1、镧系离子时间分辨荧光检测法在核酸分析技术中的应用游冬青 陈 杞 第二军医大学，上海， 200433)摘要本文综述了镧系离子时间分辨荧光技术在核酸分折领域中的应用概况，介绍了 DELFIA 系统、FIAgen 系统和 EALL 系统的使用特点，包括时间分辨荧光分析原理、镧系离子标记 DNA 探针和运用时间分辨荧光技术检测 PCR 产物的技术和方法镧系离子时间分辨荧光(TRF)分析技术是一种新颖的非放射性标记技术。该技术在核酸的定量定性分析中已得到广泛的应用。在检测的特异性、灵敏度、测量速度以及标记物的稳定性方面都显示出一定的优越性。目前国内外将时间分辨荧光法应用于核酸分析领域中主要包括两个方面，
2、是应用镧系离子标记的 DNA 探针技术进行杂交分析，二是将镧系离子标记技术引入 PCR 中，使 PCR 产物鉴定简便易行。本文简述该方法的应用及发展前景。1 时间分辨荧光分析法原理在时间分辨荧光分析中使用的示踪剂是镧系离子如铕离子(Eu 3+)、铽离子(Tb 3+)、镝离子(Dy 3+)。与传统的荧光标记物相比，镧系离子的标记物具有斯托克斯位移大、荧光寿 命长、发射波长较窄等特点，有利于降低本底和提高分析的灵敏度。目前应用于时间分辨荧光法的分析技术主要有三种类型(表 1)，即 DElFIA 系统（WALLAC 公司) 、 FIAgen 系统(Cy-ber Fluor 公司)和EALL 系统。D
3、ELFIA 系统的特点为形成 Eu3+ (NTA)3(TOPO)3 型的荧光复合物，其中 NTA 为 2萘酰三氟丙酮，TOPO 为三辛基氧化磷。Eu 3+螯合剂(聚羧酸型)标记的探针与靶 DNA 杂交后洗涤，低 pH 条件下,Eu 3+可释放出来与增强液中的 NTA 与 TOPO 结合形成最终的荧光复合物。在 DNA 分析中，该系统检测的灵敏度为 10-1810-16mol 量的 DNA 探针。FIAgen 系统所用的铕离子螯合剂为 47二氯磺基苯1，l0邻二氨杂菲2，9二羧酸(BCPDA)做标记物与 Eu3+螯合后团相测量，避免了外源性 Eu3+的污染。该系统应用在生物素探针与 BCPDA
4、标记的链亲和素(SA)结合方面可取得满意的检测结果。常见的标记 SA 所形成的复合物有三种，一为 BCPDA 直接标记 SA 形成复合物 SA(BCPDA)，检测灵敏度为 10-1010-11molL ；二为 SA 与标记有 160 个 BCPDA 的甲状腺球蛋白(TG)相连形成一个大分子的复合物 SATG(BCPDA) 160 检测灵敏度 10-1110-12mol/L；三为活化的 SATG(ECPDA) 160 复合物非共价连上两个BCPDATG 形成一个大分子复合构(SBMC)，检测灵敏度为 10-1210-18mol/L。EALI 系统为酶促放大镧系荧光系统，是以碱性磷酸酶为标记物，底
5、物为 5氟水杨酸磷酸酯(5FASP)，底物水解后所生成的 5FSA，在高PH 条件下可与 TbEDTA 形成高强度的荧光复合物，即可进行时间分辨荧光测定。应用时间分辨荧光法进行核酸杂交分析有两种不同的形式，一种为斑点印边杂交或在微孔条中进行杂交分析。样本核酸不必经过电泳，直接点样到滤膜或微孔中进行杂交。常用 DEFLIA 系统进行检测，引入杂交体系中的 Eu3+需释放出来，与加入的增强液形成荧光复合物方可进行检测。另一种类型为 Southern 印迹杂交与 Northern 印迹杂交，特异核酸 的分子大小可通过凝胶电泳分开形成不同的 DNA 或 RNA 条带，转移固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上与
6、 Eu 标记的核酸探针进行杂交分析。DELFIA 系统由于需加增强液检测，无 法定位电泳条带，不适于进行 Northern 印迹杂交与 Southern 印迹杂交分析。在 FIAgen 系统与 EALL 系统中，引入到杂交体系的 Eu3+螯合物即为荧光复合物，无需加增强液即可用时间分辨荧光扫描仪进行分析。在 Southern 和 Northern 印迹杂交技术中能准确定位并检测特异的 DNA 或 RNA 电泳条带。2 镧系离子标记核酸探针检测 DNA 杂交技术镧系离子标记核酸探针是八十年代末发展起来的新技术它克服了放射性核素标记的半衰期短、放射性危害等缺点越来越广泛地应用于核酸杂交分析，是迄今
