用的是多聚寡核酸探针。几乎与此同时英国牛津大学生化系的 Sourthern 等也取得了在载体固定
2、寡核苷酸及杂交法测序的国际专利。在这些技术储备的基础上，1994 年在美国能源部防御研究计划署、俄罗斯科学院和俄罗斯人类基因组计划 1000 多万美元的资助下研制出了一种生物芯片，并用于检测尽地中海病人血样的基因突变，筛选了一百多个外地中海贫血已知的突变基因。这种生物芯片的基因译码速度比传统的 Sanger 和 Maxax Gilbert 法快 1000 倍，是一种有希望的快速测序方法。1996 年底，美国旧金山 AFFYM ATRIX 公司 Steven Fodor 等充分结合并灵活运用了照相平板印刷、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、寡糖苷酸 DNA合成、荧光标记探针杂交及分子生物学的其他技
3、术，创造了世界上第一块 DNA 芯片或DNA 列阵（DNA chip or DNA arrays） ，即基因芯片。（二） 基因芯片技术原理基因芯片是一种小型分析装置，能够快速和精确地研究生物基因组信息。制作基因芯片时，可用机械臂把大量已知或未知序列的 DNA 片段点在玻璃片（通常为 2cm2cm） 、金属片或尼龙膜上，再经过物理吸附作用达到固定化（cDNA 芯片） 。也可以直接在玻璃板或金属表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的 cDNA 或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到成千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达调控情况。荧光
4、标记的 cDNA 与芯片上相匹配的 DNA 序列发生杂交反应，是的芯片上的点呈现出荧光信号，荧光信号的强度和基因表达的多度呈正相关。基因芯片这种微型化装置具有巨大的容量，是科学家在单次试验中就可以分析整个基因组的变化。（三） 几种基因芯片的点制过程1. 简易芯片制作简易芯片时，使用机械臂把大量已知或未知序列的 DNA 片段点在一张很小的玻璃片（通常为 2cm2cm）或尼龙膜上，再经过物理吸附作用达到固定化（cDNA 芯片） 。也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的 cDNA 或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织、同
5、一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达基因调控情况。简易芯片一般的基因数量少（一般不超过 2000） ，主要用于研究小部分特定基因的表达状态。简易芯片一般可以用于手工制作或者机械手点样。2. 大规模基因芯片大规模基因芯片通常涉及基因组规模与数量（一般大于 10000 个基因） ，分别采用接触式点样、非接触式点样或者半导体技术制备样品。接触式点样方法包括点样元件或点样元件中的液体和芯片基片间有直接接触的各种方法。非接触式芯片制备方法包括各种芯片制备中不需点样元件和芯片基片间直接接触的各种技术，其样头的核心是以可控的方式从喷嘴中喷出小体积的液滴。半导体制备技术指借鉴计算机芯片制造业中的微型化加工
6、方法的基因芯片制备技术。基因芯片的工作流程如下：（1） 经大规模 PCR 扩增获得独立 cDNA 插入片段。（2） 用机械手将 PCR 产物点在玻璃板上，变性、固定。（3） 分别从不同器官或组织中分离 mRNA，反转录生成 cDNA。（4） 用不同的荧光染料标记不同器官或组织的 cDNA。（5） 将标记好的 cDNA 与点好的芯片进行杂交。（6） 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。（7） 分析杂交数据。3. 微珠芯片技术微珠芯片技术（beadarray）技术是一种新的基因芯片技术，有可能成为今后基因芯片技术发展的方向。目前，微珠芯片技术在生命科学领域的用途主要集中在 SNP 及基因型分析、基因
7、表达谱分析和蛋白组学研究三大领域。微珠芯片技术是在光导纤维技术基础上发展起来的技术。在直径为 3.5mm 的光纤束中，包含约 50000 跟光纤。在每根光纤的顶部蚀刻出一个小洞，可镶嵌直径为 3um 的微磁珠。每个微磁珠上可以根据不同的需求连接不同的配体，如寡核苷酸、蛋白质、抗体等。制作芯片时，将带有所需配体的不同微磁珠混合后与光纤束进行自组装，通过微珠上寡核苷酸标签序列（address）确认每根光线上所吸附的不同的微珠。现有微珠芯片上每束光纤可镶嵌 1536 种微珠，因此，每种微珠在一束光纤中有30 次重复。结合在微珠上的寡核苷酸或者蛋白可与荧光标记的配对核酸或配体发生相互作用，发生的信号被
