1、真菌漆酶工程及其在有机合成中的应用 1李飞 夏文静（南京师范大学泰州学院 江苏泰州 225300）摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于真菌，高等植物及细菌中。由于漆酶反应条件温和并具有广泛的专一性，被认为理想的绿色催化剂。本文综述了通过合理设计和定向改造真菌漆酶及漆酶工程并运用于有机合成领域的研究。关键词：漆酶；催化剂；有机合成漆酶是一种含铜的蛋白酶，通过夺取底物一个电子能够催化酚类、多酚类和苯胺氧化，通过电子传递将氧气还原成水。漆酶和漆酶介质体系在生物修复、纸浆漂白、纺织品生物整理和生物燃料电池等方面都有潜在的应用。值得注意的是，漆酶具有在官能团的氧化与将异源分子连接到新的抗生素衍生
2、物之间执行快速精密的转化的功能，或者催化合成复杂天然产物的关键步骤，因此可用于有机合成领域。1 漆酶的性质1.1 生化特征漆酶是含有四个铜原子并与三个氧化还原位点（T 1，T 2 和 T3）相结合的典型单体胞外酶。T 1 型 Cu 在氧化还原测试中呈现绿色，与还原性底物的氧化作用有关。三核簇（含有一个 T2 型 Cu 和两个 T3 型 Cu）与 T1 位点相距 12 ，分子氧在此处被还原成水。在不同的培养条件下，真菌合成漆酶会出现不同的同工酶。大多数漆酶都是单体蛋白，不同来源的漆酶其分子被不同程度的糖基化，平均分子量在 60-70kDa，碳水化合物含量在 10-20%，这有助于漆酶的高稳定性。
3、通常与酶通过共价键相连的碳水化合物包括甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖。氨基酸链含有包括 N-末端分泌肽在内大约含有 520-550 个氨基酸。1.2 生物学功能与工业应用漆酶生物学功能包括孢子抗病性，色素沉着，选择性的催化木质素降解，腐殖质脱毒过程等。漆酶具有广泛的底物专一性，因此广泛应用与生物技术中。在小分子介质存在的情况下，漆酶能显著增强其底物专一性。通过使用漆酶介体体系可能扩宽漆酶工业应用的范围。例如，漆酶和漆酶介体体系已经应用于纸浆造纸中的脱木质素和生物漂白，发电站废水处理，纺织和染印工业中纤维素酶学修饰和染料漂白，酶法交联木质素材料生产中密度纤维板等。在有机合成中，漆酶广泛用于官能团
4、的氧化，酚类和甾类化合物的耦合，碳-氮键的构建以及复杂天然产物的合成中。2 漆酶介体体系漆酶与小分子如 ABTS 和 HBT 的结合不仅会具有更强的催化氧化还原能力，而且会扩大漆酶对底物的作用范围，并能够氧化氧化还原势能比其更高的化合物。此外，1南京师范大学泰州学院青年项目（Q201242）资助小分子介质作为电子载体，能够氧化木质素，纤维素或淀粉等生物高分子。由于氧化还原介质的作用，克服了阻碍酶与多聚物间的直接影响的空间结构的影响。漆酶介体体系给生物技术和环境应用带来较高的效率。选择合适的介质在生物转化应用中是至关重要的。由于漆酶介体体系中底物通过不同的机制发生氧化，因此使用相同的前体时，不同
5、介质的选择可能导致不同的终产物。介体自由基根据化合物的结构和有效的氧化还原势能执行具体的氧化反应。尽管漆酶介体体系有较大的优势，但是以下两点阻碍了介质的使用:介体价格昂贵并会产生有毒的衍生物。在某些情况下，由于介质自由基的存在，漆酶在氧化介质时是不显示活性的。或者后者转化为无活性的化合物并失去充当介质的能力。因此寻找一种廉价高效、应用面广的介体将是 LMS 系统处理技术得以推广应用的关键。研究表明，一些真菌能自然合成天然的介体。例如苯酚，苯胺，4-对羟甲基苯甲酸，4-羟基苯甲基醇。最近，人们证明来自木质素降解过程中的酚类化合物（如乙酰丁香酮，丁香醛，香草醛，香草乙酮，阿魏酸，p-香豆酸）在染料