7、最为理想的一种非放射性检测方法。现将几种镧系离子标记 DNA 探针及检测方法简述如下。21 免疫化学测定法Syvanen 应用 TRF 发展了一种斑点杂交(dot blot)技术。该法是用半抗原 AAIF(7碘N乙酸基N2乙酸氨茁)或 Sulfone(矾) 修饰 DNA探针，与固定在硝酸纤维素膜上靶 DNA 杂交，而后用二步免疫法检测，先加入抗半抗原抗体与半抗原结合，再加 Eu3+标记的第二 抗体 IgGDTPAEu3+进行检测。最小可测值为 20pgAd2 DNA，相当于 5105 个分子。22 生物素链亲和素BAS法Dehlen 将生物素链亲和素系统引入 TRF 中，简称 BASTRF 法
8、。用 PBSIA 缓冲液将变性的 Ad2DNA 稀释至适宜浓度，取 100ul 加至微孔条中室温过夜，洗二次，250uW/cm2、254nm 紫外灯下照射 5min。预杂文后，每孔加 入 100ul（100ngml ）通过缺口转移法制得的生物素在Ad2 DNA 探针杂交、洗涤，加 200ul2ugmlSA异硫氰酸苯基EDTAEu3+，室温培育,1h 后洗涤。每孔加入 200ul 增强溶液进行测量。线性范围为 10pg10ng，变异系数在 5以下，分析灵敏度为 10pg Ad2 DNA。Dahlen 等还发现以夹心杂交反应代替上述直接杂交方法可提高检测灵敏度。他们用 Eu3+SA 及夹心杂交法检
9、测大肠杆菌 DNA 灵敏度达 1.9pg。夹心杂交法需要两个相邻但不重叠的探针，个是固定吸附探针；另个是生物素标记检测探针。将吸附探针固定在微孔条中，与靶DNA 杂交后，再加入生物素化探针进行杂交。这样，经过二个步骤杂交反应形成吸附 DHA 探针-靶 DNA-生物素化 DNA 探针的夹心结构，再用Eu3+SA 检测。该法中，待测样品不必经过严格的纯化处理，检测方法快捷、简便、稳定和灵敏。2.3 Eu3+ 化学直接标记法 DNA 分子中的胞嘧啶碱基在 PH6 的亚硫酸钠溶液中可与乙二胺发生转氨基反应，使 DNA 分子掺入一个活化氨基基团可与 Eu3+螯合物共价结合形成 Eu3+DNA 荧光标记物
10、。Eu 3+螯合剂为一种异硫氰酸盐的衍生物4-2(4异硫氰酸基)乙基-2，6-双N，N双(羧甲基)氨乙基吡啶。Eu3+直接标记 DNA 的比率，与转氨基反应的程度有关。 DNA 在45时，转氨基反应 2h，Eu 3+标记率为 5的核苷酸；在 98时，转氨基反应 7min、Eu 3+。标记率可达 10%。Eu 3+直接标记核酸探针会干扰杂交时的碱基配对，导致杂交效率下降。但通过提高杂交体系中的探针浓度，仍可获得满意效果。此法可应用于夹心杂交分析及斑点杂交分析，可测范围为 10100pgDNA。24 酶放大时间分辩荧光法EALL将靶 DNA 固定到微孔条表面，各孔，加 100ul(125ng/L)
11、生物素化探针，杂交、洗涤、加入浓度为 5gL 的脱脂奶粉封闭再加浓度为500ugL 碱性磷酸酶(AP)标记的亲和素(AP-avidin) ，培育后洗涤去除游离的 AP，加入 5-氟水杨酸磷酸酶(5-FSAP)底物液，培育 2h，即脱去磷酸，生成 5-FSA，可与 Tb3+-EDTA 螯合物形成荧光复合物，即可用时间分辨荧光显相仪系统测量。最小检测值为 3pg。此法还可以用尼 龙膜做固相载体进行斑点杂交分析和 Southern 印迹杂交分析。2.5 Psoralen 介导的铕标记方法Oser 等用一种新的方法标记 DNA 探针，将一个质粒克隆的探针用限制性内切酶消化成部分单链，载体部分保持双链状
12、态。富含疏基基团的补脂骨素衍生物 psoralen 在紫外灯下可与呈双链的载体 DNA 共价结合，DTPA 通过多聚的 L 赖氨酸(pLL)与 psoralen 结合，最后形成复合物 Eu3+-DTPA-pLL-psora1en。这种用 psora1en 介导的 Eu 3+标记核酸探针方法，由于探针杂交区域未被修饰，杂交效率较高。杂交区域的 DNA 序列呈单链状态，无需在杂交前变性处理 DNA，还可阻止杂交反应中 DNA 探针的自身重组而导致的杂交效率下降。3 镧系离子标记的 PCR 技术近年来，时间分辨荧光分析技术与 PCR 技术相结合用于检测特异的靶 DNA 序列，该技术简称为 PCRTR
13、F31 嵌套式 PCRTRF 法嵌套式(nested) PCRTRF 法的原理是在扩增特定的靶 DNA 序列之前，先设计两对引物，其中一对为普通引物，另一对引物嵌套在两个普通引物之间，分别标记有 Eu 3+和生物素。DNA 扩增分两步进行，第一步称为PCRI，以普通引物扩增，第二步称为 PCRII，以 Eu 3+和生物素标记的一对引物对 PCRI 的产物进行扩增。二步 PCR 扩增产物收集在包被有SA 的微滴板中，进行时间分辨荧光检测。Dahlen 等按照比方法对 HIVI cos l011DNA 进行扩增，PCRI 反应为 25 个循环，PCRII；反应为10 个循环，可检测到 5 个拷贝的