8、激发后通过光纤传递到检测器。与其他芯片制作技术相比较，微珠芯片具有如下优势:(1)密度高 微珠芯片的点样密度是原位光合成法的 16 倍，喷点法的 100 倍，接触式点样的 400 倍。(2)测试重复性好 鉴于超高密度的特点，微珠芯片中每个样品都能保证约 30 个重复，从而保证测试的高重复性、高重复率以及高可靠性。(3)定制方便 若需要在已完成的芯片中增加测试点或新基因，只要合成相应的微珠加入到微珠混合池中即可。（四）基因芯片数据分析基因芯片分析包括五个基本步骤：生物学问题、样品制备、生物化学反应、检测、数据模型分析。基因芯片数据分析包括两部分，数据可靠性分析和生物学意义分析。1. 数据可靠分析
9、因为用基因芯片进行杂交分析，每次实验结果都会有些变化，因为包括靶 DNA 浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度以及温度等许多因素影响了杂合双链的形成和稳定性。因此，需要进行重复试验以确保数据的准确。主要的方法是通过两次平行杂交反应，将每个基因在两个反应中的表达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结果都在45 度斜线附近，就说明实验结果是可的。为了保证基因芯片数据的可靠性，芯片中还需加上多个持家基因（housekeeping genes）作为内对照。持家基因，如呼吸作用的酶类和细胞骨架蛋白基因等，是维持细胞正常生长发育的必须基因，其表达水平在细胞内基本不变。处理数据时，认为持家基因的
10、反应信号在两种组织中不变，依此确定其他基因表达信号的相对值。2. 生物学意义分析主要指通过分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义。通常，在芯片中某一器官或发育时期可能有成千上万个差异表达基因。例如，基因芯片分析植物根部可能有 400多个特意表达的基因，如果要将这些基因的来龙去脉都搞清楚，可能要追溯超过 4000 篇以上的文献（假设 1 个基因需要查阅 10 篇文献） 。这种不捡重点的方法耗时耗力，所获得的结果也往往没有意义。因此，生物学家和生物信息学家合作创立了将差异表达基因定位于不同的生物化学代谢途径的分析方法（pathway identification） 。统计每条生物化学代谢途
11、径中固有的基因数量和被基因芯片定位的差异表达的基因数量，可以计算出特定器官或特定发育阶段表达有显著差异的代谢途径。由于代谢途径通常负责执行生物体的重要功能，并且相对于原始数据，代谢途径的数量相对较少，可操作性强，已经成为目前学术界分析芯片技术数据的重要手段。二、 应用实例基因芯片法鉴定学培养标本中致病菌（一）材料和方法1.材料收集广州军区广州总医院检验科细菌室 2008 年 27 月临床科室送检血液培养 86 例 经BacT Alert120 全自动血液培养仪中培养作为待测样品其中阳性血培养瓶 74 例阴性血培养瓶 12 例。2.方法（1）常规细菌分离鉴定 临床送检血培养瓶按常规方法经 Bac
12、T Alert 120 全自动血液培养仪培养后，转种至血平板、麦康凯培养 24h。细菌鉴定采用 Gp、Gn 卡，Gp 卡质控菌为金黄色葡萄球菌（ATCC25923） ，Gn 卡质控菌为大肠杆菌（ATCC25922） 、铜绿假单胞菌（ATCC27835） ， 鉴定结果由 VITEK 2-compact 软件专家系统来判定。（2）基因芯片法细菌鉴定标本中细菌模板 DNA 的制备阳性、阴性对照品均由试剂盒提供，阳性对照品为大肠埃希菌标准菌株制作成的干粉，用鉴定为阴性的血培养瓶液 450ul 溶解待用；在生物安全柜中，阳性、阴性对照品及待测样品颠倒混匀 5 次，取 450ul 分别加入离心管中，待测样
13、品做双平行管；各管加 900ul 提取液，混匀 10 min，13000g 离心 5min，弃上清，沉淀用 500ul 提取液重悬，13000g离心 5min，弃上清，重复一次；沉淀用 100ul 提取液重悬，100 煮沸10min，13000g 离心 15min，取上清 60ul 作为模板进行 PCR 扩增。扩增和标记PCR 双链扩增 向 3.8ulPCR 反应体系中加 23.2ul 水和 3ul 模版 DNA，总体积30ul，3715 min，9 4预变性 10 min，94变性 40s，58 退火 40s，72 延伸40s，40 个循环，72延伸 5 min。产物纯化 将纯化柱置于收集管
14、内加 370ul 水将扩增产物全部移至纯化柱内，室温 3000g离心 15 min，弃废液，加 30ul 水，37放置 5 min，取纯化柱倒置于无菌离心管，室温1000 g 离心 2min，收集纯化后 DNA 溶液。PCR 单链标记 向 3.9ul PCR 反应体系 II（含荧光标记物 Cy3-dutp）中加 16.1ul 水和10ul 已纯化的 DNA 溶液，总体积 30ul，94预变性 10min，94变性 40s，58退火40s，72 延伸 40s，40 个循环，72延伸 5 min。杂交将 150ul 水均匀加入杂交盒槽板的两道平行水槽内，取出芯片及盖片，50水浴预热杂交液 5 mi