6、脱色，多环芳烃的去除，纸浆漂白和沥青的去除中是高效的漆酶天然介体。3 漆酶工程迄今为止，很少有报道关于活性漆酶的晶体结构。根据已报道的漆酶结构，过去十年研究对具有催化活性的铜离子周围一些残基进行定点突变，以确定催化活性参数和真菌漆酶势能。收集在 T1 铜原子中心发生结构混乱的突变体是这些结构功能综合研究的结果之一。在没有足够结构信息的情况下，分子定向进化能克服许多合理设计中的限制因素，并能显著增强有针对性的特征，例如耐高温和有机溶剂，提高催化活性及专一性等。Arnold 等首次成功定向漆酶进化，通过定向进化在毕赤酵母中完成了耐热性漆酶的功能性表达：经过 10 轮实验室进化和筛选，总体酶活提高了
7、 170 倍并具有更好的耐热性。大多数漆酶在有机合成中催化转化必须发生在有机溶剂中。漆酶在高浓度有机助溶剂中会失去活性。Adinarayana Kunamneni 等经过 5 轮定向进化在毕赤酵母中表达出一种耐热性漆酶，并能耐高浓度的有机助溶剂。这种进化的漆酶突变体能够抵抗大量与生物技术有关的浓度高达 50%的可溶性助溶剂。固有的电化学漆酶特性如 T1 位和T2/T3 位处的氧化还原势能，催化铜原子的几何和电子结构在体外进化过程中明显改变。通过形成更多的静电和氢键，一些突变体在蛋白质表面形成更加稳定的漆酶，此外，在转录翻译过程中，在加工区域突变体蛋白质折叠似乎被修饰。除了随机突变和 DNA 重
8、组外，利用通过饱和突变构建组合库和蛋白质结构的半经验研究也被成功运用。这一技术普遍运用在提高“ 热点” 残基处酶学特性。它还可用来同时突变一些密码子，使残基进行所有可能的组合，通过评估获得最佳的相互作用和协同效应。最近对毕赤酵母中表达的耐热性漆酶变体 T2 研究表明，将重组饱和突变体应用到L513 和 S510 残基，突变体比野生型菌株提高 3 倍利用率，包括一个有益突变（TCGS510GGGG） ，由于它取决于两个连续的核苷酸的改变，该突变体不能通过传统的易错 PCR 技术而获得。4 漆酶在有机合成中的应用有机合成化学药品成本较高，反应步骤繁琐且反应物毒性较大。漆酶由于其广泛的底物范围且能将
9、底物转化为不稳定的阳离子自由基并进一步进行非酶促反应，如聚合或水化，使得漆酶能应用于复杂聚合物和药物等的有机合成中。4.1 漆酶的酶促聚合反应和聚合功能漆酶或漆酶介体体系能直接产生聚合物使得通过漆酶酶促聚合反应引起广泛的关注。例如，运用漆酶的聚合能力，通过邻苯二酚单体合成聚合邻苯二酚。通过漆酶催化反应生产惰性酚类聚合物等。通过漆酶反应酶法制备聚合多酚由于无毒安全可以替代通常以甲醛为基础合成的化合物。研究表明，漆酶诱导一种新型的 4-羟甲基苯甲酸衍生物，3，5-二甲基-4-羟基苯甲酸和 3，5- 二甲氧基-4-羟基苯甲酸氧化聚合物。聚合作用参与单体中二氧化碳和氢气的消除，使得多酚氧化酶衍生物分子