14、靶 DNA、线性范围为 550 个拷贝。该方法可用来检测某些改变交了限制性内切酶酶切位点的碱基突变。例如，镰形细胞贫血病是由于 B-球蛋白基因的第 6 密码子中的碱基A突变为 T 而引起的遗传性疾病。这种点突变同时也改变了 D6e I 酶切位点，使突变的 DNA 不能被 Dde I 酶切，而正常人的 DNA 可按 Dde I 酶切。这样两步扩增后的 PCR 产物固定到微板孔中后加入 Dde I 酶进行酶切反应，洗涤后，TRF 检测，正常人仅得背景信号，杂合体的测量值为纯合体的一半。嵌套式 PCRTRF 法具有特异性强，灵敏度高的特点。这是由于PCRI 中非特异扩增的 DNA 片段在 PCRII
15、 中不可能得到进一步扩增，并且 PCRII 中仅扩增 10 个循环，即使有非特异性扩增，也是极微量的。PCR 与 TRF 两种超微量分析方法相结合，极大地提高了灵敏度。32 双标记 PCR 法该法主要用于基因缺失的疾病诊断。由于不同的镧系离子(Eu 3+，Tb 3+，Sm 3+)螯合物的荧光发射蜂的波长不同，可分别利用不同波长测量时间分辨荧光强度。在同一杂交反应中，应用两种不同镧系离子Eu 3+，Sm 3+标记 DNA 探针。该探针为等位基因特异的探针，可同时检测PCR 产物中两个不同的等位基因，称为双标记 TRFPCR 法，简称DLTRF-PCR(dual-1abel TRF-PCR)。Li
16、tio 等对囊性纤维病变的突变基因与正常基因进行 DLTRFPCR 分析。该病在一个 138bp 长的区域内缺失了 AF 508 位点。因此，他在缺失区域内设计了一个由 sM34 标记的等位基因特异探针，并用 Eu3f 标记正常等位基因特异的探针，在等位基因外设计一个生物素标记的共同探针。实验中首先将靶 DNA 按标准程序扩增后，再与上述三种探汁同时杂交。所有的 PCR 产物均可结合上生物素化探针，结合在包被有 SA 的微孔条中。在正常基因上杂交结合探针为 Eu 3+标记的，杂合子的基因上结合的探针为 Sm 3+标记、Eu 3+标记两种探针，纯合子的基因上仅结合上 Sm 3+标记的探针。分别用
17、 Eu 3+、Sm 3+不同的发射光谱测定各自的荧光计数，可筛查出囊性纤维病的杂合子与纯合子。33 TRFSPCR直接定量法Diamandis 介绍了一种在凝胶中直接对 PCR 产物进行定量的方法。该方法是在一个 PCR 引物的 5 端标记上 BCPDA。 PCR 扩增后，凝胶电泳分离 PCR 产物，然后将胶浸入到一种含有 Eu 3+的溶液中，在浸泡过程中Eu 3+可扩散到胶内，与 BCPDA 结合形成荧光复合物。用一种特别的时间分辨荧光扫描仪进行定量分析。该技术称为时间分辨荧光扫描(TRFS)PCR 技术，简称 TRFSPCR 直接定量法。34 其它的 PCRTRF 法LiLio(1992)
18、用 PCRTRF 法检测 HTLVI 和 HTLYII (human T lymoPhotropic viruresI and II)，他的方法是分别扩增两种病毒的基因组DNA，再与 Eu2?标记的寡核苷酸探针杂交，TRF 方法检测。Dahlen(1993)用与此类似的方法检测出。-抗胰蛋白缺乏症的 PIZ 基因。4 结束话DNA 探针杂交技术与 PCR 扩增技术对于基础医学研究以及临床各种传染病、遗传病、癌症等疾病诊断均是一项强有力的手段。用时间分辨荧光法检测镧系离子标记的核酸探针和 PCR 产物，集快速、简便、高灵敏度、安全为一体，并可进行自动化分析，是目前最理想的一种非同位素标记测定方法
19、。这项新技术已引起生物工作者的广泛重视。我国虽然起步较晚，但科技工作者已经逐步致力于推广时间分辨荧光技术在核酸分析领域中的应用。从前景来看，时间分辨荧光技术在生物领域中的应用将会越来越广泛。表 l 时间分辩荧光检测系统比较 DELPIA 系统 FrAcen 系统 EALL 系统 镧系离子 Eu 3+ Sm 3+ Eu 3+ Sm 3+ Tb 3+螯合剂 TDPA,EDTA,DTTA 等 BCPDA EDTA荧光复合物 Eu 3+ -NTA-TOPO SA-BCPDA- Eu 3+ 5PSA-EDTA- Tb 3+检测形式 液 相 固 相 液 相灵敏度 10pg DNA 10pg DNA 3pgDNA