15、n，取 8ul 预热后杂交液与 8ul 标记后的扩增产物混匀，用微量加样器将全部混合液垂直转移至芯片的杂交区域避免，产生气泡；组装杂交盒 50水浴 1.5 h；将杂交后的芯片依次于室温下在洗液 A 和洗液 B 中各提洗 3 min（30 次/min） ，无水乙醇中提洗 1.5 min（30 次/min） ，烘干。扫描将杂交后的芯片置于芯片激光共聚焦扫描仪（LuxScan-10k/A）扫描仪扫描芯片，并按照操作说明书进行成像扫描，保存图象。在特定区域上扫描杂交图像（=532 nm） ，分辨率10ul， Laser power：95%，PMT：600。结果判读用配套的 Bactarray Anal
16、yzer 软件系统分析荧光强度和比值，质量控制正常（阳性对照品：点样质控探针、阳性特异探针、细菌通用探针均有较明显的杂交信号；阴性对照品：点样质控探针阳性，无其他杂交信号；软件系统分析阴、阳性对照均正常)下，根据软件系统分析提示的细菌作为结果报告。判断标准：探针杂交荧光信号平均值=探针杂交信号平均值 -背景杂交信号平均值。3.统计分析方法以传统分离培养鉴定方法为金标准，采用配对 X检验进行统计学分析。（二）基因芯片结果1.基因芯片结果以金黄色葡萄球菌为例，Bactarray Analyzer 软件系统分析阴、阳性对照均正常，基因芯片检出阳性的标本特异探针及细菌通用探针有较明显的杂交信号，未检出
17、的标本杂交信号不明显或无杂交信号。2.基因芯片结果与常规细菌鉴定结果比较86 例临床标本中全自动血培养仪培养经转种至血平板，麦康凯平板鉴定，阳性 74 例，阴性 18 例，阳性率 86.05%；基因芯片检测血培养阳性 48 例，阴性 38 例，阳性率55.81%。基因芯片结果与常规细菌鉴定结果差异有显著性意义。参考文献：【1】 现代分子生物学（第 3 版） ，朱玉贤、李毅、郑晓峰；高等教育出版社；P214-218【2】 基因芯片法鉴定学培养标本中致病菌的临床评价，李林海等；南方医科大学学报；2009；29（10）：2070-2072【3】 白东亭， 祁自柏。 基因芯片应用前景 J 。 微生物学
18、免疫学进展，2002, 30(4)： 100-6。【4】 李国利， 庄玉辉， 赵铭，等。聚合酶链反应-反相斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种 J 中华检验医学杂志,，2000, 23(4)： 241-3。【5】 李慧卿，韩金祥。生物芯片在病原体检测中的应用 J。国外医学: 临床生物化学与检验学分册,，2002，23(1)：12-20。【6】 Peplies J，Glckner FO，Amann R。Optimization strategies for DNA microarray-based detection of bacteria with 16S rRNA-targeting oligonucl
19、eotide probes J。Appl Environ Microbiol，2003, 69 (3)：1397-407.【7】 黄正根，刘昕。应用 16SrDNA 检测致病菌的研究进展 J。中华检验医学杂志，2005，28(6)：663-5 。【8】 李禾，徐琦，吴忠华，等。基因芯片技术检测 3 种肠道病原微生物方法的建立 J 。生物技术通讯, 2007，18(3)：441-5 。【9】 肖光夏。全身性外科感染【M】/ 吴在德。外科学 .5 版.北京：人民卫生出版社，2000：185-8。【10】 刘正祥，邹全明。基因芯片在病原微生物检测中的应用评价 J。国外医学：临床生物化学与检验学分册，
20、2003，24(2)：66-9。【11】 白东亭，祁自柏，王军志。我国生物芯片产业化发展现状及存在问题 J。中国生物制品学杂志，2004，17(5)：327-8 。【12】 蔡挺，李巧云等。基因芯片技术检测常见革兰阴性杆菌耐药基因的研究 J。中华医院感染学杂志，2011,21（21）：4411-4414.【13】 沈定霞，罗燕萍，张文利等。基因芯片技术检测大肠埃希菌肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中 ESBL s 和 AmpC 酶基因 J。中国抗生素杂志 2007，32 （12）：727-731.【14】 谢纳。生物芯片分析 M 。张亮，译.。北京： 科学出版社，2004：15 - 2 3.【15】 李瑶，陈菊祥，裘敏燕等。基因芯片的制备研究 J。 。第二军医大学学报， 2000， 9( 21 )：199-122 。【16】 梁国栋。最新分子生物学实验技术 M。北京：科学出版社，2001【17】 杨瑞馥，宋亚军。生物芯片技术及其应用 J。生物技术通讯， 1999 ，10(4) ：13。【18】 马立人，蒋中华，主编。生物芯片 M。北京：化学工业出版社，2000【19】 卢圣栋。现代分子生物学实验技术 M。北京：中国协和医科大学出版社，19 99【20】 祝冀，马文丽，姚汝华。DN A 芯片技术与基因表达研究 J。国外医学分册，2000，4(2) ：106 。
