1、实验二 过氧化氢酶 Km值的测定课程名称:生物化学与分子生物学实验课 年级:2006 专业、层次:临床医学本科 授课教师:许成山职称:讲师 学时:3 学时基本教材:自编生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求:1、巩固酶促反应有关参数的知识,加深理解 Km 值的定义;2、学习 Hanes 作图法测定 Km 值的原理和方法;3、掌握滴定管的使用和滴定终点的判断。大体内容与时间安排:1、K m 值的定义及求 Km 值的作图方法(林 -贝氏作图法和 Hanes 作图法) 5min2、过氧化氢酶 Km 值测定的原理 5min3、过氧化氢酶 Km 值测定的注意事项 10min4、学生做实验 100mi
2、n教学方法:讲授式+启发式教学重点、难点:重点:1、Hanes 作图法求 Km 值2、过氧化氢酶 Km 值测定的原理3、滴定管的使用和滴定终点的判断难点:过氧化氢酶 Km 值测定的原理2一、K m 值的定义:(一)当酶促反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度即为 Km 值。(二)K m 值是酶促反应的特征性常数。二、实验原理(一)双倒数作图法(林贝氏作图法)以 1/S为横坐标,以 1/V 为纵坐标求 Km 值。(二)Hanes 作图法S/V 为横坐标,以S为纵坐标求 Km 值。(三)过氧化氢酶 Km 值测定的原理1、H 2O2 在过氧化氢酶的作用下分解生成了 H2O 和 O2;2H2O2 2
3、H2O+O2 化2、S=加入的 H2O2 的量;3、V=固定时间内反应掉的 H2O2 的量= 加入 H2O2 的量剩余 H2O2 的量;4、剩余 H2O2 的量可通过 KMnO4 滴定测出:2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO 4+K2SO4+5O2+8H2O三、实验操作l、血液稀释 吸取新鲜(或肝素抗凝)血液 0.1ml,用蒸馏水稀释至 10ml,混匀。取此稀释血液 1.0ml,用磷酸盐缓冲液(pH7.0,0.2mol/L)稀释至 10ml,得 1:1000 稀释血液。2、H 2O2 浓度的标定:取洁净锥形瓶两只,各加浓度约为 0.08mol/L 的 H2O2 2.0ml 和 2
4、5%H2SO4 2.0ml,分别用 0.004mol/L KMnO4 滴定至微红色。从滴定用去 KMnO4ml 数,求出 H2O2 的 mol 浓度。3、反应速度的测定:取干燥洁净 50ml 锥形瓶 5 只,编号,按下表操作。加入物(ml) 1 2 3 4 5H2O2(约 0.08mol/L) 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50蒸馏水 3.0 2.50 2.00 1.50 1.003室温摇匀,依次加入 1:1000 稀释血液每瓶 0.5ml,边加边摇,继续保温准5min,按顺序向各瓶加 25%H2SO4 2.0ml,边加边摇,使酶促反应立即终止。最后用 0.004mol/L KM
5、nO4 滴定各瓶至微红色,记录 KMnO4 消耗量(ml) 。四、计算1、 4mlOHmol OH(ol/L)OH222 数加 入浓 度浓 度反 应 瓶 中 4ol 2数(式中:4 为反应液量 4ml)2、反应速度的计算:以反应消耗的 H2O2 mmol 数表示。反应速度=加入的 H2O2 mmol 数剩余的 H2O2 mmol 数即:H 2O2 mol 浓度加入的毫升数KMnO 4 0.004 mol/L消耗的 KMnO4 毫升数 5/2(式中:5/2 为 KMnO4 与 H2O2 反应中 mol 换算系数)3、求 Km 值:下面引用一次实验结果为例,求过氧化氢酶的 Km 值,供计算参考。己
6、知 KMnO4 为 0.004mo1/L,标定出 H2O2 浓度为 0.08mol/L,列表计算如下:计算程序 1 2 3 4 5加人 H2O2 数 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50加人 H2O2mmol=0.08 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20底物浓度S= 4 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05酶作用后,KMnO 4 滴定 ml 1.35 3.70 6.40 9.80 13.20剩余 H2O2mmol=0.0045/2 0.0135 0.037 0.064 0.098 0.132反应速度 V=一 0.0265 0.043 0.056 0.062
7、 0.068S/V= 0.377 0.465 0.536 0.645 0.735按前述方法作图求得 Km 0.032mol/L。五、注意事项1、加入 1:1000 稀释血清 0.5ml/瓶后保温准 5 分钟;2、硫酸的浓度较大,小心不要溅出!43、作图应该用坐标纸,标明有关参数4、滴定操作(1)使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞;(2)滴定管使用前还要润洗(加 KMnO4 至刻度线 24ml 处) ;(3)使用时,不能左右推动活塞(要以环指顶住管壁,拇指、食指和中指控制流量;(4)加滴定液时,液面要稍高于 0,尔后排除尖端气体;(5)读数时,视线要与液面凹陷最低点平行。六、实验结果列表计算出有关数据,在坐标纸上作图求出 Km 值小 结1、K m 值是酶的特征性常数之一,只与酶的性质或结构有关,而与酶浓度无关,不同的酶有不同的 Km 值。2、K m 值越小,酶与底物的亲和力越大,反之则越小。