10、量高达 1.8104。已经证实了一种新型的酶聚合反应体系，例如漆酶催化交联反应新的漆酚类似物来制备人造漆高分子薄膜。通过聚酚氧化酶和漆酶聚合得到的类黄酮素具有更好的抗氧化特性和酶抑制影响。漆酶能诱导丙烯酰胺彻底的聚合，用于化学酶法合成木质素接枝共聚物。研究发现漆酶具有使木质纤维素复合物交联并赋予功能的潜力，漆酶能够用于纤维素的酶法粘附来制备木质纤维素复合材料，如纤维板。值得注意的是，漆酶在合成物制备期间能活化纤维板木质素。使用漆酶也获得了具有良好的机械性能且无毒性的合成粘合剂的板。另一种可能性是漆酶使木质纤维板功能化以提高纤维素产品的化学或物理性能。研究显示，漆酶能够将各种酚酸衍生物转移到牛皮
11、纸浆纤维上，利用这种能力能将化学多功能化合物连接到纤维素表面，使得纤维素材料具有完全新型的特征，如疏水性或带电荷。漆酶-TEMPO 介体体系也被用来催化糖类衍生物甚至淀粉，支链淀粉和纤维素主要羟基的特定的氧化反应。最初用单糖或二糖（如苯基-D-吡喃型葡糖苷）来检测该体系的效率，相应的吡喃型葡糖苷醛酸基被分离并表征。该化学酶法已经被用来实现水溶性纤维素样品的部分氧化和用于糖基化皂角苷，积雪草苷和一些天然葡糖苷的轻度氧化。4.2 漆酶参与的有机化合物的氧化转化漆酶在合成药物产品中具有重要的作用。可以 4-甲基-3-羟基苯甲酸为原料通过漆酶催化反应合成有效的抗癌药物 actinocin，也可运用漆酶
12、氧化耦合长春质碱和文多林来生产治疗白血病的长春新碱。长春新碱在植物中含量减少，利用相对便宜且来源广泛的前体长春质碱和文多林来合成长春新碱是一种有效的方式。利用漆酶合成能使前体转化率达到 40%。漆酶耦合也能合成一些新型化合物并显示出一些优良的特性，例如：抗菌能力。由于抗肿瘤药物如丝裂霉素的大量使用或对新药物的研发，开发同时具有抗癌能力，抗过敏和 5-脂肪氧合酶抑制活性的氨基苯醌新的合成路线一直受到人们的关注。漆酶已经被用来合成新的环孢素衍生物。通过漆酶/HBT 介质体系催化氧化底物，将环孢素 A 转化为环孢素 A 甲基乙烯基酮。儿茶酸能清除体内自由基，在预防癌症，慢性或心脑血管疾病方面有较好的
13、的功效。经漆酶氧化后的儿茶酸，其氧化产物抗氧化能力显著提高。国际上利用漆酶与活性自由基介质耦合合成激素二聚体或寡聚体衍生物也有所报道。Intra 和 Nicotra 等人已经分别利用漆酶成功分离得到新的 -雌二醇激素和植物抗毒素白藜芦醇二聚体衍生物。在漆酶的作用下，桃柘酚，异丁香油酚或松柏醇能分别氧化生成新的二聚体衍生物，二聚体和四聚体衍生物混合物，当取代咪唑基被氧化时，能得到更加复杂的衍生物。这些新产品通常用于医药制造中。研究表明，漆酶催化芳香胺和脂肪胺 N-耦合的作用下能将天然化合物 3-（3，4-二羟基苯基）-丙酸成功衍生化。这种具有抗病毒功效的天然化合物 3-（3，4-二羟基苯基）-丙
14、酸衍生物在制药领域中越来越受到关注。最近，在氧气的存在下，利用漆酶催化 p-对苯二酚和芳香胺发生核胺化作用形成相应的单胺或二胺醌。5 结论漆酶在有机合成中的应用展示了光明的前景，是替代化学氧化的优良选择。相信在将来，真菌漆酶将在生物催化转化木质纤维素；木索硫酸盐修饰改造生产乳化剂，表面活性剂和粘附剂；抗生素合成；高氧化还原性能生物电池多聚物合成等方面发挥更大的作用。同时，通过蛋白质工程进一步开发利用真菌漆酶，探索环境友好型介质满足工业应用，进一步克服漆酶的异源表达等重大障碍，需要众多科研工作人员的不断努力。参考文献1、Baldrian P: Fungal laccases - occurren
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