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类型实验一质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳.doc

  • 上传人:gnk289057
  • 文档编号:6187847
  • 上传时间:2019-04-01
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    实验一质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳.doc
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    1、1实验一、 质粒 DNA 的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能,同时熟悉DNA 琼脂糖凝胶电泳的基本原理与实验技能,进而了解质粒和核酸的基本性质以及琼脂糖凝胶电泳的特性。同时,掌握微量移液器、凝胶成像系统、紫外投射仪等实验仪器的使用方法。二、实验原理利用 SDS 使细胞膜裂解,同时在碱作用下细菌的线形染色体 DNA 变性,而质粒 DNA(共价闭合环状 DNA,cccDNA)的二条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体 DNA 片段难以复性,从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒 DNA 双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解

    2、状态存在于液相中,通过离心将可以将质粒 DNA 提取出来。DNA 制备膜可选择性地吸附 DNA,从而可快速地纯化质粒 DNA。琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。实验室中常规实验,一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行 DNA 电泳。DNA 在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与 DNA 分子大小、琼脂糖浓度、DNA 分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。DNA 的显色原理为溴化乙啶(EB)或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间,在紫外灯下发荧光。但需注意 EB 是一种强诱变剂!三、实验材料、仪器与试剂(一) 、实验材料含有

    3、质粒 pBS 的 DH5 菌株(二) 、实验仪器2微量移液器, 台式高速离心机,恒温振荡摇床, 高压蒸汽消毒器(灭菌锅),冰箱,琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统,紫外投射仪等。 (三) 、实验试剂与配制1、 小量质粒 DNA 提取试剂盒2、 LB 液体培养基: 蛋白胨(tryptone)10g, 酵母提取物(yeast extract)5g, NaCl 10g, 用 NaOH 调至 pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌 20 分钟。3、 LB 固体培养基:每升液体培养基加 12g 琼脂粉,高压下蒸汽灭菌 20 分钟。4、 氨苄青霉素(Amp)母液:配成 50mg/ml 水溶液,-20 下保存备用

    4、。5、 TE 缓冲液:10mol/L TrisCl (pH8.0), 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌 15 分钟, 储存于 4 冰箱。6、 琼脂糖7、 5TBE 缓冲液:Tris. 54g, 硼酸 27.5g, 加入 20ml 的 0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至 1000ml.8、 6上样缓冲液:0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。9、 溴化乙啶(EB)溶液母液:将 EB 配制成 10mg/L,用铝箔或黑纸包裹容器,储于温室即可。10、 DNA 电泳分子量标准(DNA marker): Lambda DNA/EcoRI+HindIII

    5、Marker 或其它 MARker。四、操作步骤(一) 、质粒 DNA 的提取纯化第一次使用时,将试剂盒携带的 RNaseAl 全部加入到 S1 溶液中,混合均匀,4保存。1. 细菌的培养和收集:将含有质粒 pBS 的 DH5 菌株接种在 LB 固体培养基(含 50g/ml Amp)中,37培养 12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基(含 50g/ml Amp)中,37培养约 12 小时至对数生长后期。32. 取 1.5ml 在 LB 培养基中培养过夜的菌液,12000rpm 离心 1min,弃尽上清; 3. 用 0.25ml 已加入 RNaseAl 的 S1

    6、溶液悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块;4. 加 0.25ml S2 溶液,温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min;5. 加入 0.5ml 4预冷的 S3 溶液,温和并充分地上下翻转混合均匀,直至形成紧实的凝集块,室温静置 2min。最高速度(12000rpm)离心 5 min;6. 吸取步骤 5 中的离心上清并转移到 DNA 制备管(置于 2ml 离心管中),3600rpm 离心 l min。如制备管中有液体残留,适当提高离心速度,再离心 1 min,弃滤液;7. 将制备管置回离心管,加 0.5ml Wl 溶液,3600rpm 离心

    7、 30s,弃滤液;8. 将制备管置回离心管,加 0.7ml W2 溶液,3600rpm 离心 30s;以同样的方法再用 0.7ml W 2 溶液洗涤一次。弃滤液;9. 将制备管移入离心管中,12000rpm 离心 1 min;10. 将制备管移入新的 1.5 ml 离心管中,在 DNA 制备膜正中央加 60l 水或洗脱液,室温静置 lmin。 12000rpm 离心 l min 洗脱 DNA。(二) 、质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳1. 稀释缓冲液的制备:用蒸馏水将 5TBE 缓冲液配制成 0.5TBE 稀释缓冲液.2. 1琼脂糖凝胶制备:称取 0.5g 琼脂糖,置于 200ml 三角烧瓶中,

    8、进入 50ml的 0.5TBE 稀释缓冲液,放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化,取出混匀。3. 胶板的制备:将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上,插上样品梳子。在冷却至 50-60的琼脂糖胶液中加入 EB 溶液至终浓度为 0.5g/ml, 即 10mg/ml的母液加 2.5ul,混匀。小心地倒入电泳槽中至一定高度。待胶液完全凝固后拔出梳子。然后向槽内加 0.5TBE 稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。4. 加样:取 2-5l 样品加 1l 的 6上样缓冲液,用移液枪混匀(在 Parafilm 膜上操作) ,小心加到样品槽中。同时加 DNA 分子量标准对照。45. 电泳:从负极到正极,60-80

    9、V, 电流 40mA 以上。 当溴酚兰条带移动至距凝胶前沿约 2cm 时,停止电泳。6. 观察和拍照:在波长为 254nm 的紫外灯下,观察 DNA 电泳带并估计其分子量大小。同时可用加红色滤光片和近摄镜片的相机拍照(光圈 5.6 下暴光 10-120 秒) 。五、问题与思考1. 质粒 DNA 提取纯化的原理乙醇纯化方法相比有什么优点?2. DNA 染色的原理3. 质粒 DNA 有几种构型?不同构型在琼脂糖凝4. DNA 在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与哪些因素有关?5. 在质粒 DNA 的提取过程中,加 S2 溶液后为什么要温和并充分地上下翻转,而不是剧烈混匀?6. DNA 制备管纯化 DNA 与常规的苯酚/氯仿/7. 胶电泳中的快慢如何?

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